siRNA沉默細胞外信號調節激酶1/2基因協同甲亢寧膠囊對大鼠甲狀腺細胞-5細胞增殖的影響

林蘭，王秋虹，易泳鑫

中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053

·實驗研究·

siRNA沉默細胞外信號調節激酶1/2基因協同甲亢寧膠囊對大鼠甲狀腺細胞-5細胞增殖的影響

林蘭，王秋虹，易泳鑫

中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053

目的通過甲亢寧膠囊（以下簡稱“甲亢寧”）協同siRNA干擾大鼠甲狀腺細胞-5（fisher rat thyroid cell line-5，FRTL-5）中細胞外信號調節激酶（ERK）1/2基因，觀察并探討甲亢寧對FRTL-5細胞RNA干擾ERK1/2基因表達及對FRTL-5細胞增殖的影響。方法將生長狀態良好的FRTL-5細胞分為空白組、陰性對照組、甲亢寧組、siRNA組、甲亢寧協同組。利用siRNA沉默及甲亢寧協同干擾FRTL-5細胞的ERK1/2基因，RT-PCR檢測ERK1/2 mRNA表達，Western blot檢測ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達，CCK8法檢測細胞增殖。結果RT-PCR檢測結果顯示，空白組和陰性對照組ERK1/2的mRNA表達無明顯差異（P＞0.05）；與空白組比較，siRNA組和甲亢寧組FRTL-5細胞ERK1/2 mRNA表達明顯下降（P＜0.01）；與空白組、陰性對照組比較，甲亢寧協同組ERK1/2 mRNA表達明顯下降（P＜0.01）；Western blott檢測結果顯示，與空白組、陰性對照組比較，甲亢寧組、siRNA組、甲亢寧協同組p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表達相對量明顯下降（P＜0.01）。轉染24、48 h后，CCK8法檢測結果顯示，甲亢寧組、siRNA組、甲亢寧協同組細胞增殖受抑制，與空白組、陰性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。結論甲亢寧對ERK1/2磷酸化起阻斷作用，ERK1/2基因被沉默后，對甲狀腺細胞增殖有抑制作用，甲亢寧可協同ERK1/2-siRNA抑制FRTL-5細胞增殖。

甲狀腺細胞；細胞外信號調節激酶1/2；甲亢寧膠囊；RNA干擾；增殖

Graves病（Graves disease，GD）是當前常見的甲狀腺疾病之一，臨床典型表現為甲狀腺腫大、Graves眼病和高代謝癥候群等。GD是甲狀腺功能亢進癥的最常見病因［1］。但臨床中應用抗甲狀腺藥物治療普遍存在復發率高、治療周期長的缺點［2-3］。目前，臨床上對GD發病過程中“甲狀腺細胞異常過度增殖”這一關鍵環節，尚缺乏針對性的治療藥物［4］。本研究以細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2基因為靶點，針對ERK1/2基因的siRNA特異性片段，采用 Lipofectam ine RNAiMAX Reagent轉染試劑將其有效地轉染入Fisher大鼠甲狀腺細胞-5（fisher rat thyroid cell line-5，FRTL-5）細胞內，誘導ERK1/2基因沉默，從而研究RNAi效應對FRTL-5細胞 ERK1/2基因表達的抑制作用及其對細胞增殖的抑制作用，探討GD的治療新策略。

1 實驗材料

1.1 細胞

FRTL-5細胞（CRL1468）來源于ATCC細胞庫。

1.2 藥物及制備

甲亢寧膠囊（以下簡稱“甲亢寧”），中國中醫科學院廣安門醫院，京藥制字 Z20063194，批號20151203。將1粒甲亢寧（0.45g）溶于14.265mL純水中，配制成100 mg/mL甲亢寧母液，用0.22 μm濾器過濾至離心管，4 ℃保存。依據前期研究，用F12完全培養液將甲亢寧母液稀釋成3 mg/mL［5］。

1.3 主要試劑與儀器

ERK1/2 siRNA由上海吉瑪公司合成，序列參照文獻［6］。ERK1/2siRNA序列：5'-GCCGCCGCCGCC GCCAT-3'，與MAPKmRNA翻譯起始部位的17個堿基序列互補；隨機核苷酸序列：5'-CGCGCGCTCGCG CACCC-3' Lipofectamine RNAiMAX Reagent，Invitrogen公司；Trizol reagent RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒及BCA蛋白質定量試劑盒，康為世紀生物公司；CCK8細胞增殖檢測試劑，日本同仁公司；p-ERK1/2、ERK1/2抗體，美國CST公司；F12完全培養基（GIBCO），0.25%胰酶細胞消化液（杭州吉諾），胎牛血清、緩沖液（Hyclone）。細胞培養箱（日本SANYO公司），LP400型全自動酶標儀（法國巴斯德公司），96孔板（CORNING公司），微量加樣器（Eppendorff公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與轉染

將細胞接種于6孔板，每孔接種細胞5×104個。實驗分為空白組、甲亢寧組、甲亢寧協同組（甲亢寧+ERK1/2-siRNA）、陰性對照組（NC組）、siRNA組，其中甲亢寧組、甲亢寧協同組、siRNA組為干預組。空白組、NC組、siRNA組加F12完全培養基3mL，其余組加甲亢寧培養液 3mL。參照 Lipofectamine RNAiMAX Reagent說明書分別對甲亢寧協同組、NC組、siRNA組進行轉染。

2.2 引物的設計與合成

ERK1/2 mRNA序列從 genebank查詢，應用Oligo6.0軟件設計引物，在BLAST上進行同源性分析。引物序列如下：ERK1-F，5'-CATCCGAGACATCCTC AGAGC-3'；ERK1-R，5'-GGTCGCAGGTGGTGTTGA TA-3'；ERK2-F，5'-AGGTTGTTCCCAAACGCTGA-3'；ERK2-R，5'-AGGTAAGTCGTCCAGCTCCA-3'；內參β-actin-F，5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'；內參β-actin-R，5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'。

2.3 RT-PCR反應

首先配制反轉錄反應體系，將上述20 μL反應溶液65 ℃保溫5 min，37 ℃ 保溫40 min，70 ℃保溫10 min。然后配制PCR反應體系。反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，58 ℃、60 s讀板，共45個循環。以2-ΔΔct表示相對樣品初始模板量。

2.4 Western blot檢測大鼠甲狀腺細胞-5細胞外信號調節激酶1/2蛋白表達

提取細胞總蛋白，利用BCA法測定蛋白濃度，經SDS-PAGE電泳后轉PVDF膜，室溫封閉2 h。分別加入p-ERK1/2、ERK1/2一抗，4 ℃溫育過夜，再加二抗37 ℃溫育1 h后，膠片曝光，定影，凝膠成像系統分析。

2.5 CCK8法檢測大鼠甲狀腺細胞-5細胞增殖

調整FRTL-5細胞濃度為2×105個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL（每孔接種細胞約2×104個），轉染方法同前。轉染2 h后，吸去轉染培養基，PBS洗2遍，加入F12完全培養基，置于細胞培養箱培養。收集轉染24、48 h的細胞，每個時點設6個復孔，每孔加CCK8檢測試劑10 μL，于酶標儀450 nm處測定吸光度（OD）值，按CCK8試劑盒說明書進行操作。

3 統計學方法

4 結果

4.1 甲亢寧對大鼠甲狀腺細胞-5細胞外信號調節激酶1/2基因表達的影響

RT-PCR檢測結果顯示，空白組和NC組ERK1/2 mRNA表達無明顯差異；與空白組比較，siRNA組和甲亢寧組能夠抑制FRTL-5細胞ERK1、ERK2 mRNA表達明顯下降（P＜0.01）；與空白組、NC組比較，甲亢寧協同組ERK1/2 mRNA表達明顯下降（P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組大鼠甲狀腺細胞-5 ERK1、ERK2基因相對表達量比較（±s，2-ΔΔct值））

表1 各組大鼠甲狀腺細胞-5 ERK1、ERK2基因相對表達量比較（±s，2-ΔΔct值））

注：與空白組比較，**P＜0.01；與NC組比較，##P＜0.01

組別 n ERK1 ERK2空白組 3 1.00±0.00 1.00±0.00 NC組 3 0.99±0.07 0.86±0.16甲亢寧組 3 0.41±0.05**## 0.34±0.07**##siRNA組 3 0.28±0.03**## 0.29±0.05**##甲亢寧協同組 3 0.17±0.02**## 0.18±0.06**##

4.2 甲亢寧對大鼠甲狀腺細胞-5細胞外信號調節激酶1/2蛋白表達的影響

Western blot檢測結果顯示，與空白組、NC組比較，甲亢寧組、siRNA組p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表達水平明顯下降（P＜0.01）；與空白組、NC組比較，甲亢寧協同組p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表達水平明顯下降（P＜0.01）。結果見表2、圖1。

4.3 甲亢寧對大鼠甲狀腺細胞-5細胞增殖的影響

CCK8檢測結果顯示，與空白組、NC組比較，甲亢寧組、siRNA組、甲亢寧協同組OD值下降，存活細胞較少，FRTL-5細胞增殖較慢，差異有統計學意義（P＜0.01），表明通過下調ERK1/2 mRNA表達，可抑制FRTL-5細胞增殖。在24、48 h檢測點時，與siRNA組比較，甲亢寧組OD值較大，差異無統計學意義（P＞0.05）；在48 h檢測點時，與空白組比較，NC組OD值較小，差異有統計學意義（P＜0.05），這可能是陰性序列對細胞有一定的毒性作用所致。結果見表3。

表2 各組大鼠甲狀腺細胞-5 p-ERK12、ERK1/2蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠甲狀腺細胞-5 p-ERK12、ERK1/2蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與NC組比較，##P＜0.01；與siRNA組，▲▲P＜0.01

組別 n p-ERK1/2/ERK1/2空白組 3 0.83±0.04 NC組 3 0.78±0.07甲亢寧組 3 0.42±0.02**##▲▲siRNA組 3 0.36±0.02**##甲亢寧協同組 3 0.19±0.02**##▲▲

圖1 各組大鼠甲狀腺細胞-5 ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達免疫印跡電泳圖

表3 各組大鼠甲狀腺細胞-5不同時點細胞增殖比較（±s，OD值）

表3 各組大鼠甲狀腺細胞-5不同時點細胞增殖比較（±s，OD值）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與NC組比較，##P＜0.01

組別 n 24 h 48 h空白組 6 0.938±0.039 1.878±0.068 NC組 6 0.925±0.037 1.548±0.079*甲亢寧組 6 0.555±0.031**## 0.955±0.058**##siRNA組 6 0.484±0.025**## 0.838±0.071**##甲亢寧協同組 6 0.373±0.007**## 0.713±0.058**##

5 討論

FRTL-5是體外研究甲狀腺生理病理機制的常用模型。FRTL-5細胞的增殖是一個多因素共同作用的復雜過程。大量體內外實驗均已證實ERK1/2是促進細胞增殖的重要細胞信號傳導途徑［7-8］，ERK1/2自身在細胞增殖中起著重要作用，ERK通路的抑制對于改善甲狀腺細胞過度增殖至關重要。我院于 1978年開始，通過對大量甲亢患者系統的辨證研究發現甲亢病程中往往出現陰虛陽亢之象，陰虛陽亢證型為甲亢的基本證型，而后制備了具有滋陰潛陽化痰散結功效的甲亢寧。方中牡蠣滋陰潛陽、軟堅散結為君；玄參滋陰清熱生津，佐牡蠣散結為臣；甲狀腺腫為痰凝所致，當化痰、軟堅散結，以連翹、山慈菇加強散結之力。諸藥合用，共奏滋陰潛陽、化痰散結之功。30余年的臨床實踐表明，該藥在甲狀腺功能亢進治療方面具有良好的療效［9］。課題組既往研究表明，ERK1/2是甲亢寧的關鍵作用靶點，調控ERK1/2蛋白表達可能是甲亢寧調控 FRTL-5細胞增殖的關鍵環節［5］。尋找一種可高效抑制ERK1/2通路并有效抑制其增殖的方法將大大改善GD患者的預后。本實驗將文獻已報道的針對ERK1 mRNA、ERK2 mRNA的共同的siRNA 片段轉染入FRTL-5細胞，利用 RNAi 技術在基因轉錄水平阻斷ERK信號傳導通路。上述結果表明，甲亢寧對ERK1/2的磷酸化起阻斷作用，ERK1/2基因被沉默后，對甲狀腺細胞的增殖有抑制作用，甲亢寧可以協同ERK1/2-siRNA抑制FRTL-5細胞增殖。

［1］ 中華醫學會內分泌學分會《中國甲狀腺疾病診治指南編寫組》.中國甲狀腺疾病診治指南-甲狀腺功能亢進癥［J］.中華內科雜志，2007，46（10）：876-882.

［2］ 司富春，宋雪杰.中醫治療甲亢的證候和方藥分析研究［J］.中華中醫藥雜志，2013，28（11）：3251-3252.

［3］ 秦淑蘭，邱柳蕓，劉小華，等.131I與抗甲狀腺藥物治療甲狀腺功能亢進癥的Meta分析［J］.中華臨床醫師雜志（電子版），2013，7（19）：8799-8803.

［4］ 蔡鵠.薯蕷皂苷元對Ad-TSHR-289誘導Graves病模型小鼠甲狀腺細胞增殖及免疫功能的影響［D］.濟南：山東大學，2013.

［5］ 孟淑華.中藥甲亢寧膠囊對FRTL-5細胞TSHR信號轉導通路的作用機制研究［D］.北京：中國中醫科學院，2014.

［6］ GLENNON P E， KADDOURS S， SALE E M， et al. Depletion of mitogen-activated protein kinase using an antisense ol igodeoxynucleo-tide approach downregulates the phenylephrineinduced hypert rophic response in rat cardiac myocytes［J］. Circ Res，1996，78（6）：954-961.

［7］ CAMBELL P M. Oncogenic Ras Pushes （and Pul ls） cel l cycle progression through ERK activation［J］. Methods Mol Biol，2014，1170：155-163．

［8］ WASEEM T，DUXBURY M， ASHLEY S W， et al. Ghrel in promotes intestinal epithel ial cel l prol i feration through PI3K/Akt pathway and EGFR t ransactivation both converging to ERK1/2 phosphorylation［J］. Peptides，2014，52：113-121．

［9］ 林蘭，李鳴鏑，劉喜明.中藥甲亢寧治療陰虛陽亢型甲狀腺功能亢進癥的臨床研究［J］.中國中西醫結合雜志，1999，19（3）：144-147.

Effects of siRNA Silenced ERK 1/2 Gene Collaborated with Jiakangning Capsules on FRTL-5 Proliferation

LIN Lan， WANG Qiu-hong， YI Yong-xin
（Guang'anmen Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）

ObjectiveTo observe and explore the effects ofJiakangningCapsules on the expression of ERK1/2 gene and proliferation of FRTL-5 by studying the effects ofJiakangningCapsules collaborated with siRNA on interfering ERK1/2 gene in FRTL-5.MethodsFRTL-5 cells in good conditions were divided into control group，negative control group，JiakangningCapsules collaborated with siRNA group， siRNA interference group， andJiakangningCapsules group. RT-PCR was performed to detect the expression of ERK1/2 gene in mRNA levels in FRTL-5； Western blotting was performed to detect the expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2； CCK8 method was used to detect cell proliferation.ResultsRT-PCR results showed that the ERK1/2 mRNA expression of the control group and negative control group were of no significant difference （P＞0.05）； compared with the control group， siRNA interference group andJiakangningCapsules group could inhibit ERK1/2 gene mRNA expression in FRTL-5（P＜0.01）. Compared with the control group and negative control group， the ERK 1/2 mRNA expression ofJiakangningCapsules collaborated with siRNA group decreased obviously （P＜0.01）. Compared with the control group and negative control group， the expression of p-ERK1/2， ERK1/2 ofJiakangningCapsules group，JiakangningCapsules collaborated with siRNA group， and siRNA interference group decreased obviously （P＜0.01）. At the time of 24 h and 48 h after transfection， according to the results of CCK8， compared with the control group and negative control group， the cell proliferation ofJiakangningCapsules group，JiakangningCapsules collaborated with siRNA group， and siRNA interference group was inhibited （P＜0.01）.ConclusionJiakangningCapsules have blocking effect on the phosphorylation of ERK1/2. After ERK1/2 gene was silenced， the thyroid cell proliferation was inhibited.JiakangningCapsules can collaborate with ERK1/2-siRNA to inhibit FRTL-5 cell proliferation.

∶ thyroid cell； ERK1/2；JiakangningCapsules； RNA interference； proliferation

R285.5

A

1005-5304（2016）06-0043-04

2015-12-29）

（

2016-01-27；編輯：華強）

國家自然科學基金（81173260）

王秋虹，E-mai l：qiuhongfor tune@126.com

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.012