分散固相萃取-HPLC-MS/MS法測定椰汁中Y-壬內酯

王玉健，龐道標，梁振綱，黃惠玲，莊鵬，董存柱（.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，海南海口5703；2.海南大學環境與植物保護學院，海南海口570228）

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分散固相萃取-HPLC-MS/MS法測定椰汁中Y-壬內酯

王玉健1，龐道標1，梁振綱1，黃惠玲1，莊鵬1，董存柱2，*
（1.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，海南海口570311；2.海南大學環境與植物保護學院，海南海口570228）

摘要：建立了分散固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法測定椰汁中γ-壬內酯含量的方法，對提取條件、流動相、質譜條件進行了研究，并對γ-壬內酯可能的斷裂機理進行了推測。待測樣品直接用乙腈提取，PSA分散固相萃取，采用電噴霧離子源（ESI）、多反應監測正離子模式掃描，選擇m/z 157.1/139.1、m/z 157.1/121.1作為γ-壬內酯的定性、定量離子對，外標法定量。γ-壬內酯在0.025μg/mL～0.50μg/mL范圍內濃度與峰面積呈良好的線性關系，儀器檢出限為0.025 μg/mL，方法的檢測限為0.10mg/kg，定量限為0.40 mg/kg，添加水平為0.10、0.20、0.40 mg/kg時γ-壬內酯的平均回收率范圍分別為92.4%～98.4%，相對標準偏差為6.8%～7.6%（n=10）。

關鍵詞：γ-壬內酯；椰汁；分散固相萃取；高效液相色譜-串聯質譜

飽和內酯類化合物是一類非常重要的食用香料，天然存在于各種水果中，現已廣泛用于各種飲料焙烤食品等食用香精的配方中［1］。γ-內酯是γ-羥基羧酸分子內酯化得到的一類內酯類化合物，它們富含奶香、果香，具有留香時間長、香氣圓潤等特點［2］。γ-壬內酯是γ-內酯中的典型代表化合物［3］，具有椰子香氣，有油脂氣息［4］，可用于需有油脂氣息的香精及調味香精（例如椰子及杏仁香精）之中。雖然GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中γ-壬內酯被認為是一種“自我限量”的添加物，它的添加量往往受到消費者的接受程度的控制［5-6］，一般情況下不會出現超量使用的問題，但是隨著食品工業的日益發展，香精香料使用的逐漸普遍，消費者的味蕾對于香味的識別閾值也在逐年提高，可能造成食用香精香料在使用過程中逐漸增量［7-8］，從而帶來健康隱患。因此，建立椰汁中γ-壬內酯含量的檢測方法是很有必要的。

目前鮮見關于食品中γ-壬內酯檢測方法的文獻報道。本文采用超高效液相色譜-串聯質譜技術，建立了同時定性、定量測定椰汁中γ-壬內酯含量的方法，方法前處理簡單、快速，適用性強。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

Agilent 1200超高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；API 4000Q四極桿質譜儀（配有電噴霧離子源）：美國ABI公司；Harvard II針泵：美國Varian公司；MS3 Basic旋渦混勻器：廣州IKA公司；Centrifuge 5810R離心機：Eppendorf公司；G-285電子天平：Mettler公司；氮吹儀：美國Caliper公司。

乙腈、甲酸為色譜純試劑：美國TEDIA公司；γ-壬內酯（純度95%）：美國ChromaDex公司；其余試劑均為分析純。標準溶液：用乙腈配制成100 mg/L標準儲備液，0℃～4℃避光保存。

1.2樣品處理

稱取待測樣品5 g（精確至0.01 g）于50 mL具塞離心管中，加入10mL乙腈，渦旋振蕩2min，加入4g無水硫酸鎂和10g氯化鈉，渦旋混合1min，以4000r/min離心5 min，取上清液0.5 mL于玻璃離心管中，加入50 mg PSA吸附劑，混合30 s后離心5 min，取上清液，加入0.5 mL水，渦旋混勻后過0.2 μm有機濾膜，待測。

1.3色譜條件

色譜柱為Accucore Phenyl-Hexyl（100 mm×3 mm i.d.，2.6μm）；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液。梯度洗脫程序：0～3.0 min，10%A～90%A；3.0 min～4.0 min，保持90%A；4.0 min～4.1 min，90%A～10%A；4.1 min～7.0 min，保持10%A。流速：0.60 mL/min，進樣量：10 μL。

1.4質譜條件

電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；多反應監測（MRM）；離子源溫度：500℃；離子源電壓：5 000 V；霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮氣。MRM監測離子對、去簇電壓及碰撞電壓見表1。

表1　γ-壬內酯的質譜優化條件Table 1　The opimized MS/MS conditions of imazalil and pyrimethanil

2　結果與討論

2.1提取條件的選擇

乙腈作為一種通用的提取溶劑在殘留檢測方面得到廣泛的應用，由于其對糖、蛋白質類化合物較難提取［9-10］，對γ-壬內酯有較高的回收率，因此本文采用乙腈作為提取試劑，以最大限度地提取椰汁中的γ-壬內酯，并使提取液中的干擾物較少。

2.2儀器分析條件的選擇

分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液等流動相對γ-壬內酯的峰形和分離效果。結果表明，以甲醇-水為流動相時，目標化合物色譜峰略有拖尾。而加入0.1%甲酸有利于γ-壬內酯的離子化，可提高靈敏度，峰形也較好。因此本文選擇以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相。

2.3質譜條件的選擇

將γ-壬內酯標準品溶液采用流動注射直接進樣，通過全掃描確定化合物母離子，再對母離子進行二級質譜掃描，得到碎片離子，通過優化條件，得到二級質譜圖。通過多反應離子監測（MRM）選擇相對豐度較高的離子對，確定為定性定量離子對，并優化去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）等參數，優化后的質譜條件見表1。

