新疾病模式生物斑馬魚(yú)G6PD酶活性的動(dòng)態(tài)研究*

宋　錦， 李　莉， 尚魯俊， 吳西軍， 周艷華 ， 何志旭***， 舒莉萍，4***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 干細(xì)胞與組織工程實(shí)驗(yàn)中心， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 兒科學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 貴州 貴陽(yáng)　550004)

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·專題研究·

新疾病模式生物斑馬魚(yú)G6PD酶活性的動(dòng)態(tài)研究*

宋錦1，2**， 李莉2，3， 尚魯俊1，2， 吳西軍2， 周艷華2， 何志旭2，3***， 舒莉萍1，2，4***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 干細(xì)胞與組織工程實(shí)驗(yàn)中心， 貴州 貴陽(yáng)550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 兒科學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 觀察不同發(fā)育時(shí)期的斑馬魚(yú)胚胎、成年斑馬魚(yú)不同組織的G6PD酶活性及g6pd mRNA的表達(dá)。方法: 收集受精后24 h(24 hpf)、48 hpf、受精后5 d(5 dpf)及15 dpf的野生型斑馬魚(yú)胚胎，同時(shí)收集成年斑馬魚(yú)的腦、肌肉、鰓、皮膚、眼睛及腸等組織，運(yùn)用改良G6PD定量比值法和RT-PCR法檢測(cè)上述胚胎或組織的G6PD酶活性及g6pd mRNA表達(dá)水平。結(jié)果: G6PD酶活性、g6pd mRNA表達(dá)水平在24 hpf、48 hpf、5 dpf及15 dpf比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在成年斑馬魚(yú)的腦、肌肉、鰓、皮膚、眼睛及腸等不同部位組織比較，差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論: 野生斑馬魚(yú)G6PD酶活性、g6pd mRNA表達(dá)水平不受胚胎發(fā)育時(shí)期和組織部位的影響。

[關(guān)鍵詞]斑馬魚(yú)； 胚胎； 葡萄糖6磷酸脫氫酶； 酶活性； mRNA

葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥屬于X染色體連鎖不完全顯性遺傳性疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)目前全球約有4億人受此病的困擾，中國(guó)是主要的發(fā)病國(guó)家之一[1]。在中國(guó)，G6PD缺乏癥的流行病學(xué)特點(diǎn)呈“南高北低”趨勢(shì)，主要分布在長(zhǎng)江以南地區(qū)，以廣東、廣西、貴州、四川、云南、海南等省為高[1-2]。G6PD缺乏癥是由于g6pd基因發(fā)生突變引起，且絕大多數(shù)為點(diǎn)突變[3]。早有文獻(xiàn)報(bào)道G6PD缺乏癥的小鼠疾病模型，但篩選出的G6PD缺乏純合子小鼠在胚胎期就會(huì)發(fā)生死亡，當(dāng)使用氧化劑對(duì)雜合子小鼠處理后其溶血現(xiàn)象不明顯，這對(duì)G6PD缺乏癥的后期研究有一定的局限性[4]。斑馬魚(yú)作為近年來(lái)新興的模式生物，具有養(yǎng)殖方便、產(chǎn)卵量大、胚胎透明、養(yǎng)殖周期較短以及與人類基因高度保守等優(yōu)勢(shì)[5]，推測(cè)若利用斑馬魚(yú)建立G6PD缺乏癥模型，將更有利于G6PD缺乏癥研究，但需了解斑馬魚(yú)G6PD酶活性情況及正常值范圍，以評(píng)估G6PD缺乏斑馬魚(yú)模型中G6PD情況。本研究在常規(guī)的改良G6PD定量比值法的基礎(chǔ)上，根據(jù)斑馬魚(yú)的特點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，嘗試建立一種斑馬魚(yú)G6PD酶活性的檢測(cè)方法，以期了解不同發(fā)育時(shí)期斑馬魚(yú)胚胎、成體斑馬魚(yú)不同組織中G6PD酶活性的含量，并用RT-PCR法了解g6pdmRNA表達(dá)情況，為進(jìn)一步利用斑馬魚(yú)研究G6PD缺乏癥奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所需Tuebingen品系野生型斑馬魚(yú)參照文獻(xiàn)[6]方法養(yǎng)殖在28 ℃循環(huán)水系統(tǒng)中。根據(jù)文獻(xiàn)[7]的斑馬魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育圖譜區(qū)分其發(fā)育階段，收集受精后24 h(24 hours post-fertilization，24 hpf)、48 hpf、受精后5天(5 days post-fertilization，5 dpf)、15 dpf的野生型斑馬魚(yú)。

