布魯氏菌S2菌殼的安全性和免疫學(xué)特性研究

苗玉強，劉　軍，孫　洋，紀(jì)　雪，祝令偉，周　偉，郭學(xué)軍，劉　爽，陳　萍，馮書章

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布魯氏菌S2菌殼的安全性和免疫學(xué)特性研究

苗玉強1,2，劉軍2，孫洋2，紀(jì)雪2，祝令偉2，周偉2，郭學(xué)軍2，劉爽2，陳萍1，馮書章2

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春130118；2.解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長春130122

摘要：目的利用小鼠模型對布魯氏菌菌殼、布魯氏菌S2活菌和福爾馬林滅活菌的安全性和免疫學(xué)特性進(jìn)行比較研究。方法利用豬布魯氏菌S2株和重組裂解質(zhì)粒制備出布魯氏菌菌殼，將布魯氏菌菌殼、布魯氏菌S2活菌和福爾馬林滅活菌通過腹腔注射免疫小鼠，進(jìn)行安全性比較分析。監(jiān)測免疫后小鼠的血清抗體水平、脾臟T淋巴細(xì)胞分型，并進(jìn)行免疫攻毒實驗。結(jié)果與布魯氏菌弱毒疫苗菌株S2比較，布魯氏菌菌殼具有更好的安全性，免疫小鼠后能產(chǎn)生與弱毒菌株相似的血清抗體水平、脾CD3+和CD4+ T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，并具有與之相當(dāng)?shù)拿庖弑Ｗo(hù)作用。結(jié)論布魯氏菌菌殼具有良好的安全性，能刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，可作為預(yù)防布魯氏菌病的新型候選疫苗。

關(guān)鍵詞：布魯氏菌；菌殼；安全性；免疫原性

Funded by the Scientific and Technological Development Projects of Jilin Province (No. 20100231) and the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest of China (No. 201303042)

布魯氏菌(Brucella)是一種危害嚴(yán)重的人獸共患胞內(nèi)寄生病原菌。布魯氏菌可引起人、家畜、野生動物、甚至海洋哺乳動物的布魯氏菌病[1]，主要癥狀為發(fā)熱、流產(chǎn)、不育、慢性關(guān)節(jié)炎及神經(jīng)損傷等。布魯氏菌病流行范圍廣、傳染性強，嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展，導(dǎo)致世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失和公共衛(wèi)生問題[2]。我國從1995年起，人布魯氏菌病病例逐年增加[3]，2010年有35 000人布魯氏菌病病例[4]。據(jù)統(tǒng)計，大約有85%人布病是由于接觸了布魯氏菌感染的羊所引起[5]。

目前臨床上預(yù)防布魯氏菌病的疫苗均是弱毒活疫苗，具有一定的毒副作用，全球許多實驗室正在致力于開發(fā)布魯氏菌病新型疫苗[6]。菌殼(Bacterial ghosts)是近年來頗受關(guān)注的一種新型細(xì)菌滅活方法。菌殼一般通過噬菌體PhiX174的裂解酶E基因在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)制備而成。菌殼保留了原始細(xì)菌的脂多糖、脂質(zhì)A和肽聚糖等天然的外膜結(jié)構(gòu)和表面抗原，具有很好的免疫原性，因此，菌殼是一種具有良好應(yīng)用前景的滅活疫苗[7]。本實驗室利用廣宿主穿梭質(zhì)粒和裂解基因E成功制備了豬布魯氏菌S2菌殼[8]和粗糙型羊布魯氏菌菌殼[9]，在此基礎(chǔ)上，本研究利用小鼠模型進(jìn)一步對豬布魯氏菌S2菌殼的安全性和免疫學(xué)特性進(jìn)行研究，評價其安全性、免疫原性和對小鼠模型的免疫保護(hù)作用，為將來研制布魯氏菌菌殼疫苗提供數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1菌株豬布魯氏菌S2株、重組布魯氏菌S2(pBBR1MCS-E)均由本實驗室保存或構(gòu)建[8]。

1.2實驗動物6-8周齡雌性BALB/c小鼠(清潔級)，體重約18～20 g/只，購自長春市生物制品研究所。

1.3主要試劑辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)；羊抗鼠CD3e PerCP-Cy5.5、CD4 FITC和CD8a PE為eBioscience公司產(chǎn)品；TSB培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.4布魯氏菌S2菌液、布魯氏菌菌殼和布魯氏菌甲醛滅活液的制備