2.4斷裂機理推測

γ-壬內酯分子式為C9H16O2，相對分子質量為156.2。γ-壬內酯可能的斷裂方式如圖1所示。

圖1　γ-壬內酯可能的斷裂方式Fig.1　Possible fragmentation mechanism of γ-nonanolactone

即分子離子峰m/z 157重排開環，然后脫去一個水分子，得到m/z 139的碎片離子峰；而m/z 139的碎片離子峰重排后形成六元環，再通過氫遷移重排丟失一個水分子，正電荷轉移至碳上，形成較穩定的共軛體系，得到m/z 121的碎片峰。

圖2為γ-壬內酯子離子全掃描質譜圖。

圖2　γ-壬內酯子離子全掃描質譜圖Fig.2　Product ions full scan mass spectra of γ-nonanolactone

γ-壬內酯母離子157.1產生的子離子分別為m/z 139.1、69.1、121.1、97.1，由于試劑空白在69.1有干擾，因此根據子離子的豐度，本文選擇m/z 139.1、121.1作為γ-壬內酯的定量離子。

2.5線性關系及檢出限

以空白樣品基質配制一系列不同濃度的混合標準工作溶液（0.025、0.050、0.075、0.10、0.20、0.40、0.50、0.80、1.0 μg/mL），并依次進樣，分別以γ-壬內酯的峰面積Y為縱坐標，以相應的濃度值X為橫坐標，作標準曲線，結果表明，γ-壬內酯在0.025 μg/mL～0.50 μg/mL范圍內其濃度與峰面積呈良好的線性關系，線性方程Y=937X（r=0.999 1）。

為檢驗方法的穩定性和重復性，對相同濃度的標準溶液進行同日內不同時間段10次重復進樣，γ-壬內酯峰面積的變異系數為1.59%，表明本方法的重復性和穩定性良好。

以實際檢測時的信噪比（RSN）為3作為檢出限，儀器的檢出限為0.025 μg/mL，方法的檢測限為0.10 mg/kg，定量限為0.40 mg/kg。γ-壬內酯及陽性椰汁樣品MRM色譜圖見圖3、圖4。

圖3　γ-壬內酯標樣的MRM色譜圖Fig.3　MRM chromatogram of γ-nonanolactone standards

圖4　陽性椰汁樣品MRM色譜圖Fig.4　MRM chromatogram of incurred positive sample

2.6回收率與精密度試驗

采用標準添加法，在5 g（精確至0.01 g）陰性椰汁樣品中進行3個水平（0.10、0.20、0.40 mg/kg）、10平行的添加回收試驗，測定后得到γ-壬內酯的回收率和相對標準偏差。在試驗條件下，3個添加水平下γ-壬內酯的平均回收率范圍為92.4%～98.4%，相對標準偏差為6.8%～7.6%（見表2）。

表2　3個添加水平下γ-壬內酯的平均回收率和相對標準偏差（n=10）Table 2　Spiked recoveries and RSDs of γ-nonanolactone（n=10）

椰汁陰性樣品和標準添加樣品的MRM色譜圖見圖5。

圖5　椰汁樣品中γ-壬內酯殘留的MRM色譜圖Fig.5　MRM chromatogram of γ-nonanolactone in coconut milk

2.7實際樣品的檢測

使用本方法對10個市售椰漿和果肉椰汁樣品進行了檢測，結果在其中4個樣品中檢出了γ-壬內酯，含量分別為46.4、3.97、0.319、43.6 mg/kg。

3　結論

本試驗采用超高效液相色譜-串聯質譜法建立了椰汁中γ-壬內酯含量的測定方法，方法前處理簡單、快速，操作簡便易行，且準確、靈敏度高，重現性好，檢出限低，具有較強的實用性。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.026

基金項目：國家質檢總局科技計劃項目（2013IK153）；海南省重點科技計劃項目（ZDXM2014083）；國家自然科學基金項目（31360447）；海南省自然科學基金項目（212018；313105）

作者簡介：王玉健（1979—），女（漢），高級工程師，博士，研究方向：食品中有毒有害物殘留檢測。

*通信作者

收稿日期：2015-05-23

Determination of γ-Nonanolactone in Coconut Juice by Dispersive Solid Phase Extraction Coupled
with High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

WANG Yu-jian1，PANG Dao-biao1，LIANG Zhen-gang1，HUANG Hui-ling1，ZHUANG Peng1，DONG Cun-zhu2，*

（1.Technology Center of Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau China，Haikou 570311，Hainan，China；2.College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Abstract：A dispersive solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method with dispersive solid phase extraction was established for the determination of γnonanolactone in coconut juice.The effect of extration condition，flow phase，and tandem mass spectrometry parameters were investigated.And the possible fragmentation mechanisms of γ-nonanolactone were presumed.The sample was extracted with acetonitrile and determined under the multiple reaction monitoring（MRM）mode by employing external method.The precursor-product ion pair m/z 157.1/139.1 was selected as qualitative ions，and m/z 157.1/121.1 was selected as quantitaive ion.The calibration curve was linear in the range of 0.025 μg/mL～0.50 μg/mL.The limits of detection were 0.025 μg/mL for the instrument and 0.10 mg/kg for the method respec tively.The LOQ was 0.40 mg/kg for the method.The average recoveries of γ-nonanolactone were between 92.4%and 98.4%at spiked levels of 0.10，0.20 mg/kg and 0.40 mg/kg with relative standard derivation（RSDs）of 6.8%～7.6%（n=10）.

Key words：γ-nonanolactone；coconut juice；dispersive solid-phase extraction；high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry