A549細胞凍存與復蘇方法的改進

季曉宇　鞠曉梅　湯　賀　姜　萌　羅來鵬　劉宇軒　侯毅鞠

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A549細胞凍存與復蘇方法的改進

季曉宇鞠曉梅湯賀姜萌羅來鵬劉宇軒侯毅鞠

吉林醫藥學院檢驗學院

季曉宇（1995-）女（漢族），河北省保定市人，在讀本科；通訊作者：侯毅鞠（1974-）女（漢族），吉林省吉林市人，副教授，碩士學位，主要從事血液腫瘤相關的研究工作。

行業曲線

起始于20世紀早期的細胞培養技術作為生命科學研究最基礎的環節，隨著分子生物學實驗技術的發展，在生物學研究領域得到了廣泛應用，如培養腫瘤細胞是研發抗腫瘤新藥的常規技術 。A549是1972年由Giard DJ通過肺癌組織移植培養建系的一種肺癌細胞。我們以A549細胞為例，研究細胞培養中最基本但又很關鍵的凍存與復蘇的方法和條件，使A549凍存復蘇后獲得最高生物學特性，推動后期實驗順利進行。

實驗所需材料與方法

實驗材料

A549肺癌細胞，RPMI-1640培養基（GIBCO公司），胎牛血清（四季青），DMSO（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），胰蛋白酶（北京鼎國生物技術有限公司），CO2培養箱，倒置顯微鏡，超凈工作臺。

實驗方法

A549細胞的培養及傳代

在溫度為37℃±1、CO2濃度為5%培養箱內，用胎牛血清為10%的RPMI-1640培養基進行培養，待細胞生長至80%～90%即可傳代培養：棄去培養液后加入適量胰酶，37℃消化1～2 min，見有細小白沙狀物順瓶底滑脫，顯微鏡下觀察到大部分細胞呈現圓形，細胞間隙增大后，立即加入完全培養液終止消化，收集細胞懸液，800 r·min-1，5min離心，去掉上清，加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養基以后吹打混勻，按照1∶2進行傳代培養。

不同濃度DMSO凍存A549細胞

常用的細胞凍存液為含10%二甲基亞砜、20%胎牛血清、70% RPMI-1640的培基。取生長狀態良好的A549細胞，待貼壁生長至80%～90%時，按前述方法消化細胞，待消化充分后，收集細胞懸液進行離心，將細胞分成密度相同的 4 組，凍存保護液DMSO終濃度依次為 5%、10%、15%、20%分裝于凍存管，冷凍保存。15天后取出，置于37℃水浴中輕輕晃動，迅速溶解，800 r·min-1，5min離心，去掉上清，加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養基以后吹打混勻，于溫度為37℃±1、CO2濃度為5%培養箱內進行培養。

A549細胞的復蘇

選擇凍存條件最優的細胞（10%DMSO濃度凍存的A549細胞），選用兩種不同方法來復蘇。第1組：凍存管立即放于37℃水浴，輕晃至融化后加入等量10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，800 r·min-1離心5min，棄去上清，加入培養基混勻后于37℃、5% CO2培養箱內進行培養。第2組采用改良復蘇方法：立即將凍存管置于42℃水浴快速融化，加入等量10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，800 r·min-1離心5min，棄去上清，加入培養基混勻后于37℃、5% CO2培養箱內進行培養。兩組均靜置12 h后，更換培養基繼續培養。

復蘇細胞形態學觀察

培養24h后行瑞士染色，光學顯微鏡下觀察細胞的形態及其生長狀況。

臺盼藍染色法判斷A549細胞存活率

細胞培養12h后用臺盼藍染液計數，每個標本計數 500個細胞，計數3次取平均值。在顯微鏡下觀察，死細胞被染成深藍色；活細胞邊緣光滑且胞體透明、染色很淡。計數3個不重疊視野的未藍染細胞數，計算細胞的平均存活率。

圖1

繪制細胞生長曲線

分別取復蘇后的細胞，調整濃度為6×106·mL-1接種培養。以h為橫坐標，以細胞濃度為縱坐標繪制出生長曲線，比較不同濃度二甲基亞砜凍存細胞，及不同復蘇方法的差異。

結果

A549細胞復蘇形態學觀察

倒置顯微鏡下：濃度為5%、10%、15%的DMSO凍存細胞復蘇后貼壁狀態較好，形態較凍存之前無明顯變化或有多角形；20%濃度DMSO細胞生長較慢，可為多角形。兩種復蘇方法比較，改良復蘇方法細胞形態較好。

臺盼藍拒染法判斷A549細胞的存活率

5%、10%、15%、20%、DMSO的凍存A549細胞的復蘇存活率分別為（87.60±1.26）%、（88.07±2.07）%、（87.17±1.31）%、（42.53±1.10）%；t=2.920，p＜0.05，分別組間比較5%、10%、15%二甲基亞砜組凍存A549 細胞復蘇率與 20%二甲基亞砜組， 差異顯著（t=1.49～78.32，P均 ＜ 0.05）。傳統復蘇方法與改良復蘇方法細胞存活率分別為（88.07±2.07）%、（90.67±1.48）%；t=2.920，p＜0.05。組間比較無顯著差異（t=2.69，p＞0.05）.

A549細胞的生長曲線

不同濃度DOMS凍存液（圖1a）

由圖可看出5%、10%、15%二甲基亞砜濃度凍存細胞較快達到對數生長期。20%濃度凍存細胞生長緩慢，對細胞損害較大。

不同復蘇方法（圖1b）

如圖可見兩種復蘇方法無顯著差異。

討論

細胞體外培養凍存復蘇以后的生長狀態會對許多生物學試驗的效果產生直接影響，而其凍存復蘇后的生長狀態則主要與凍存保護劑的種類、濃度和細胞凍存與復蘇的方法條件及培養基血清濃度等有關。細胞凍存在低溫環境下，其活力代謝與生化反應基本保持靜止狀態，故冷凍保存時間的長短對細胞影響較小或無明顯影響。所用凍存液種類、濃度及降溫的速率是凍存細胞取得良好效果的關鍵。

本研究選用不同DMSO濃度的凍存保護液凍存A549細胞。結果顯示 5%、10% 和 15%組DMSO保存效果最佳明顯優于20%組， 且10%組優于 5% 和 15%組，但無明顯差異；當 DMSO增至 20%濃度時，細胞的復蘇率下降明顯。細胞凍存時向培養基中加入保護劑——終濃度5%～15%的甘油或二甲基亞砜，可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結條件下，細胞內水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細胞損傷，故應用10%濃度的DMSO凍存A549細胞較好。

復蘇細胞原則為越快越好，在進行細胞復蘇時，傳統的方法是37℃水浴融化后離心培養，改良的復蘇方法是42℃水浴中溶解，37℃水浴至融化后離心培養。本實驗中改良后細胞生長情況與傳統復蘇方法無顯著差異。

細胞培養技術不僅僅是本試驗中所涉及到的幾點，還受諸如培養的溫度、濕度、CO2濃度等多個條件和因素的影響。若能協調好眾多的影響因素，盡可能降低細胞損傷，進一步改善細胞復蘇與凍存技術，保證細胞活力， 可以隨時提供生長狀態良好的細胞，以便更有效地促進A549細胞在藥物敏感性研究、肺癌發病機制、信號轉導機制及誘導分化、藥物治療誘導肺癌細胞凋亡及評價細胞毒試驗等方面的廣泛應用。

基金項目：吉林省教育廳科學技術研究項目（No.2012489；No.2012338）；2013年吉林省大學生創新創業訓練項目

DOI：10.3969/j.issn.1001- 8972.2016.13.027