1.2樣本制備

1.2.1斑馬魚(yú)胚胎樣品分別收集不同時(shí)相野生型斑馬魚(yú)20～40枚胚胎，剝除胚胎表面的胎膜，1×PBS中清洗3遍，冰上研磨胚胎，加入500 μL的0.25%胰酶，在37 ℃溫箱消化20～30 min，加入800 μL的胎牛血清終止消化，瞬時(shí)離心，留下250 μL的下層細(xì)胞液體，并將細(xì)胞液體轉(zhuǎn)移至Becton Dickinson falcon 40 μm (BD)尼龍濾網(wǎng)(冰上操作)，4 ℃，800 r/min，離心5 min后，棄上清。加入0.9×FBS/PBS 200 μL，將細(xì)胞懸液混勻，加入BD過(guò)濾膜過(guò)濾后，4 ℃，800 r/min，離心5 min，棄上清液。加入0.9×FBS/PBS 15 μL，制成單細(xì)胞懸液，再加入雙蒸水(ddH2O) 200 μL，制備細(xì)胞溶液。

1.2.2斑馬魚(yú)成魚(yú)樣本(1)全血樣品制備：取斑馬魚(yú)成魚(yú)1尾，禁食3 d后于尾部動(dòng)靜脈叢處切尾取血，吸取血液加入EDTA-K2抗凝劑的抗凝管中；收集抗凝全血15 μL，加入ddH2O 200 μL，制備溶血液。(2)不同組織樣品制備：在冰上解剖成年斑馬魚(yú)，取出腦、肌肉、鰓、皮膚、眼睛、腸，取出組織后1×PBS清洗3遍，分別置于無(wú)菌清潔載玻片剁碎(冰上操作)，用上述方法制成單細(xì)胞懸液，加入ddH2O 200 μL，制備成細(xì)胞溶液。

1.3斑馬魚(yú)g6pdcDNA

收集不同時(shí)相斑馬魚(yú)胚胎及斑馬魚(yú)各組織，用Trizol法提取斑馬魚(yú)總RNA，使用Thermo公司的TransScript First-Strand cDNA synthesis Supermix試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA(按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作)。

1.4改良G6PD比值法測(cè)定斑馬魚(yú)G6PD 酶活性

使用改良G6PD測(cè)定試劑盒(定量比值法，廣州米基醫(yī)療器械有限公司)測(cè)定G6PD酶活性，對(duì)試劑盒使用體系再次改良后進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)體系為：G6PD管， G6PD 6 μL、NBT 8 μL、PMS 4 μL、ddH2O 33 μL、溶血液 50 μL；6PGD 管，6PGD 6 μL、NBT 8 μL、PMS 4 μL、ddH2O 33 μL、溶血液50 μL。利用日本島津紫外分光光度儀UV-2401在650 nm條件下分別檢測(cè)G6PD管及6PGD管的吸光度(OD)值，計(jì)算G6PD/6PGD比值，判斷G6PD活性。

