解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對模型PC12細(xì)胞蛋白酶活化受體-1、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2表達(dá)的影響

鄧奕輝，李銀，譚琥，覃弘宇，李定祥

湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞生物學(xué)與分子技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208

解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對模型PC12細(xì)胞蛋白酶活化受體-1、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2表達(dá)的影響

鄧奕輝，李銀，譚琥，覃弘宇，李定祥

湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞生物學(xué)與分子技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208

目的比較解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對凝血酶合并缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷蛋白酶活化受體（PAR）-1、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2表達(dá)的差異。方法灌胃給藥制備大鼠藥物血清和藥物血漿。采用三氣培養(yǎng)箱和無糖DMEM培養(yǎng)液造成細(xì)胞缺氧模擬缺血，并同時加入150 U/mL凝血酶，建立體外缺氧合并凝血酶誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型。實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組、藥物血清組及藥物血漿組。實(shí)時熒光定量PCR檢測細(xì)胞PAR-1、ERK1/2 mRNA表達(dá)，免疫熒光法檢測細(xì)胞PAR-1、ERK1/2蛋白表達(dá)。結(jié)果與空白組比較，模型組PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）；與模型組比較，藥物血清組和藥物血漿組PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01）；藥物血漿組PAR-1、ERK 1/2表達(dá)較藥物血清組下降（P＜0.05）。結(jié)論解毒化瘀方藥物血漿抗缺氧合并凝血酶誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷作用優(yōu)于其藥物血清。

解毒化瘀方；藥物血漿；藥物血清；PC12細(xì)胞；大鼠

中藥血清藥理學(xué)是指將中藥或中藥復(fù)方經(jīng)口給動物灌服一定時間后采集動物血液、分離血清，用此含有藥物成分血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)［1］。然而，近年來不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方或單味藥藥物血清與血漿在成分和作用上存在差異，且在大多數(shù)情況下，中藥藥物血漿較藥物血清具有優(yōu)勢。

近年來，急性缺血性中風(fēng)的中醫(yī)病機(jī)理論取得重大突破，其中王永炎院士提出的“毒損腦絡(luò)”病機(jī)假說得到了廣泛的研究［2-6］。本課題組認(rèn)為，缺血性中風(fēng)主要病機(jī)瘀血阻滯、毒損腦絡(luò)的形成與凝血酶毒性相關(guān)，化瘀解毒法是該病的有效治法。解毒化瘀方為基于“瘀毒”理論的中藥復(fù)方，由黃連、黃芩、黃柏、梔子等8味中藥組成。而凝血酶正是通過與蛋白酶活化受體（protease-activated receptor，PAR）結(jié)合發(fā)揮對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，同時，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2系統(tǒng)在凝血酶誘導(dǎo)的腦耐受中發(fā)揮重要作用。故基于本課題組前期體外缺氧合并凝血酶誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型的建立，研究該方藥物血清與藥物血漿對上述模型PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表達(dá)的差異，為血漿藥理學(xué)方法的提出提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠32只，5周齡，體質(zhì)量180～200g，雌雄各半，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2013-0005。飼養(yǎng)于室溫18～20 ℃、濕度65%～70%環(huán)境，自由飲水飲食。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

PC12細(xì)胞，來源于大鼠的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，高分化、永生性，長沙贏潤生物技術(shù)有限公司，編號2015032007。

