利用融合PCR技術和T載體克隆技術構建結核分枝桿菌PhoPR雙組份系統缺失突變載體

王　君，吳　芳，柳小玲，梁　粟，張培培，章　樂，吳江東，曹旭東，張萬江

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利用融合PCR技術和T載體克隆技術構建結核分枝桿菌PhoPR雙組份系統缺失突變載體

王君，吳芳，柳小玲，梁粟，張培培，章樂，吳江東，曹旭東，張萬江

石河子大學醫學院病原微生物與免疫學教研室/石河子大學《新疆地方與民族高發病》教育部重點實驗室/《西部地區高發人獸共患傳染性疾病防治》協同創新中心，石河子832002

摘要：目的基于融合PCR技術(SOE-PCR)、T載體克隆技術，構建結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)雙組份系統缺失突變載體的方法。方法利用SOE-PCR技術，將PhoP、PhoR和PhoPR基因上、下游的同源臂與卡那霉素抗性基因融合，構建PhoP、PhoR和PhoPR突變片段，然后將突變片段直接與T載體連接，將其轉入E. coli DH5α感受態細胞并篩選抗性克隆，進而獲得MTB PhoP、PhoR和PhoPR缺失突變載體。結果成功構建MTB PhoPR雙組份系統缺失突變載體，與傳統方法相比，效率高、周期短。結論基于融合PCR技術和T載體克隆技術成功構建MTB PhoPR雙組份系統缺失突變載體，為下一步構建MTB突變株以及相關研究奠定基礎。

關鍵詞：結核分枝桿菌；PhoPR雙組份系統；缺失突變株；構建

Supported by the National Natural Science Foundation (Nos. 81260261 and 81160192) and the High-Level Personnel Scientific Research Projects of Shihezi University (No. RCZX201446)

結核病(Tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的一種古老的、世界性的傳染性疾病，也是一種人獸共患傳染病。耐藥以及耐多藥的結核分枝桿菌在我國地區廣泛流行，這使得我國的結核病疫情不斷加重。然而，MTB的耐藥機制并未明確，這也就成為了重點、熱點的研究領域。隨著研究的不斷深入，若要探究某個基因在菌株中的未知作用，首先需要獲得該基因失活或缺失的突變株，其次是構建帶有該基因片段的載體，并通過一定技術將載體轉入已有的突變株中，以便得到重組株。通過對比分析突變株、重組株和野生株之間表型、蛋白等方面的改變，從而發現該基因自身作用以及其在菌株的致病或耐藥等方面的作用。故而，成功構建突變株對病原菌各個方面方面的研究尤為重要。

MTB PhoPR雙組份系統不僅是12個結核分枝桿菌雙組份系統之一，而且是最基本、最重要的的雙組分系統。它能夠感受外界微環境的改變，并及時調控自身各系統，包括RD1區域基因的表達水平、ESAT-6的分泌等[1-2]，從而調控結核分枝桿菌脂質代謝[3]等方面，使得其在宿主體內得以生存[4-6]。為進一步研究MTB PhoPR雙組份系統的功能，本研究以該系統的PhoP基因、PhoR基因和PhoPR基因為目的基因，利用SOE-PCR技術、T載體技術構建MTB PhoPR雙組份系統的一系列相關基因缺失突變載體并鑒定，從而證明該方法的可行性與高效性，同時為進一步研究MTB PhoPR雙組份系統的功能奠定基礎。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株和質粒結核分枝桿菌國際標準強毒株H37Rv菌株由中國食品藥品檢定研究院提供，由本實驗室保存；大腸桿菌(E.coliDH5α)由本實驗室保存；pMD 19-T Vector購于TaKaRa公司。

1.1.2主要試劑DNA凝膠回收試劑盒、質粒小提取試劑盒、Pfu PCR MasterMix、Taq PCR MasterMix購于天根生化科技(北京)有限公司。其余試劑為進口或國產分析純。

1.1.3引物從GenBank下載H37Rv菌株PhoP基因、PhoR基因序列及其上、下游同源臂序列，使用primer premier 5.0軟件自行設計引物(表1)，并送至上海生工生物工程公司合成。

表1　PhoP、PhoR和Kan相關的引物序列

1.2方法

1.2.1MTB H37Rv菌株全基因組DNA的提取首先將MTB H37Rv菌株接種于改良羅氏培養基，37℃靜置培養3～4周，提取菌株全基因組DNA，同時行DNA凝膠電泳及紫外分光光度計分析DNA濃度及純度[7]。

