六安市小腸結腸炎耶爾森菌檢測及其分子生物學研究

高大維，丁業榮，張　鳳，楊　衛，常宏偉，李朝陽，徐鵬鵬，段　然，梁俊容，王建軍

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六安市小腸結腸炎耶爾森菌檢測及其分子生物學研究

高大維1,2，丁業榮2，張鳳2，楊衛2，常宏偉2，李朝陽2，徐鵬鵬2，段然3，梁俊容3，王建軍1,4

1.安徽醫科大學公共衛生學院，合肥230032；2.安徽省六安市疾病預防控制中心,六安237000；3.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京102206；4.安徽省疾病預防控制中心，合肥230000

摘要：目的調查本地腹瀉病人和家畜家禽、昆蟲蒼蠅中小腸結腸炎耶爾森菌的感染及攜帶情況；通過對小腸結腸炎耶爾森菌的病原學和分子生物學研究來探討動物帶菌與人群之間的相互關系；為制定相應的防治對策提供科學依據。方法按照中國CDC編制《小腸結腸炎耶爾森菌實驗室的病原學分離鑒定手冊》第二、三版規定的程序進行病原學和分子生物學試驗、研究。結果近年來自1 521份腹瀉病人、家畜家禽等標本中分離出小腸結腸炎耶爾森菌109株，其陽性檢出率分別為4.11%和11.04%；所有菌株均經生物梅里埃API 20E生化試驗鑒定確認；不同標本中均檢出致病性小腸結腸炎耶爾森菌，其毒力基因分布為ail+、ystA+、yadA+、virF+、rfbC+、ystB-，而非致病性菌株上述毒力因子均為陰性；致病性小腸結腸炎耶爾森菌PFGE分子分型檢測證實腹瀉病人，家畜家禽標本中的菌株帶型類聚圖高度一致。結論本地腹瀉病人、家畜家禽和蒼蠅標本均檢出致病性和非致病性小腸結腸炎耶爾森菌；不同標本中分離的致病性小腸結腸炎耶爾森菌菌株毒力基因分布相同，均攜帶毒力質粒，PFGE分子分型檢測基因組帶型類聚圖高度一致，從而可以認為豬是本地人群小腸結腸炎耶爾森菌病的重要傳染源之一，牛、犬等在本病傳播中的地位尚不能確定，有待進一步的調查與探討。

關鍵詞：小腸結腸炎耶爾森菌；腹瀉病人；家畜家禽；分子生物學

Supported by the National Science and Technology Major Projects Subject (No. 2013ZX10004-203-002)

位于安徽省西部大別山麓的六安市，被稱為安徽的西大門，與湖北黃岡河南信陽接壤。過去臨床上一直沒有關于致病性小腸結腸炎耶爾森菌在不同宿主之間分析的資料報告[1-2]。為了查清本地小腸結腸炎耶爾森菌的感染現狀，搞清楚該病的傳染來源以及小腸結腸炎耶爾森菌的分子生物學特性，近年來我們對腹瀉病人、家畜家禽和蒼蠅等標本進行了一系列的調查和研究，現報告如下。

1材料與方法

1.1標本來源腹瀉病人來自2011—2014年以來六安市人民醫院、六安市中醫院以及附近鄉鎮醫院腸道門診，由臨床醫生、護士按照1∶10的比例采集新鮮糞便標本于10 mL改良PBS增菌液中冷藏送檢；動物宿主標本采自養豬場、屠宰場，按上述比例，用無菌棉簽采取糞便的中間部位，避免交叉污染，冷藏送檢；蒼蠅標本：人工捕捉蒼蠅15只為1份標本，置改良PBS增菌液中冷藏送檢。

