大黃素對人肝癌HepG 2細胞遷移侵襲能力及E-鈣黏蛋白、Slug蛋白表達的影響

高俊霞，呂強

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.穆棱市八面通林業(yè)局職工醫(yī)院，黑龍江 穆棱 157500

大黃素對人肝癌HepG 2細胞遷移侵襲能力及E-鈣黏蛋白、Slug蛋白表達的影響

高俊霞1，呂強2

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.穆棱市八面通林業(yè)局職工醫(yī)院，黑龍江 穆棱 157500

目的觀察大黃素對人肝癌HepG2細胞遷移侵襲能力及E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、Slug蛋白表達的影響，探討其相關(guān)作用機制。方法體外培養(yǎng)HepG2細胞，大黃素低、高劑量組分別加入10、20 μmol/L大黃素，陰性對照組加入等體積RPM I-1640培養(yǎng)液，陽性對照組加入10 μmol/L 5-氟尿嘧啶。分別采用細胞-基質(zhì)黏附實驗、劃痕修復(fù)實驗、Transwell小室體外侵襲實驗觀察HepG2細胞黏附率、遷移、侵襲能力；Western blot檢測E-cadherin和Slug蛋白表達。結(jié)果與陰性對照組比較，大黃素低、高劑量組顯著抑制HepG2細胞黏附率、遷移、侵襲能力，E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，Slug蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈濃度依賴性。結(jié)論大黃素能明顯抑制HepG2細胞遷移和侵襲能力，其機制可能與增強E-cadherin及抑制Slug蛋白表達有關(guān)。

大黃素；肝細胞癌；遷移；侵襲；E-鈣黏蛋白；Slug蛋白

1 實驗材料

1.1 細胞

人肝癌 HepG2細胞，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院消化內(nèi)科惠贈。

1.2 藥物及制備

大黃素購自中國食品藥品檢定研究院，批號140675-201410。1 mg大黃素溶于200 μL 0.1%二甲基亞砜（DMSO）溶液，溶解后依次加入7.4mL滅菌三蒸水、50 μL 5 mol/L NaOH溶液，過濾后溶液作為母液，濃度為500 μmol/L，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用時以滅菌三蒸水稀釋至所需濃度。

1.3 主要試劑及儀器

5-氟尿嘧啶（5-Fu），上海海普藥廠，批號150073；DMSO，徐州試劑二廠，批號150217；牛血清白蛋白（BSA），PAA公司，批號715396；Matrigel基質(zhì)膠和RPM I-1640培養(yǎng)液，美國HyClone公司；E-cadherin、Slug多克隆抗體，美國ProMab公司；辣根過氧化物酶標記抗鼠IgG二抗，美國Santa Cruz公司；Trizol試劑盒，美國 Invitrogen公司。CO2培養(yǎng)箱（MCO-20AIC），日本 SANYO；紫外可見分光度計（Libra S22），英國Biochrom；移液槍（Thermo F2），美國Thermo；倒置顯微鏡（CKX41），日本Olympus；熒光顯微鏡（IX51），日本Olympus。

1.4 細胞培養(yǎng)

HepG2細胞培養(yǎng)于含有10%BSA和5%青-鏈霉素雙抗的RPM I-1640培養(yǎng)液中。置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d更換培養(yǎng)液，當HepG2細胞達 80%匯合度時，用 0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化。37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)48 h。收集懸浮細胞經(jīng)EDTA處理制備成單細胞懸液，然后用RPM I-1640培養(yǎng)液洗滌細胞。收集對數(shù)生長期細胞，用于后續(xù)實驗。

2 實驗方法

2.1 細胞-基質(zhì)黏附實驗

參照文獻［8］及預(yù)實驗結(jié)果，低劑量組加10 μmol/L大黃素50 μL，高劑量組加20 μmol/L大黃素50 μL，陽性對照組加10 μmol/L 5-Fu 50 μL，陰性對照組加50 μL RPM I-1640培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)24 h。調(diào)整細胞密度1×105個細胞/mL，接種于涂有 10 μg/mL Ⅳ型膠原 500 μL的 24孔板中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)30 min。PBS洗滌去除未結(jié)合的懸液細胞，乙醇固定貼壁細胞。0.1%結(jié)晶紫染色，0.2%Triton X-100固定，于波長550 nm處紫外分光度法測定吸光度（A）值，計算細胞黏附率。細胞黏附率（%）=實驗組細胞A值÷陰性對照組細胞A值×100%

2.2 劃痕修復(fù)實驗

HepG2細胞按照細胞密度1×105個/孔接種于6孔板中，待細胞單層生長鋪滿板底時，用移液槍頭沿培養(yǎng)板底部劃“一”字型劃痕。各組給藥同“2.1”項。37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)24 h。鏡下檢測細胞向致傷區(qū)遷移的相對距離并拍照，計算細胞遷移率。細胞遷移率（%）=實驗組細胞遷移面積÷陰性對照組細胞遷移面積×100%。實驗重復(fù) 3次，取其平均值。

2.3 Transwel l小室體外侵襲實驗

Transwell小室用前鋪上50 μL 0.5%Matrigel膜基質(zhì)37 ℃孵育過夜。HepG2細胞各組給藥同“2.1”項。調(diào)整細胞密度1×105個/mL，分別取200 μL接種于Transwell小室內(nèi)室，并在Transwell小室下室加入含有10%BSA的RPM I-1640培養(yǎng)液。孵育24 h后，取出Transwell小室，去除未穿膜細胞。甲醇固定15 min。OlympusIX51熒光顯微鏡計數(shù)穿過微孔膜的細胞數(shù)。每組細胞隨機選取 10個視野計數(shù)，取其平均值。實驗重復(fù)3次。

2.4 Western blot檢測E-鈣黏蛋白和Slug蛋白表達

HepG2細胞各組給藥同“2.1”項。37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)24 h。按細胞總蛋白抽提試劑盒說明書提取細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白質(zhì)含量。取50 μg蛋白質(zhì)進行10%～12%SDS-PAGE凝膠電泳。電泳后，濕法電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用含1%脫脂奶粉TBS和0.1%TBST封閉超過2 h，TBST洗膜3次，每次3 min，加E-cadherin或Slug多克隆抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次3 min。加辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2000），常溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次3 min。β-actin作為內(nèi)參照。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，通過富士生物圖像處理軟件進行目的條帶的表達檢測及分析。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad5.0軟件進行描述性統(tǒng)計。實驗數(shù)據(jù)以

±s表示，正態(tài)分布資料組間比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)比較采用方差分析。P＜0.005表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 大黃素對HepG2細胞黏附能力的影響

與陰性對照組比較，大黃素低、高劑量組對HeepG2細胞黏附率具有明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），并呈濃度依賴性，見圖1。

圖1 各組細胞--基質(zhì)黏附率比較

4.2 大黃素對HepG2細胞遷移能力的影響

與陰性對照組比較，大黃素低、高劑量組對HeepG2細胞遷移具有明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），并呈濃度依賴性，見圖22。

圖22 各組細胞遷移能力比較（×1000）

4.3 大黃素對HepG2細胞體外侵襲能力的影響

與陰性對照組比較，大黃素低、高劑量組對Hepp G2細胞侵襲能力具有明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜00.01），并呈濃度依賴性，見圖3。

圖3 各組細胞TTranswell小室體外侵襲能力比較（×100）

4.4 大黃素對HHeepG2細胞E--鈣黏蛋白、SS lug蛋白表達的影響

與陰性對照組比較，大黃素低、高劑量組HepG22細胞E-cadherin蛋白表達明顯升高（P＜0.01），Slugg蛋白表達明顯降低（P＜0.01），并呈濃度依賴性，見圖4。

圖4 各組細胞E-cadherin和Slug蛋白表達比較

5 討論

HCC高死亡率的主要因素之一是遷移和侵襲特別迅速，而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變（epithelial-to-mesenchymal transitions，EMT）是增強癌細胞的原位侵襲和遠處遷移以及抑制癌細胞凋亡的一個關(guān)鍵因素。

EMT最主要的標志性變化是 E-cadherin表達的減少或丟失。E-cadherin是一類主要介導(dǎo)細胞之間相互黏附的鈣依賴性跨膜蛋白，主要表達在上皮細胞，廣泛參與細胞間的連接，對于維持正常上皮細胞的完整性十分重要。研究表明，E-cadherin結(jié)構(gòu)和功能異常可致癌細胞間黏附松散，癌細胞極易從原發(fā)部位脫落，并沿淋巴管血管外膜及組織間隙浸潤蔓延，破壞鄰近正常組織并繼續(xù)生長，形成轉(zhuǎn)移癌［9］。E-cadherin的表達下調(diào)或抑制和功能喪失均可啟動 EMT，癌細胞經(jīng)過這種細胞表型的轉(zhuǎn)化獲得更高的侵襲性。在對E-cadherin表達調(diào)控的研究中發(fā)現(xiàn)，Slug起到?jīng)Q定性作用。Slug是Snail超家族成員之一，能識別E-cadherin基因啟動子上 E2-box元件以抑制靶基因 E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)E-cadherin蛋白表達，共同促進癌細胞的原位侵襲和遠處轉(zhuǎn)移。有研究表明，Slug的過表達同時伴有E-cadherin的低表達或缺失與誘發(fā)胰腺癌、骨肉瘤、結(jié)直腸癌、口腔鱗癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移高度相關(guān)［10-13］。