1.2.2PhoP基因和PhoR基因缺失突變片段的擴增及鑒定以提取的H37Rv菌株全基因組DNA為模板，使用引物PhoP-N-F與PhoP-N-R擴增PhoP基因的N端同源臂，使用引物PhoP-C-F與PhoP-C-R擴增PhoP基因的C端同源臂，得到片段以DNA凝膠電泳鑒定成功后，分別命名為PhoP-N和PhoP-C；以此方法使用各自引物擴增得到PhoR-N和PhoR-C。以pUC19K質粒DNA為模板，使用引物Kan-F和Kan-R擴增卡那霉素抗性基因，得到的片段命名為Kan。將上述各PCR產物分別切膠回收純化，于-20 ℃保存備用。

1.2.3PhoP、PhoR和PhoPR缺失突變片段的SOE-PCR合成及鑒定通過N端、C端同源臂片段和卡那霉素抗性基因片段融合構建基因突變片段。分別將PhoP-N、Kan、PhoP-C和PhoR-N、Kan、PhoR-C以及PhoP-N、Kan、PhoR-C按照1∶2∶1混合作為SOE-PCR反應的模板，在未加入引物的情況下進行首輪PCR循環反應之后，分別加入PhoP-N-F、PhoP-C-R和PhoR-N-F、PhoR-C-R和PhoP-N-F、PhoR-C-R進行第二輪PCR循環反應，將所得到PCR產物經DNA凝膠電泳鑒定后，分別命名為PhoP-K、PhoR-K以及PhoPR-K。

1.2.4PhoP、PhoR和PhoPR缺失突變載體的構建及鑒定各缺失突變片段分別與pMD 19-T Vector、Solution Ⅰ混合，進行片段與T Vector連接，隨后將連接產物轉入E.coliDH5α感受態細胞，并涂布于含有卡那霉素(100 μg/mL)及氨芐霉素(50 μg/mL)的LB雙抗固體培養基，37 ℃倒置過夜培養。同時，pMD 19-T Vector、Solution Ⅰ混合后轉入E.coliDH5α感受態細胞并培養為陰性對照A組，以判斷pMD 19-T Vector是否存在自連現象；去離子水、Solution Ⅰ混合后轉入E.coliDH5α感受態細胞并培養為陰性對照B組，以判斷卡那霉素以及氨芐霉素抗生素是否失活。于次日挑取各組單個陽性克隆并接種于含有卡那霉素(100 μg/mL)及氨芐霉素(50 μg/mL)的LB雙抗液體培養基，37 ℃震蕩過夜培養。然后，取適量菌液為模板行PCR反應并DNA凝膠電泳分析后，將各缺失突變載體分別命名為T-PhoP、T-PhoR和T-PhoPR，并送至上海生工生物工程公司測序。分別將經測序成功的含有T-PhoP、T-PhoR和T-PhoPR的菌液與甘油混勻后放置于-80 ℃保存備用。

圖1利用SOE-PCR和T vector克隆技術構建缺失突變載體的流程圖

Fig.1Schematic chart for mutant vector constructed by using SOE-PCR and T vector cloning

2結果

2.1PhoP、PhoR和PhoPR缺失突變片段的構建及鑒定以結核分枝桿菌國際標準強毒株H37Rv基因組DNA為模板，使用各自引物分別擴增得到PhoP上游同源臂片段PhoP-N(373 bp)、PhoP下游同源臂片段PhoP-C(476 bp)、PhoR上游同源臂片段PhoR-N(366 bp)、PhoR下游同源臂片段PhoR-C(464 bp)，并經DNA凝膠電泳分析，其片段大小與預期一致(圖2)。以pUC19K質粒DNA為模板，使用引物擴增得到1 093 bp的卡那霉素抗性基因Kan，并經DNA凝膠電泳分析，其大小與預期一致(圖3)。

M: DNA markerⅠ; 1: PhoP-N fragment; 2: PhoP-C fragment;3: PhoR-N fragment; 4: PhoR-C fragment.

圖2PhoP和PhoR基因上下游片段PCR擴增結果

Fig.2PCR amplification of fragments upstream and downstream of PhoP and PhoR genes

M: DNA marker Ⅲ; 1: Kan gene fragment.