1.4.1布魯氏菌S2菌液的制備將1mL新鮮培養(yǎng)的布魯氏菌S2接種到100 mL TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。然后于4℃，6 000r/min離心10 min。沉淀用生理鹽水洗滌沉淀2次，用原始菌液等量的生理鹽水重懸待用。

1.4.2布魯氏菌S2菌殼(BrucellasuisS2 ghosts，BSG)的制備將1 mL新鮮培養(yǎng)的布魯氏菌S2(pBBR1MCS-E)接種到100 mL TSB液體培養(yǎng)基(Kan 100 μg/mL)，28℃振蕩培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)移至42 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)48 h。然后于4 ℃，60 00 r/min離心10 min。沉淀用5% NaCl溶液凍融2次，用生理鹽水洗滌2次，然后用原始菌液等量的生理鹽水重懸，分裝后于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3布魯氏菌S2甲醛滅活液(formalin-killedBrucella，F(xiàn)KB)的制備將1 mL新鮮培養(yǎng)的布魯氏菌S2接種到100 mL TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后，加入甲醛溶液至終濃度為0.4%，37 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)48 h。然后于4 ℃，60 00 r/min離心10 min。沉淀用生理鹽水洗滌2次，用原始菌液等量的生理鹽水重懸，分裝后于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4布魯氏菌菌殼和甲醛滅活液中的細(xì)胞計數(shù)按文獻(xiàn)[10]進(jìn)行，具體方法：將制備的布魯氏菌菌殼和布魯氏菌甲醛滅活液進(jìn)行10倍梯度稀釋后，取清潔的Neubauer計數(shù)板，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片，將稀釋后的液體加入計數(shù)室，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行計數(shù)，計算每毫升液體中的細(xì)胞數(shù)。

1.5布魯氏菌S2菌殼的安全性實驗將BABL/c小鼠，隨機分為7組，每組10只。其中6組小鼠分別腹腔注射布魯氏菌S2菌液、布魯氏菌S2菌殼(BSG)和布魯氏菌S2甲醛滅活液(FKB)，每個樣品注射2組。第7組小鼠腹腔注射生理鹽水作為陰性對照，注射總體積均為200 μL/只小鼠。分組和注射劑量見表1所示。觀察小鼠臨床癥狀，記錄小鼠體重變化。注射2周以后，將小鼠斷頸處死，摘取小鼠的脾臟，稱重。

1.6布魯氏菌S2菌殼的免疫原性實驗

1.6.1免疫小鼠6-8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機分為4組，每組10只。其中3組小鼠分別腹腔注射布魯氏菌S2、BSG和FKB，第4組小鼠腹腔注射生理鹽水作為陰性對照。S2菌注射免疫劑量為106CFU/只小鼠，BSG和FKB注射免疫劑量相當(dāng)于原活菌量為107CFU/只小鼠。每組小鼠均注射免疫2次，注射間隔為4周。

1.6.2小鼠血清抗體水平的檢測每組免疫小鼠取5只，初次免疫后，每隔1周對小鼠斷尾采血，分離血清，以生理鹽水注射組小鼠血清為陰性對照，用ELISA方法測定血清中IgG抗體效價。將布魯氏菌S2培養(yǎng)液離心后用包被液洗滌、重懸、稀釋后，加入到ELISA板包被，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，檢測血清IgG抗體效價。

1.6.3小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞型分析每組免疫小鼠取5只，末次免疫后第14 d，將小鼠斷頸處死，無菌摘取小鼠脾臟進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞型分析。用200目的尼龍網(wǎng)篩分離脾淋巴細(xì)胞，Tris-NH4C1室溫作用5 min破碎紅細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞。用臺盼藍(lán)染色計算活細(xì)胞數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106cells/mL。試驗組和對照組小鼠脾淋巴細(xì)胞各取100 μL細(xì)胞懸液，分別加入3種標(biāo)記抗體(羊抗鼠CD3e PE-Cy5、CD4 FITC和CD8a PE)各5 μL，室溫孵育20 min。用預(yù)冷的PBS洗滌后，加入0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀(FCM)進(jìn)行檢測。每個樣品檢測10 000個細(xì)胞，分析T淋巴細(xì)胞亞型比例。

1.7布魯氏菌S2菌殼的免疫攻毒實驗6-8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機分為3組，每組5只。3組小鼠分別腹腔注射布魯氏菌S2(陽性對照)、BSG和PBS(陰性對照)。S2菌注射免疫劑量為106CFU/只小鼠，BSG注射免疫劑量相當(dāng)于原活菌量為107CFU/只小鼠。每組小鼠均注射免疫2次，注射間隔為4周。注射免疫2周后，用馬爾他布魯氏菌16M(B.melitensis16M)腹瀉注射攻毒，攻毒劑量為105CFU/只小鼠。攻毒2周后，將所有小鼠斷頸處死，無菌摘取脾臟，按文獻(xiàn)[11]方法統(tǒng)計比較不同組小鼠脾臟載菌量。

2結(jié)果

2.1布魯氏菌S2菌殼對小鼠的安全性實驗注射布魯氏菌S2、布魯氏菌菌殼(BSG)和福爾馬林滅活菌(FKB)后，小鼠的臨床癥狀見表1所示，各組小鼠體重變化曲線見圖1所示。結(jié)果表明，注射S2組小鼠出現(xiàn)體重急劇下降、精神沉郁、聳毛、顫抖、死亡等臨床表現(xiàn)，其中108CFU劑量組小鼠全部死亡。而

注射BSG和FKB組小鼠與陰性對照組小鼠相似，均未出現(xiàn)明顯臨床癥狀，體重變化曲線一致。說明布魯氏菌S2菌殼對小鼠具有良好的安全性。

圖1注射布魯氏菌小鼠S2、布魯氏菌菌殼(BSG)和福爾馬林滅活菌(FKB)小鼠平均體重變化曲線

Fig.1Mean weights of mice following injection ofB.suisS2,B.suisghosts (BSG) and formalin-killedB.suis(KFB)

實驗小鼠平均脾臟重量見表1所示，S2組小鼠脾臟表現(xiàn)極度腫大，平均脾臟重量約為0.406 g，與其它組差異顯著；FKB組和BSG小鼠脾臟無腫大現(xiàn)象，平均脾臟重量與陰性對照組相似，無顯著差異。

表1　不同劑量豬布魯氏菌S2、布魯氏菌菌殼(BSG)和福爾馬林滅活菌(FKB)對小鼠的致病性

a Dosages of BSG and FKB are presented as the number of corresponding dead bacteria.

b A: Depression; B: ruffled hair; C: trembling; D: death (all death happened in 4 days after injection.); None: no clinical symptoms.

2.2小鼠血清抗體水平檢測從S2、BSG和FKB免疫組小鼠血清中均能檢測到特異性抗體，BSG組小鼠免疫后第6～7周血清抗體效價達(dá)到最高(圖2)。BSG免疫組小鼠抗體效價略高于布魯氏菌S2免疫組小鼠，二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。BSG免疫組小鼠和S2免疫組小鼠的血清抗體效價顯著高于FKB組小鼠的血清抗體效價。結(jié)果表明布魯氏菌菌殼可刺激機體產(chǎn)生與活疫苗S2相似的體液免疫水平。

2.3小鼠T淋巴細(xì)胞亞群分析各組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞經(jīng)處理后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果T淋巴細(xì)胞亞群比例見表2所示。與FKB免疫組小鼠和陰性對照組比較，BSG免疫組和S2免疫組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞中CD3+和CD4+細(xì)胞比例顯著升高，而BSG免疫組與S2免疫組的CD3+和CD4+細(xì)胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2　腹腔注射組小鼠血清抗體水平

Fig.2Induction of specific IgG antibodies by different vaccine preparation

表2　實驗小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果(%) ±s)

Note:*Compared with the control saline group,P<0.05.

2.4免疫攻毒實驗用布魯氏菌16M株攻毒后，各組小鼠的脾臟載菌量如表3所示。其中BSG組和S2免疫組小鼠的脾臟載菌量顯著低于PBS對照組。BSG組和S2組的保護(hù)單位(Units of protection)分別為1.54和1.74，兩組小鼠的脾臟載菌量無顯著差異，說明布魯氏菌菌殼具有與活疫苗S2相似的免疫保護(hù)效果。

表3小鼠免疫攻毒實驗結(jié)果

Tab.3Protection against B. melitensis 16M provided to BALB/c mice by vaccination with B. suis S2 ghosts

Treatmentgroup(n=5)Log10CFUofB.melitensis/spleenaUnitsofprotectionbBrucellaghosts(BSG)3.54±0.0251.54cBrucellavaccineS23.34±0.1711.74cPBScontrol5.08±0.121-

Note:aThe number of bacteria in spleens (CFU/spleen) is represented as the mean logCFU SD per group.

bUnits of protection were obtained by subtracting the mean log CFU/spleen of the vaccinated group from the mean log CFU/spleen of the control (PBS) group.

cSignificantly different compared to PBS controls group (P< 0.05).

3討論

免疫預(yù)防是防控布病疫情的最佳方法之一，當(dāng)前臨床使用的疫苗均為弱毒活疫苗，普遍存在著一定毒副作用，尤其對于孕畜及幼齡動物更是如此。

豬布魯氏菌S2株是在我國廣泛使用的活疫苗菌株，2011年已完成了該菌株的全基因組測序[12]。由于布魯氏菌S2株屬于弱毒活疫苗，仍然具有一定的毒力，在臨床使用上還存在安全隱患。本實驗室利用重組穿梭裂解質(zhì)粒成功制備出了布魯氏菌S2菌殼[8]。布魯氏菌菌殼屬于滅活疫苗，理論上其安全性應(yīng)優(yōu)于弱毒活疫苗，本研究對布魯氏菌菌殼與活疫苗S2安全性的比較研究也證實，布魯氏菌菌殼的安全性顯著高于活疫苗S2菌株，即使菌殼的接種劑量高于S2劑量的100倍以上，其對小鼠的影響仍然顯著小于S2。布魯氏菌菌殼的安全性與甲醛滅活菌的安全性相當(dāng)。

國內(nèi)外對于評價布魯氏菌病疫苗的常用方法為計算脾臟載菌量[13-14]，本研究也采用攻毒后計算小鼠脾臟載菌量的方法評價布魯氏菌菌殼的免疫保護(hù)效果，并檢測免疫小鼠的血清抗體水平和脾臟T淋巴細(xì)胞分型。小鼠血清抗體IgG檢測結(jié)果表明，布魯氏菌菌殼與S2活菌刺激小鼠產(chǎn)生的抗體水平相當(dāng)，均顯著高于FKB免疫組和陰性對照組。說明腹腔注射后布魯氏菌菌殼可刺激機體產(chǎn)生與活疫苗S2水平相似的體液免疫反應(yīng)。小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞型分析表明，布魯氏菌菌殼與活疫苗S2都能有效激活小鼠的細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且這者之間的細(xì)胞免疫水平并無顯著差異。

用布魯氏菌16M株攻毒后，布魯氏菌菌殼免疫組和活疫苗S2免疫組小鼠的脾臟載菌量顯著低于對照組，兩組小鼠的脾臟載菌量無顯著差異，其免疫保護(hù)單位(Units of protection)分別為1.54和1.74，說明布魯氏菌菌殼具有與活疫苗S2相當(dāng)?shù)拿庖弑Ｗo(hù)作用。

綜合本研究結(jié)果，與布魯氏菌S2活疫苗菌株比較，布魯氏菌菌殼具有更好的安全性和與之相當(dāng)?shù)拿庖弑Ｗo(hù)效果，可以作為預(yù)防布魯氏菌病的新型候選疫苗，但布魯氏菌菌殼作為疫苗的有效性和特異性免疫機制還有待深入研究。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.008

通訊作者：馮書章，Email: shuzhangf@yahoo.com；

中圖分類號：R378.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)03-0251-05

Corresponding author:Liu Jun, Email: liujunbio@yahoo.com

收稿日期：2015-04-15；修回日期:2016-01-28

Safety and immunogenicity of Brucella suis strain S2 ghosts

MIAO Yu-qiang1,LIU Jun2,SUN Yang2,JI Xue2,ZHU Ling-wei2,ZHOU Wei2,GUO Xue-jun2,LIU Shuang2,CHEN Ping1,FENG Shu-zhang2

(1.FoodScienceandEngineering,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.InstituteofMilitaryVeterinaryScience,theAcademyofMilitaryMedicalScienceofPLA,Changchun130122,China)

Abstract:With the purpose of investigating the safety and immunogenicity of Brucella suis strain S2 bacterial ghosts as a vaccine candidate, the recombinant strain S2(pBBR1MCS-E) was used for production of B. suis ghosts (BSG). The safety and immunogenicity of BSG were evaluated by using a murine model. The results suggested that BSG was as safe as formalin-killed B. suis. Compared with the B. suis strain S2, BSG demonstrated similar capacity of inducing pathogen-specific serum IgG antibody response, spleen CD3+ and CD4+ T cell responses, as the attenuated B. suis live vaccine. The results of mice immunization and infection showed that BSG could significantly reduce the number of bacteria in the spleens. These data suggest that Brucella ghosts could confer protection against Brucella infection and may be developed as a new vaccine candidate against Brucella infection.

Keywords:Brucella; bacterial ghosts; safety; immunogenicity

吉林省科技發(fā)展計劃資助項目(20100231)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303042)

劉軍，Email: liujunbio@yahoo.com