1.5g6pdmRNA表達(dá)水平

采用RT-PCR法半定量法，根據(jù)斑馬魚(yú)cDNA文庫(kù)中g(shù)6pd基因組序列，參照Pubmed-Nucleotide 中斑馬魚(yú)g6pd基因的CDS序列設(shè)計(jì)引物，并在引物前端加入酶切位點(diǎn)，用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，正向引物為5′- GGATCCATGATGGGCAGTCGAGCGAG-3′，反向引物為5′-GAATTC AGTGTCAAACACACCTAAGT-3′。以g6pdcDNA作為模板，使用高保真DNA聚合酶KOD plus進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃ 8 min，94 ℃ 40 s、66 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，目的條帶為1 527 bp，利用灰度軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，得出相應(yīng)的g6pd半定量值，對(duì)灰度分析值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)斑馬魚(yú)不同組織、不同時(shí)相胚胎的G6PD酶活性結(jié)果，g6pdmRNA表達(dá)水平電泳條帶灰度值采用EXCEL軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙錄核實(shí)，建立數(shù)據(jù)庫(kù)，用SPSS 19.0軟件對(duì)G6PD酶活性結(jié)果采用單因素方差分析。對(duì)斑馬魚(yú)各組織、不同時(shí)相胚胎g6pdmRNA表達(dá)水平電泳條帶灰度值采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1G6PD酶活性

對(duì)24 hpf、48 hpf、5 dpf、15 dpf 時(shí)相斑馬魚(yú)胚胎，成年斑馬魚(yú)腦、鰓、肌肉、皮膚、眼及腸組織(圖1)利用改良G6PD定量比值法對(duì)G6PD酶活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示不同發(fā)育時(shí)相斑馬魚(yú)胚胎，成年斑馬魚(yú)不同組織G6PD/6PGD比值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2，提示不同發(fā)育時(shí)相胚胎及不同組織中G6PD酶活性處于同一水平。

2.2g6pdmRNA表達(dá)水平

本研究對(duì)野生型不同時(shí)相斑馬魚(yú)胚胎及成年斑馬魚(yú)不同組織中g(shù)6pdmRNA進(jìn)行1%瓊脂糖電泳及灰度分析。結(jié)果顯示，不同時(shí)相斑馬魚(yú)胚胎(圖3),成年斑馬魚(yú)不同組織(見(jiàn)圖4)中的g6pdmRNA表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，進(jìn)一步證實(shí)，斑馬魚(yú)不同發(fā)育時(shí)期胚胎就成年斑馬魚(yú)不同組織中G6PD酶活性無(wú)明顯差異。

圖1　成年斑馬魚(yú)的不同組織Fig.1　The different tissues of adult zebrafish

圖2　不同時(shí)相斑馬魚(yú)胚胎及成年斑馬魚(yú)不同組織G6PD/6PDG比值Fig.2　G6PD/6PGD in different phases and tissues of zebrafish embryos

注：A中1為DNA MakerⅢ，2～5分別為24、48 hpf和5、15 dpf， 6為對(duì)照?qǐng)D3　斑馬魚(yú)不同發(fā)育時(shí)期胚胎中g(shù)6pd mRNA表達(dá)Fig.3　The expression of g6pd mRNA in different tissues of zebrafish

注：A中1為DNA MakerⅢ， 2為血， 3為腦， 4為皮膚，5為鰓， 6為腸，7為肌肉，8為眼，9為對(duì)照?qǐng)D4　成年斑馬魚(yú)不同組織中g(shù)6pd mRNA表達(dá)Fig.4　The expression of g6pd mRNA in different tissues of zebrafish