1.2采集時間一般每年的5～10月份。

1.3試劑與儀器分型血清購自日本生研株式會社，API20E生化鑒定條購自法國生物梅里埃公司，分離培養基及各種生化試劑購自北京陸橋技術有限責任公司，藥敏試紙由杭州天和微生物試劑有限公司生產，基因組DNA 提取試劑盒和PCR 反應體系試劑購天根生化科技有限公司，限制性內切酶NotⅠ、XbaⅠ購自Promega公司，SeaKem Gold瓊脂糖購自Cambraex Bio Seience Rockland公司，蛋白酶K購自Merck公司。脈沖場凝膠電泳儀為Bio-Rad CHEF-DRⅢ系統和Bio-Rad CHEF-Mapper系統，凝膠成像儀為Bio-Rad GelDoc 2000系統，均購自美國伯樂公司。

1.4血清及生化鑒定細菌培養根據臨床檢驗操作規程，按常規方法進行，純培養后再進行生化及血清學鑒定

1.5基因檢測引物按參考文獻合成[3]ail、ystA、ystB、yadA、rfbC、virF6種毒力基因，由上海生工生物工程有限公司合成 。 PCR 擴增體系:采用20 μL反應體系，每個體系加入純水8 μL，PremixTaqVersion2.0(Loading dye mix)10 μL，上下引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL。

1.6實驗方法按照中國CDC編寫《小腸結腸炎耶爾森菌實驗室分離鑒定手冊》(2版、3版)程序(以下簡稱“程序”)[4]。用SPSS 16.0軟件對數據進行統計學處理。用Bionumerics軟件對PFGE結果進行聚類分析。

2結果

2.1腹瀉病人標本的小腸結腸炎耶爾森菌檢測2011—2014年先后收到各家醫院腸道門診送檢的腹瀉病人糞便標本851份，分離出小腸結腸炎耶爾森菌35株，陽性檢出率為4.11%；2012年最高為6.47%，2014年次之，為5.31%，2011年最低，僅為1.98%(表1)。

表1腹瀉病人標本小腸結腸炎耶爾森菌檢測情況

Tab.1Detection rate of Yersinia enterocolitica in diarrhea patient samples

年份Year標本數No.ofsamples陽性數No.ofpositive陽性率(%)Positiverate(%)201120241.982012201136.47201320352.462014245135.31合計Total851354.11

2.2家畜家禽和蒼蠅攜帶小腸結腸炎耶爾森菌近年來，我們對本地飼養的家禽、畜糞便標本開展了小腸結腸炎耶爾森菌攜帶情況調查，先后收到送檢的豬、牛糞等標本467份，檢出小腸結腸炎耶爾森菌62株，其中豬糞標本陽性率最高達21.53%，牛和犬糞標本帶菌率偏低(表2)；值得關注的是自2011—2014年從203份蒼蠅標本中常常能檢出小腸結腸炎耶爾森菌，陽性檢出率依次為12.5%、0%、8.51%和5.88%。

表2家畜家禽標本檢測小腸結腸炎耶爾森菌

Tab.2Detection of Yersinia enterocolitica in livestock and poultry samples

樣本Specimens檢測份數No.ofdetection陽性數No.ofpositive陽性率(%)Positiverate(%)豬糞Pigfeces2094521.53牛糞Cattlefeces11597.83雞糞Chickenfeces11176.31犬糞Dogfeces3213.13合計Total4676213.28

2.3小腸結腸炎耶爾森菌生血清學分布和化學特性對44株致病性小腸結腸炎耶爾森菌和非致病性小腸結腸炎耶爾森菌的血清型在不同宿主的分布進行了研究，顯示致病性菌株同時在腹瀉病人和家畜家禽標本中檢出，其血清型均為O∶3型；除此以外，非致病性菌株中還能檢出O8型、O1andO2型菌株(表3)。我們還應用生物梅里埃API.20E生化試驗系統對109株小腸結腸炎耶爾森菌進行了生化學鑒定，結果呈7種生化反應模式，其中最常見的生化反應編碼式為：1015523、1155723、1155523三種，分別占鑒定菌株的30.28%、28.44%和23.85%，其它均不多見(表4)。不同來源的標本分離菌株的生化鑒定結果并不一致，腹瀉病人菌株生化編碼多為1155723和1155523兩種模式，而豬糞標本菌株的編碼卻多數為1015523，其它少見。分析其原因發現與菌株的致病性和血清型別有關，O3型致病性菌株的生化編碼一般為1015523，而非致病性O8型和其它型菌株卻是1155723和1155523多見。