1.3 藥物及制備

解毒化瘀方（黃連9g，黃芩6g，黃柏6g，梔子9g，紅花9g，川芎12g，赤芍12g，地龍9g）飲片購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房。第1次加4倍量蒸餾水，煎煮1 h，濾出煎液，第2次加2倍量蒸餾水，煎煮30 min，合并2次煎液，過濾濃縮至2g/mL原藥材藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基，美國HyClone公司；胰蛋白酶，Sango公司；鏈霉素青霉素混合溶液（100 U/mL青霉素、100g/L鏈霉素）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2），GIBICO公司；胎牛血清，美國HyClone公司。凝血酶，中國Solarbio試劑公司；Trizol，Invitrogen公司；SYBR Green PCR試劑盒，Thermo公司，批號#K0223；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，F(xiàn)ermentas公司，批號#K1622；一抗-蛋白酶活化受體（PAR-1），sc-13503，Santa Cruz公司；二抗-TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，CW 0152，康為世紀(jì)公司；一抗-p44/42MAPK（ERK1/2），#9102，Santa Cruz公司；二抗-TRITC標(biāo)記山羊抗兔 IgG，CW 0160，康為世紀(jì)公司。普通CO2培養(yǎng)箱（德國賀利氏，Heracell），三氣培養(yǎng)箱（Thermo，3131），Real-time檢測儀（ABI公司，ABI-7300），低溫冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，TG-16M），電動勻漿機(jī)（FLUKO，PRO200），旋渦振蕩器（青浦瀘西儀器廠，K30），激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯，CSC6F24407）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物血清與藥物血漿制備

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為空白血漿組、空白血清組、藥物血漿組、藥物血清組，每組8只，藥物血漿組和藥物血清組每日給予解毒化瘀方煎液36.4g/kg灌胃（按動物體表面積劑量換算，相當(dāng)于5倍臨床等效劑量），空白血漿組和空白血清組予等量蒸餾水灌胃。藥液濃度為2g/mL，每只給藥體積按36.4g/kg換算，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥前禁食12 h，末次給藥后1 h，腹腔注射10%水合氯醛（1mL/250g）麻醉，無菌條件下腹主動脈采血。血清組所采血液置于普通采血管，37 ℃水浴30 min，置于4 ℃冰箱過夜，凝固后3000 r/min離心15 min，取上清液為血清。血漿組所采血液置于抗凝管內(nèi)（所含抗凝劑為1.5%EDTA-Na2，血液∶抗凝劑=9∶1），輕顛3次，使抗凝劑與血液充分混合，3000 r/min離心15 min，取上清液為血漿。將制備好的血清與血漿過濾除菌后分裝，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PC12細(xì)胞培養(yǎng)及缺氧缺血損傷模型的建立

PC12細(xì)胞用10%胎牛血清，1%100 U/mL青霉素、100g/L鏈霉素混合溶液，90%DMEM高糖培養(yǎng)基配成的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中，2 d換液1次，待細(xì)胞成長融合后傳代培養(yǎng)。細(xì)胞以1×105個/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.18mL，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞完全貼壁后再加終濃度為50 μg/L神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)分化72 h［7］棄原培養(yǎng)液，加入含150 U/mL凝血酶的無血清低糖培養(yǎng)基，置于三氣培養(yǎng)箱中（5%CO2、1%O2、94%N2）培養(yǎng)模擬缺氧缺血過程，12 h后取出。

2.3 分組

取誘導(dǎo)分化72 h后、融合80%以上PC12細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為空白組、模型組、藥物血漿組和藥物血清組。模型組、藥物血漿組和藥物血清組均需加入含150 UU/mL凝血酶的無血清低糖培養(yǎng)基，置于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，空白組加入完全培養(yǎng)液普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)。12 h后，棄原培養(yǎng)液，模型組、藥物血漿組和藥物血清組分別加入完全培養(yǎng)液、含10%藥物血漿完全培養(yǎng)液、含10%藥物血清完全培養(yǎng)液，空白組則加入等量完全培養(yǎng)液，均置于普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后備檢。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 實(shí)時熒光定量PCR檢測細(xì)胞蛋白酶活化受體-1、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 mRNA表達(dá) 引物合成：引物設(shè)計(jì)合成純化均由Invitroggen Biotechnnology Co.，LTD中國公司完成，所用引物見表 1。細(xì)胞總RNA的提取：按照試劑盒說明提取細(xì)胞RNA，紫外分光度計(jì)測定RNA純度，并進(jìn)行RNA定量。PCR條件：95 ℃℃預(yù)變性10m in，95 ℃變性15 s，60 ℃復(fù)性45 s，60 ℃延伸1 min，40個個循環(huán)。PCR產(chǎn)物分析：取 PPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠中電電泳，紫外燈下觀察條帶，數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件ABBI Prism 7300 SDS Software分析。各標(biāo)本重復(fù)3次，取其平均值。

表1 PCR引物序列

2.4.2 免疫熒光法檢測細(xì)胞蛋白酶活化受體--1、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1/22蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基后PBS洗3次次×10 min，加4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次×10 min，加加0.5%Triton穿孔10 min，PBBS洗3次×10 min，加5%胎牛血清封閉30 min，加一抗（1∶2000封閉液稀釋），4 ℃過夜，PBS洗3次×100 min，加TTRITC標(biāo)記的抗小鼠熒光二抗（1∶50封閉閉液稀釋），室溫避光30 min，PBS洗3次× 10 min，加HHoechst332588（1∶200）核染10 min，PBS洗3次×100 min后，加甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察，以平均熒光強(qiáng)度值反映蛋蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以

4 結(jié)果

4.1 解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對模型大鼠蛋白酶活化受體-1、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1/2 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組 PAR-1、ERK1、ERK2 mRRNA表達(dá)增增強(qiáng)（P＜0.011）；與模型組比較，藥物血清組和藥物血漿組PAR-1、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)下降（P＜00.05，P＜0.001）；藥物血漿組 PAR-1、ERRK1、ERK2mRNA表達(dá)較藥物血清組下降（P＜0.005）。結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞PAR-1、ERK1、ERK2 mRNA表表達(dá)比較（±s）

表2 各組細(xì)胞PAR-1、ERK1、ERK2 mRNA表表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與藥物血清組比較，#P＜0.05（下同）

組別 n組PAR-1ERK1ERK2空白組 3 0.003 8±0.000 5 0.008 8±0.000 50.026 0±0.004 6模型藥物藥物組 3 0.05血清組 3 0.02血漿組 3 0.01 3 6±0.008 6▲▲0 7 4±0.003 4**0 4 6±0.004 8**#0 .060 8±0.007 8▲.049 8±0.007 0*.029 7±0.001 9**▲0.174 7±0.025 0.104 2±0.016#0.067 7±0.012 0▲▲5*4**#

4.2 解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對模型大鼠蛋白酶活化受體-1、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2蛋白表達(dá)的的影響

與空白組比較，模型組PAR-1、ERK1/2蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.011）；與模型組比較，藥物血清組和藥物血漿組PAR-1、、ERK1/2蛋白表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.001）；其中，藥藥物血漿組PAR-1、ERK1/2蛋白表達(dá)較藥藥物血清組下降（P＜0.05）。結(jié)果見表3、圖1、圖2。

表3 各組細(xì)胞PAAR-1、ERK1/2蛋白表達(dá)比較（±s，平均熒光強(qiáng)度）

表3 各組細(xì)胞PAAR-1、ERK1/2蛋白表達(dá)比較（±s，平均熒光強(qiáng)度）

組別 n PAR1ERK1/2空白組 33.753 2±0.445 86.950 0±1.684 0模藥藥型組 3物血清組 3物血漿組 3 15.818 7±0 8.761 7±1 6.729 0±0 .350 7▲▲ 2 .348 6** 1 .530 5**# 1 0.696 7±1.808 6 4.900 0±0.975 4 1.395 0±1.231 1▲▲* **#

圖1 PAR-1蛋白表達(dá)熒光圖（×600）

圖22 ERK1/2蛋白表達(dá)熒光圖（×600）

5 討論

中藥血清藥理學(xué)不僅具有體外實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，如條件可控性強(qiáng)，可以進(jìn)行大量的藥理效應(yīng)實(shí)驗(yàn)觀察，較整體動物容易控制，并可在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平進(jìn)行超微、生化、受體、基因等方面的研究，揭示藥物作用機(jī)理較為深入，重復(fù)性好，使用材料少等，而且避免了中藥粗制劑直接進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的缺陷，更加接近中藥經(jīng)消化吸收后在體內(nèi)產(chǎn)生的作用。然而，經(jīng)消化道吸收的中藥有效成分在體內(nèi)進(jìn)入的是血漿，而非血清。不同于血漿，血清是血液凝固后除去纖維蛋白與血細(xì)胞的液體成分，血液凝固過程及其激發(fā)的一系列生物學(xué)反應(yīng)不僅明顯改變了血液成分，而且對中藥成分與其派生物質(zhì)可能產(chǎn)生影響。2003年，有學(xué)者查閱我國大量發(fā)表的有關(guān)“血清藥理學(xué)”的論著，發(fā)現(xiàn)絕大部分其實(shí)是“血漿藥理學(xué)”，只有少部分是真正的血清藥理學(xué)［8］；同時也有學(xué)者從血液生理的角度通過實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為，某些情況下血漿藥理學(xué)方法能更好地再現(xiàn)體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生的藥理效應(yīng)［9］。因此，賀氏等［10］提出了“血漿藥理學(xué)方法”。

近年來，凝血酶在急性缺血性中風(fēng)發(fā)生發(fā)展中的作用受到了學(xué)術(shù)界的重視，凝血酶不僅是血液凝固、血栓形成的關(guān)鍵水解酶，而且也通過與 PAR結(jié)合發(fā)揮對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。因此，以凝血酶為靶點(diǎn)來研究急性缺血性中風(fēng)具有重要價值。PAR介導(dǎo)的凝血酶反應(yīng)在腦損傷中具有雙重作用，凝血酶在低濃度時誘導(dǎo)腦耐受性，而在高濃度時對腦細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)而加重對腦組織的損害，以上過程是通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)的。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPKs）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲/蘇氨蛋白激酶，可將胞外刺激信號傳遞給胞核，導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激和損傷反應(yīng)。ERK是MAPK家族的一員，屬絲/蘇氨酸蛋白激酶，正常定位于胞漿，當(dāng)激活后轉(zhuǎn)位至胞核，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)。ERK家族有 5個亞族，包括ERK1～ERK5，其中ERK1/2系統(tǒng)在凝血酶誘導(dǎo)的腦耐受中發(fā)揮重要作用。ERK1/2磷酸化可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活，但持續(xù)的磷酸化能導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。

本研究采用實(shí)時熒光定量PCR及免疫熒光法檢測解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對凝血酶合并缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥物血漿抗凝血酶合并缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷作用強(qiáng)于藥物血清。這可能是因?yàn)檠和ㄟ^凝血形成血清的過程中，激活了許多酶類物質(zhì)以及血小板和白細(xì)胞，這些活性物質(zhì)可能會產(chǎn)生能降解中藥有效成分的作用。同時，凝血過程中形成的纖維蛋白及其網(wǎng)絡(luò)的血細(xì)胞很可能會吸附或結(jié)合一些中藥有效成分，從而減少中藥有效成分，造成效應(yīng)減弱。因此，對于使用藥物血漿和藥物血清均可的實(shí)驗(yàn)，藥物血漿能更真實(shí)地反映藥物療效。

［1］ IWAMA H， AMAGAYA S， OGIHARA Y. Ef fect of Shosaikoto， a Japanese and Chinese Traditional Herbal Medicinal mixture，on the mitogenic activity of lipopolysaccharide：a new pharmacological testing method［J］. Journal of Ethnopharmacology，1986，21（1）：45-53.

［2］ 李澎濤，王永炎，黃啟福.“毒損腦絡(luò)”病機(jī)假說的形成及其理論與實(shí)踐意義［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（1）：1-6.

［3］ 魏江磊.中風(fēng)熱毒論［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（1）：7-8.

［4］ 鄭春葉，盧明，黃燕.中風(fēng)從毒論治淺議［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14（8）：5-6.

［5］ 常富業(yè)，張?jiān)蕩X，王永炎.毒的臨床表征與中風(fēng)病毒損腦絡(luò)探析［J］.江蘇中醫(yī)藥，2009，41（4）：13-14.

［6］ 劉愛華，魏江磊，李昊.中風(fēng)熱毒論研究思路探討［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（3）：741-742

［7］ BO C， BETH F， MICHAEL A W， et al. Thrombin activity associated with neuronal damage during acute focal ischemia［J］. J Neuroscience，2012，32（22）：7622-7631.

［8］ 羅煥敏.“血清藥理學(xué)”與“血漿藥理學(xué)”［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2003，19（9）：1075-1076.

［9］ WANG D S， CHEN F P， HE S L， et al. Comparison of plasma and serum pharmacologic methods in evaluating the ef fect of Dahuang Zhechong Capsule on platelet aggregation［J］. Chin J Thromb Hemost，2005，l l（1）：5-8.

［10］ 賀石林，葛金文，賀蓉，等.質(zhì)疑血清藥理學(xué)，加強(qiáng)多層次半體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2005，21（3）：277-279.

Effects of Jiedu Huayu Prescription Containing Serum and Plasma on PAR-1 and ERK 1/2 of PC12 Cell Model

DENG Yi-hui， LI Yin， TAN Hu， QIN Hong-yu， LI Ding-xiang
（Key Laboratory of Hunan Province for Prevention and Treatment of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Cardio-cerebral Diseases， Key Laboratory of Hunan Universities for Cell Biology and Molecular Techniques， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

ObjectiveTo compare the differences betweenJiedu HuayuPrescription containing serum and plasma on PAR-1， ERK1/2 expression of the PC12 cell injury model.MethodsRat serum containing and plasma models was prepared through gavage. Three gas incubators and sugar-free DMEM medium simulated ischemia caused by hypoxia were used， and 150 U/mL of thrombin was added， with a purpose to establish the thrombin-induced hypoxic PC12 cell injury model. The experiment was divided as control group， model group， serum containing group and plasma containing group. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression levels of PAR-1 and ERK1/2 mRNA in each group； immunofluorescence was used to detect the protein expressions of PAR-1 and ERK1/2.ResultsCompared with the control group， the expressions of PAR-1 and ERK1/2 mRNA and protein in model group were enhanced （P＜0.05）； compared with the model group， the expressions of PAR-1 and ERK1/2 mRNA and protein in serum containing group and plasma containing group decreased （P＜0.05，P＜0.01）； the expressions of PAR-1 and ERK1/2 mRNA and protein in plasma containing group decreased more significantly than serum containing group（P＜0.05）.ConclusionJiedu HuayuPrescription containing plasma was superior to its containing serum against the injury of PC12 cell induced by hypoxic and thrombin.

Jiedu HuayuPrescription； plasma containing medicine； serum containing medicine； PC12 cells； rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.019

R285.5

A

1005-5304（2016）06-0073-04

2015-10-24）

（

2015-11-17；編輯：華強(qiáng)）

國家自然科學(xué)基金（81373508）；湖南省自然科學(xué)基金（13JJ6061、14JJ2113）；湖南省中醫(yī)藥科研基金資助項(xiàng)目（201319）；湖南省教育廳資助項(xiàng)目（12A105）；湖南省重點(diǎn)學(xué)科中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)資助項(xiàng)目（2011-2015）；湖南省自然科學(xué)創(chuàng)新群體基金（2012年）；湖南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2012年）

李定祥，E-mai l：ldxlzy@hotmail.com