本研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可顯著抑制HepG2細胞基質(zhì)黏附能力，提示大黃素可能具有潛在抑制 HepG2細胞遷移和侵襲的能力。劃痕修復(fù)實驗和 Transwell小室體外侵襲實驗結(jié)果顯示，大黃素可顯著降低HepG2細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)，提示大黃素可抑制HepG2細胞遷移和侵襲能力。為了進一步驗證大黃素抑制HepG2細胞遷移和侵襲的機制，本研究對E-cadherin和Slug的表達進行了分析。Western blot分析結(jié)果顯示，大黃素可顯著增強 E-cadherin蛋白表達并且抑制 Slug蛋白表達，提示大黃素抑制HepG2細胞遷移和侵襲能力可能是通過增強E-cadherin的蛋白表達以及抑制 Slug的蛋白表達而實現(xiàn)的。

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（修回日期：2015-09-03；編輯：華強）

Effects of Emodin on Migration and Invasion Ability and Expressions of E-cadherin and Slug of Human Hepatoma Cell Lines HepG2

GAO Jun-xia1， LV Qiang2
（1. Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China； 2. Muling Bamiantong Forestry Worker Hospital，Muling 157500， China）

ObjectiveTo investigate the effects of emodin on the migration and invasion ability and expressions of E-cadherin and Slug of human hepatoma cell lines HepG2； To discuss the possible mechanisms of anti-hepatocellular carcinoma.MethodsHepG2 cells were cultured in vitro. The experimental group was treated with emodin at concentrations of 10 μmol/L and 20 μmol/L as. The negative control group was treated with the same volume of RPM I-1640 medium， while the positive control group was treated with 10 μmol/L floxuridine. The cell matrix adhesion assay， wound healing and transwell chamber in vitro invasion assay were used to observe the effects of emodin on HepG2 cell adhesion rate and migration and invasion ability. Western blot analysis was used to observe the changes of expressions of E-cadherin and Slug.ResultsCompared with the negative control group， emodin inhibited significantly HepG2 cell adhesion rate and migration and invasion ability were in a dose-dependent manner（P＜0.05，P＜0.01）； Western blot analysis showed that the protein expression of E-cadherin increased significantly， and the level of Slug decreased significantly in a dose-dependent manner （P＜0.05，P＜0.01）.ConclusionEmodin can significantly inhibit migration and invasion of HepG2 cells， which mechanism may up-regulate expressions of E-cadherin and down-regulate Slug.

emodin； hepatocellular carcinoma； migration； invasion； E-cadherin； Slug protein

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.017

R285.5

A

1005-5304（2016）06-0064-04

呂強，E-mail：lvqiang1966@163.com

2015-08-17）

大黃素是從大黃中提取的有效單體，具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等功效功效［1-2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，大黃素抗腫瘤作用明顯，對宮頸癌、大腸癌、肝癌細胞等腫瘤細胞具有殺傷和抑制作用［3-5］，大黃素還可通過促進人肝癌 HepG2細胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用［6］。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國目前十分常見的消化道惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、早期癥狀不典型、惡性程度高、臨床治療困難、預(yù)后不良、病死率高等特點，遷移和侵襲是患者死亡和治療效果不理想的主要原因［7］。目前放療、化療等治療HCC的手段已經(jīng)進入平臺期，然而其分子機制尚未明了。雖然大黃素具有促進 HepG2細胞凋亡作用，但是有關(guān)其對 HepG2細胞遷移和侵襲的影響國內(nèi)鮮見報道。另外，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和Slug蛋白被證實是與多種惡性腫瘤遷移和侵襲相關(guān)的蛋白。因此，本研究采用體外培養(yǎng)HepG2細胞，觀察大黃素對HepG2細胞遷移侵襲能力及E-cadherin、Slug蛋白表達的影響，探討其相關(guān)作用機制。