表3　44株小腸結腸炎耶爾森菌致病性及血清型在不同宿主的分布

表4　109株小腸結腸炎耶爾森菌生化反應模式

2.4藥物敏感性試驗選擇自不同標本中分離的59株小腸結腸炎耶爾森菌，檢測其對各種常用抗生素的敏感性，結果看出該菌對左氧氟沙星、哌拉西林、亞胺培南、諾氟沙星、環丙沙星等藥物高度敏感，而對臨床上常用的氧氟沙星、頭孢唑啉、頭孢呋肟等藥物開始出現抗藥性菌株，對復方新諾明、阿莫西林、氨芐西林等抗生素幾乎不敏感(表5)。

表5　59株小腸結腸炎耶爾森菌抗生素敏感性

2.5小腸結腸炎耶爾森菌的分子生物學研究

2.5.1PCR檢測foxA基因foxA是小腸結腸炎耶爾森菌的鐵草胺菌素受體蛋白的基因，文獻報道[5]可用于小腸結腸炎耶爾森菌種的鑒定。2015年2月我們用聚合酶鏈反應(PCR)的方法檢測109株小腸結腸炎耶爾森菌的foxA基因，結果發現全部陽性。另外在實際工作中還發現4株弗氏/中間型結腸炎耶爾森菌的foxA基因亦為陽性；尚未發現生化鑒定為小腸結腸炎耶爾森菌而foxA基因陰性的菌株。

在實驗研究中，我們應用聚合酶鏈反應(PCR)技術和常規分離培養方法同時進行小腸結腸炎耶爾森菌檢測的對照性研究(表6)，110份不同標本增菌培養后，二種方法同步進行，結果PCR法陽性34份，常規分離方法陽性35份。陽性檢出率分別為30.91%和31.82%，有統計學意義(χ2= 0.021,P>0.05)；仔細分析二法的實驗結果，發現二法陽性、陰性符合率達95.45%(105/110)，而常規分離陽性，PCR陰性，以及PCR法陽性，常規分離法陰性標本僅占4.55%(5/110)。

2.5.2毒力基因檢測本次對24株不同型別小腸結腸炎耶爾森菌進行了毒力基因檢測，以確定其致病性。結果發現O3型菌株的毒力基因分布均為ail+、ystA+、yadA+、virF+、rfbC+、ystB-，符合典型的致病性小腸結腸炎耶爾森菌毒力基因分布特征，尚未發現毒力質粒在人工傳代中丟失。非致病性菌株中除1株不攜帶上述毒力基因外，其余僅ystB陽性(表7)。

表6PCR 法和分離培養法檢測小腸結腸炎耶爾森菌結果

Tab.6PCR and isolation method results of Yersinia enterocolitica

PCR法PCRmethod分離培養法Isolationmethod陽性Positive陰性Negative合計Total陽性Positive32234陰性Negative37376合計Total3575110

2.5.3脈沖場凝膠電泳(PFGE)分子分型我們在中國CDC應急實驗室的幫助下應用PFGE方法對本地16株O3型致病性小腸結腸炎耶爾森菌菌株進行基因組帶型分型，結果顯示，腹瀉病人分離菌株(sy22,sy25,sy26,sy30)與本地豬糞、雞糞等標本中分離菌株的帶型類聚圖高度一致(圖1)。腹瀉病人的菌株為2014年分離，而家畜家禽菌株為2012年和2013年保存的菌株。