Fig.3PCR amplification of fragments upstream and downstream of Kan gene

將獲得的PhoP-N、Kan、PhoP-C和PhoR-N、Kan、PhoR-C以及PhoP-N、Kan、PhoR-C分別按比例1∶2∶1混合，經首輪SOE-PCR循環反應可得到3組融合片段。3組融合片段分別作為第二輪PCR循環反應的模板并加入相應上、下游引物引物PhoP-N-F、PhoP-C-R和PhoR-N-F、PhoR-C-R以及PhoP-N-F、PhoR-C-R進行普通PCR循環反應擴增，從而獲得缺失突變片段PhoP-K、PhoR-K以及PhoPR-K(圖4)。

M: DNA marker Ⅲ; 1: PhoP-K fragment; 2: PhoR-K fragment; 3: PhoPR-K fragment.

圖4SOE-PCR構建 PhoP和PhoR基因上下游突變片段的結果

Fig.4Construction of the mutant fragments upstream and downstream of the PhoP and PhoR genes by SOE-PCR

2.2PhoP、PhoR和PhoPR缺失突變載體的構建

及鑒定 以各缺失突變片段、pMD 19-T Vector、Solution Ⅰ混合，進行片段與T Vector的連接，并將連接產物轉入E.coliDH5α感受態，涂布于卡那霉素(100 μg/mL)及氨芐霉素(50 μg/mL)的LB雙抗固體培養基，經培養得到若干陽性克隆(圖5)；以pMD 19-T Vector、Solution Ⅰ混合作為陰性對照1組與缺失突變片段進行連接，并轉入E.coliDH5α感受態，涂布于卡那霉素(100 μg/mL)及氨芐霉素(50 μg/mL)的LB雙抗固體培養基，經培養無E.coli生長，進而證實pMD 19-T Vector未發生載體自連現象；以去離子水、Solution Ⅰ混合作為陰性對照2組與缺失突變片段進行連接，并轉入E.coliDH5α感受態，涂布于卡那霉素(100 μg/mL)及氨芐霉素(50 μg/mL)的LB雙抗固體培養基，經培養無E.coli生長，進而證實培養基所添加的抗生素活性良好。

A: Positive clones of deletion mutant vector with PhoP-K; B: Positive clones of deletion mutant vector with PhoP-K; C: Positive clones of deletion mutant vector with PhoP-K.

圖5氨芐霉素/卡那霉素雙抗培養基篩選缺失突變載體

Fig.5Screening of transformed strains with deletion mutant in Amp/Kan resistant plate

挑取各組的單個陽性克隆接種于含有卡那霉素(100 μg/mL)及氨芐霉素(50 μg/mL)的LB雙抗液體培養基，37 ℃震蕩過夜培養。第二天，分別以各組的菌液為模板，使用相應上、下游引物PhoP-N-F、PhoP-C-R和PhoR-N-F、PhoR-C-R以及PhoP-N-F、PhoR-C-R進行菌落PCR擴增，分別得到擴增產物PhoP-K、PhoR-K以及PhoPR-K。分別提取各組質粒送至基因公司測序，測序結果與預期一致。因此，PhoP、PhoR和PhoPR缺失突變載體構建成功，分別命名為T-PhoP、T-PhoR和T-PhoPR。

3討論

結核病是一種古老的傳染性疾病，也是一種人獸共患傳染病。直到19世紀80年代初，結核病的病原菌為結核分枝桿菌這一事實才被德國科學家Robert Koch發現并證明，從此拉開了結核病研究的帷幕[8]。我國于2010年在全國開展了第五次結核病流行病學調査，調查結果顯示15歲及以上人群活動性肺結核的患病率為459/10萬，涂陽肺結核患病率為66/10萬，耐多藥率為6.8%(19/280)[9]。中國作為22個結核病高負擔國家之一， 2015年世界衛生組織所公布的全球結核病報告指出，我國新發耐多藥結核病率為19%，復發耐多藥結核病率為54%[10]。

基因敲除(gene knockout)技術屬于反向的遺傳學研究方法之一，通過特定技術使得生物體某個基因精確失活或缺失，與野生型生物體表型進行比對，并依據其變化而認識該基因的功能[11]，是基因功能研究中常用的方法之一[12]。對于病原菌某個基因的未知功能研究，快速且高效地成功構建該基因缺失突變菌株，可以顯著提高該基因在致病機制或耐藥機制等方面的功能研究的效率。結核分枝桿菌是一種胞內寄生菌，目前的研究顯示其菌體內未發現質粒存在，且大部分其他來源的質粒也不能在其菌體內進行復制。故而，這些質粒均能夠成為構建結核分枝桿菌某個基因突變株時所需的自殺載體。

高效自殺載體系統是上世紀80年代發展起來的染色體修飾技術，其基本原理是構建含一定長度同源DNA片段的重組自殺質粒，利用宿主自身的重組系統在同源重組序列間交換，由于自殺性載體的性質，在二次重組過程中進一步丟失上述重組質粒而完成重組[13]，該系統具有宿主范圍廣、可轉移等特點[14]。pMD 19-T Vector是一種由pUC19質粒改建而來的PCR產物高效克隆載體，是兩側的3’端添加“T”的線性化T載體?；诖蠖鄶的蜔嵝訢NA聚合酶進行PCR循環反應時均在所得到的PCR產物3’末端添加“A” 的特點，所以pMD 19-T Vector能夠顯著提高與PCR產物的連接效率。由于其自身質粒的特點，即只能夠在大腸埃希菌菌屬中復制，因此，可作為自殺質粒應用于結核分枝桿菌目的基因缺失突變菌株的構建。

融合PCR(SOE-PCR)技術通過具有互補末端的引物使得PCR產物形成重疊鏈，并通過擴增反應中的不斷延伸，從而將不同來源的片段進行拼接融合。在本實驗中，首先通過SOE-PCR技術將待缺失基因上、下游的同源片段與卡那霉素抗性基因融合在一起，構建突變片段。由于在SOE-PCR第二輪擴增時使用的是Taq酶，因此PCR產物的3’末端自動加“A”尾，從而與T載體連接以得到含有卡那霉素抗性的突變載體。本實驗結果表明利用該方法能夠在體外進行高效連接，且不需要酶切處理后再連接的過程，明顯簡化了操作步驟，縮短了實驗時間，提高了成功效率。

本實驗利用SOE-PCR技術、T載體克隆技術構建結核分枝桿菌PhoPR雙組分系統的缺失突變載體，證明了該方法的可行性。與此同時，該方法較傳統方法來說，不僅操作簡便，無需酶切連接等步驟，而且僅需一次篩選即可得到突變載體，具有明顯的高效性。該方法的成功應用，為結核分枝桿菌突變載體的構建提供了快速有效的手段，從而為構建結核分枝桿菌突變菌株提供便利，也為結核分枝桿菌PhoPR雙組分系統功能研究奠定基礎。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.013

通訊作者：張萬江，Email:zwj1117@sina.com

中圖分類號：R378.91

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)03-0276-05

Corresponding author:Zhang Wan-jiang, Email: zwj1117@sina.com

收稿日期：2015-10-21；修回日期:2016-02-06

Establishment of an efficient method for deletion mutant vectors of PhoPR TCS in Mycobacterium tuberculosis by SOE-PCR and T vector cloning

WANG Jun,WU Fang,LIU Xiao-ling,LIANG Su,ZHANG Pei-pei,ZHANG Le,WU Jiang-dong,CAO Xu-dong,ZHANG Wan-jiang

(DepartmentofPathogenBiologyandImmunology,CollegeofMedicine/XinjiangKeyLaboratoryofEndemicandEthnicDisease/CenterofCollaborativeInnovationforHighZoonoticInfectiousDiseasePreventioninWesternRegionofXinjiangProductionandConstructionCorps,ShiheziUniversity,Shihezi832002,China)

Abstract:To establish a method for obtaining deletion mutant vectors of PhoPR TCS in M. tuberculosis, the upstream and downstream homologous arms of PhoP gene, PhoR gene and PhoPR gene were combined with kanamycin resistance gene by SOE-PCR, respectively. The fragment was connected to T vector and transfered into E. coli DH5α competent cell. Then the resistant colone was screened out, and then the deletion mutant vectors of PhoP, PhoR and PhoPR in M. tuberculosis were obtained. Results indicated that the deletion mutant vectors of PhoPR TCS were constructed successfully in a short time. It is a rapid and efficient method compared with the traditional method. In conclusion, the deletion mutant vectors constructed by SOE-PCR and T vector in this study would lay the foundation for the further study on constructing mutant strain of M. tuberculosis and related research.

Keywords:Mycobacterium tuberculosis; T vector; deletion mutant vector; construction

國家自然科學基金項目(No. 81260261，81160192)；石河子大學高層次人才啟動專項(No.RCZX201446)