3討論

G6PD是參與紅細(xì)胞酵解磷酸戊糖氧化途徑的起始限速酶，能催化生成重要的還原性物質(zhì)還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)。NADPH是體內(nèi)許多合成代謝的供氫體，是重要抗氧化物質(zhì)還原型谷胱甘肽(GSH)維持還原狀態(tài)所必需的輔酶。還原型GSH可以保護(hù)細(xì)胞以及細(xì)胞膜免受氧化劑的損害[8]。當(dāng)機(jī)體G6PD酶活性缺乏時(shí)，機(jī)體還原型GSH抗氧化效果減弱，紅細(xì)胞膜無(wú)法抵抗氧化攻擊，受累紅細(xì)胞因此失去變形能力，容易在血流的沖擊及毛細(xì)血管的擠壓作用下發(fā)生破溶，進(jìn)而發(fā)生急性溶血[9]。已有的G6PD缺乏小鼠疾病模型中，由于G6PD缺乏純合子小鼠在胚胎期就發(fā)生死亡，且雜合子小鼠對(duì)氧化劑反應(yīng)差，致使對(duì)G6PD缺乏癥的研究存在一定的局限性[4]。此外，由于缺乏合適的動(dòng)物模型對(duì)抗瘧疾藥物進(jìn)行篩選，導(dǎo)致抗瘧疾藥的新藥開(kāi)發(fā)出現(xiàn)瓶頸[10]，因此對(duì)G6PD缺乏癥的研究仍有很多問(wèn)題亟待解決。

斑馬魚(yú)是近年來(lái)新興的模式生物，其作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有小鼠等其他模式生物所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，例如：體外受精，產(chǎn)卵量大，便于行高通量基因篩查及藥物篩選；其胚胎透明，便于觀察；成魚(yú)體型較小，生長(zhǎng)發(fā)育快，且易于飼養(yǎng)；斑馬魚(yú)基因與人類基因保守度約85%；斑馬魚(yú)在進(jìn)化過(guò)程中，雖和人類相距較遠(yuǎn)，但是造血發(fā)育是高度保守的[5，11-12]。目前為止已利用斑馬魚(yú)成功建立起多種造血系統(tǒng)疾病的模型[13-14]。由于斑馬魚(yú)體型小，本研究根據(jù)改良的G6PD定量比值法試劑盒說(shuō)明書(shū)將步驟及體系進(jìn)行優(yōu)化后，對(duì)野生型斑馬魚(yú)的不同組織，不同時(shí)相胚胎G6PD/6PGD進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)G6PD/6PGD比值反應(yīng)斑馬魚(yú)各個(gè)組織及不同時(shí)相的G6PD酶活性情況。本研究中，在選擇成年野生型斑馬魚(yú)的組織時(shí)，盡量將所有組織解剖后制備成細(xì)胞懸液，但是部分組織(比如心臟、脾臟、膽囊等)解剖后不易獲得或者體積過(guò)小難以獲得足夠的樣本，本研究挑選出腦、眼睛、皮膚、肌肉、腸、魚(yú)鰓六組組織作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。斑馬魚(yú)不同組織與血液G6PD/6PGD比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示斑馬魚(yú)組織和血液G6PD酶活性處于同一水平。由于斑馬體型小，血量小，在后期利用斑馬魚(yú)對(duì)G6PD缺乏癥進(jìn)行研究時(shí)，可利用斑馬魚(yú)組織的G6PD酶活性情況反映斑馬魚(yú)血液G6PD酶活性情況，可大大降低操作復(fù)雜性。同時(shí)為觀察G6PD酶活性是否隨斑馬魚(yú)發(fā)育變化而變化，本研究挑選24 hpf、48 hpf、5 dpf以及15 dpf 的胚胎作為對(duì)象，檢測(cè)結(jié)果提示不同時(shí)相斑馬魚(yú)胚胎G6PD/6PGD比值處于同一水平，考慮斑馬魚(yú)發(fā)育過(guò)程中G6PD酶活性波動(dòng)較小。另外，本研究還運(yùn)用RT-PCR半定量法對(duì)斑馬魚(yú)不同組織及不同時(shí)相胚胎中g(shù)6pdmRNA表達(dá)情況進(jìn)行半定量分析，觀察斑馬魚(yú)不同組織及不同時(shí)相胚胎g6pd基因mRNA表達(dá)情況與G6PD 酶活性檢測(cè)結(jié)果是否一致。對(duì)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行灰度分析后，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示斑馬魚(yú)各個(gè)組織及不同時(shí)相胚胎中g(shù)6pd的轉(zhuǎn)錄水平均值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與斑馬魚(yú)G6PD 酶活性檢測(cè)結(jié)果一致。

人類G6PD表達(dá)與斑馬魚(yú)相比有所不同，人類肌肉組織中G6PD表達(dá)極低，與血液中G6PD酶活性相差很大[15]。而經(jīng)本研究對(duì)斑馬魚(yú)不同組織及不同發(fā)育時(shí)相胚胎進(jìn)行G6PD酶活性及g6pdmRNA半定量分析，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)中不同組織及不同時(shí)相胚胎之間G6PD酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此推測(cè)，由于g6pd基因是一類管家基因，所以經(jīng)改良G6PD定量比值法檢測(cè)及RT-PCR半定量分析結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后提示其各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)出斑馬魚(yú)G6PD 酶活性的趨勢(shì)，以及不同組織及不同發(fā)育時(shí)期斑馬魚(yú)G6PD酶活性無(wú)明顯差異，為進(jìn)一步對(duì)利用斑馬魚(yú)建立G6PD缺乏斑馬魚(yú)模型及對(duì)G6PD缺乏癥進(jìn)行研究奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究建立檢測(cè)斑馬魚(yú)G6PD酶活性的技術(shù)，以及檢測(cè)出斑馬魚(yú)不同組織及不同時(shí)相斑馬魚(yú)胚胎G6PD酶活性的標(biāo)準(zhǔn)值。并通過(guò)RT-PCR法對(duì)不同組織及不同時(shí)相斑馬魚(yú)胚胎中g(shù)6pdmRNA進(jìn)行半定量分析，進(jìn)一步提示斑馬魚(yú)不同組織及不同時(shí)相斑馬魚(yú)胚胎中G6PD酶活性無(wú)明顯差異，為下一步構(gòu)建G6PD缺乏斑馬魚(yú)模型及研究G6PD缺乏癥奠定基礎(chǔ)。

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(2016-04-23收稿，2016-06-11修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(31360285)

[中圖分類號(hào)]R392.9

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)07-0750-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.002

Dynamic Research G6PD Enzyme Activity of New Disease Patterns Zebrafish

SONG Jin1,2, LI Li2,3, SHANG Lujun1,2, WU Xijun2, ZHOU Yanhua2, HE Zhixu1,2,3, SHU Liping1,2,4

(1.DepartmentofImmunology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.TheCenterofStemCellandTissueEngineeringResearch,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofPaediatrics,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.ExperimentalAnimalCenter,GuizhouMedicalUniversity,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe G6PD enzyme activity and G6PD mRNA expression in different tissues of zebrafish embryos and adult zebrafish at different developmental stages. Method: After fertilization, 24 hpf (24 hour post-fertilization), 48 hpf, 5 dpf (5 day post-fertilization) and 15dpf wild type zebrafish embryos were collected, and the brain, muscle, gill, skin, eyes and intestine of adult zebrafish were collected simultaneously. The modified G6PD quantitative ratio assay and RT-PCR were adopted to detect G6PD activity and mRNA expression levels in zebrafish embryos and tissues. Result: There was no statistically significant difference in G6PD activity and mRNA expression levels between 24 hpf, 48 hpf, 5 dpf and 15 dpf(P>0.05). There was also no statistically significant difference in G6PD activity and mRNA expression levels between brain, muscle, gill, skin, eyes and intestine(P>0.05).Conclusion: The G6PD activity and mRNA expression level of wild zebrafish is not affected by embryonic development period and tissue site.

[Key words]zebrafish; embryo； glucose-6-phosphate dehydrogenase; enzymatic activity; mRNA

**貴州醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)碩士研究生

***通信作者 E-mail:hzx@gmc.edu.cn； gyslp456@gmc.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-07-17網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.004.html