表7　24株小腸結腸炎耶爾森菌毒力各基因在不同血清型分布情況

圖1　O3血清型小腸結腸炎耶爾森菌PFGE帶型類聚圖

Fig.1PFGE band pattern clustering diagram in O3 serotype Yersinia enterocolitica

3討論

近年來，國內相關的醫學文獻中，一直沒有安徽省致病性小腸結腸炎耶爾森菌在不同宿主分布的文獻資料報道[1-2]。我們的調查結果證實851份腹瀉病人標本中，檢出了35株小腸結腸炎耶爾森菌，其中致病性小腸結腸炎耶爾森菌4株；670份家畜家禽和蒼蠅標本中分離到小腸結腸炎耶爾森菌74株，其中豬糞、雞糞、犬糞標本均檢出致病性小腸結腸炎耶爾森菌。結果首次改寫了安徽省無致病性小腸結腸炎耶爾森菌存在的歷史，該菌在我國江淮地區被發現也填補了國內小腸結腸炎耶爾森菌不同地區分布的空白。

從不同標本中分離的小腸結腸炎耶爾森菌來看，血清型分布相對廣泛。腹瀉病人標本中分離的O3型菌株以及O8型，O1 and O2型菌株，在家畜家禽標本，蒼蠅標本中都能檢出；特別值得一提的是209份豬糞標本中分離的45株小腸結腸炎耶爾森菌，其中致病性菌株占分離菌株的88.8%(40/45)，均為O∶3血清型，與腹瀉病人的PFGE帶型一致，為我國的優勢帶型，說明豬是本地小腸結腸炎耶爾森菌病重要的傳染源之一，當人群與帶菌動物及污染食物、水源密切接觸后，極有可能被感染而發病[6-8]，對其應引起高度關注；其它動物攜帶致病性小腸結腸炎耶爾森菌的傳染性也不容忽視。生物梅里埃API.20E生化鑒定系統鑒定的陽性的菌株有7種生化反應模式，其中最常見生化編碼為1015523、1155723、1155523三種，其他均為少見。分析發現，O∶3型小腸結腸炎耶爾森菌的生化編碼多是1015523，而O∶8型和未定型菌株的生化編碼多為1155723和1155523，說明不同血清型菌株的生化分解能力存在一定差異。藥物敏感性實驗可以看出，不同標本中分離的小腸結腸炎耶爾森菌對左氧氟沙星、哌拉西林、諾氟沙星、環丙沙星等均高度敏感，而對臨床上頻繁使用的氧氟沙星、頭孢唑啉等都產生一定的抗藥性；值得注意的是腹瀉病人和家畜家禽菌株對各種抗生素的敏感性有一定的差異，體內、體外的藥物反應也不完全相同，考慮這些因素，要求我們臨床醫生應根據病人的臨床癥狀和體征采取相應的防控措施，制定有效的治療方案，妥善合理使用抗生素，防止耐藥菌株的產生，這樣不僅可以減輕病人的經濟負擔，而且可以縮短病程，減少并發癥的發生，是病人早日康復的重要環節。

應用聚合酶鏈反應(PCR)技術和常規分離方法檢測小腸結腸炎耶爾森菌對照研究，110份標本同時應用二種方法進行，結果可以看出，其陽性率非常近似，差異無統計學意義(χ2=0.021,P>0.05)；二種方法陽/陰性符合率為95.45%(105/110)，不吻合率僅占4.55%(5/100)，這說明PCR法不失為檢測小腸結腸炎耶爾森菌的一種值得推廣應用的好方法，尤其是對大量標本的調查與研究，它可以在初篩和確定陽性標本方面具有重要意義，不僅可以節省大量的人力、物力和時間，而且可以為分離培養法鎖定疑似陽性標本的范圍，比較容易的把標本中的小腸結腸炎耶爾森菌分離出來，這樣就可以進一步對其進行生化學、血清學、分子生物學等各方面的鑒定與研究。二法可以互補其得與失，從而保證該項目工作的順利完成。本次實驗研究結果與有關報告并不一致，有文獻[9]認為PCR法的陽性率明顯高于分離培養法，這可能與實驗標本增菌培養后，分離培養前未進行堿處理有關，我們在實際工作中發現增菌標本堿處理可以提高該菌的陽性檢出率達8.86倍之多[ 10]，這是實驗標本分離培養獲得成功的關鍵因素。毒力基因檢測顯示，不同標本分離的O3型小腸結腸炎耶爾森菌的毒力基因分布為ail+、ystA+、yadA+、virF+、rfbC+、ystB-，為典型的致病性菌株特征，而O8型和未定型菌株均不攜帶上述致病因子(ail+、ystA+、yadA+、virF+、rfbC+)，該菌在腹瀉病感染過程中所起的作用，尤待于進一步的研究與探討。PFGE分子分型方法，是近年來中國CDC剛剛建立的起來的一種分子分型模式[ 11]，16株O3型小腸結腸炎耶爾森菌的PFGE檢測的PFGE帶型類聚圖顯示腹瀉病人分離的致病性O3型菌株與當地家畜家禽豬等標本分離的O3型菌株帶型高度一致，從而為人類感染該病的來源與家畜家禽有十分密切的關系提供了很好的佐證。O3型致病性菌株多分布在北方寒冷地區，少數溫暖的沿海地區也有存在[4]，而我國江淮地區也能在腹瀉病人和家畜家禽標本中檢出致病性小腸結腸炎耶爾森菌，尚屬首次報告。

(本研究得到中國疾病預防控制中心應急實驗室景懷琦研究員的大力支持, 在此表示衷心感謝!)

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.009

通訊作者：王建軍，Email:wjj@ahcdc.com.cn

中圖分類號：R378.2

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)03-0256-06

Corresponding author:Wang Jian-jun, Email: wjj@ahcdc.com.cn

收稿日期：2015-08-04；修回日期:2016-01-15

Yersinia enterocolitis detection and molecular biology in Lu’an City, China

GAO Da-wei1,2,DING Ye-rong2,ZHANG Feng2,YANG Wei2,CHANG Hong-wei2,LI Chao-yang2,XU Peng-peng2,DUAN Ran3,LIANG Jun-rong3,WANG Jan-jun4

(1.AnhuiMedicalUniversity,SchoolofPublicHealth,Hefei200032,China;2.Liu’anCenterforDiseaseControlandPrevention,Lü’an237000,China;3.ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China;4.AnhuiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Heifei230000,China)

Abstract:We investigated the infection of Yersinia enterocolitica in local diarrhea patients, livestock and poultry, and insect flies carry status by studying relationship between host and animals carrier with etiological and molecular biological methods, for providing scientific basis for the development of appropriate countermeasures. Results showed that 109 Yersinia enterocolitica strains were isolated from 1 521 diarrhea patients and livestock poultry; the positive rates were 4.11% and 11.04%, respectively. All strains were confirmed by bioMerieux API 20E biochemical tests. Different specimens of pathogenic Yersinia enterocolitica strains were detected, and the virulence genes include ail+, ystA+, yadA+, virF+, rfbC+, ystB-, and pathogenic strains did not carry these virulence factors; pathogenic Yersinia enterocolitica PFGE subtyping tests showed that diagram with a highly consistent pattern clustering between diarrhea patients and host animals specimens. Pathogenic and non-pathogenic Yersinia enterocolitica were detected from local diarrhea patients, livestock poultry and fly specimens. Pathogenic Yersinia enterocolitica had the same virulence genes were isolated from different samples. Genome type clustering map were with a highly consistent pattern clustering tested by PFGE molecular, which prompted that swine were one of the most important sources of infection leading to the local people with Yersinia enterocolitica. It’s also suggested that the effect of cattle and dogs cannot be determined in the spread of the disease, and needs further investigation and discussion.

Keywords:Yersinia enterocolitica; diarrhea patients; livestock and poultry; molecular biology

國家科技重大專項課題(2013ZX10004-203-002)