淡色庫蚊氨肽酶N基因的克隆及生物信息學分析

郭秀霞,程　鵬,楊培培,王海防,劉麗娟,張崇星,王懷位,公茂慶

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淡色庫蚊氨肽酶N基因的克隆及生物信息學分析

郭秀霞,程鵬,楊培培,王海防,劉麗娟,張崇星,王懷位,公茂慶

山東省醫學科學院，山東省寄生蟲病防治研究所，濟寧272033

摘要：目的克隆淡色庫蚊Bt毒素受體氨肽酶N(Aminopeptidase N，APN)基因，并對基因及編碼蛋白進行生物信息學分析。方法提取淡色庫蚊RNA，通過RT-PCR擴增氨肽酶N基因的全長cDNA序列，純化PCR產物連接至pMD19-T載體，陽性重組質粒經PCR鑒定后進行基因測序。生物信息學分析APN基因的序列同源性及編碼蛋白的結構特征。結果該基因cDNA序列全長為1 383 bp(含終止密碼子)，編碼460個氨基酸，與致倦庫蚊XM_001862270.1序列的同源性為100%。預測蛋白質分子量為52.9 kDa，等電點為4.98。前21個氨基酸為N-末端的信號肽，存在2個N-糖基化位點(93NLT95和169NVS171)。具有肽酶家族M1的序列特征、鋅結合位點HEXXH和谷氨酸鋅化氨肽酶的保守結構GAMEN。結論成功克隆了淡色庫蚊氨肽酶N基因并對APN蛋白進行生物信息學分析，為進一步探討淡色庫蚊APN的功能及Bt毒素作用機制奠定了基礎。

關鍵詞：淡色庫蚊；氨肽酶N；克隆；生物信息學

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81271877)

淡色庫蚊(Culexpipienspallens)是我國北方入室吸血騷擾的主要蚊種，是班氏絲蟲病和流行性乙型腦炎的重要媒介，嚴重危害人類健康[1-2]。生物防治是蚊蟲防治的重要方法，由于其不污染環境，成本低，效果好等優勢，為人們所關注。以蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis, Bt)以色列變種和球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus, Bs)為主的細菌制劑是在全球范圍內普遍應用的有效的生物防治手段，然而包括五帶淡色庫蚊和埃及伊蚊在內的多種昆蟲對Bt產生抗性的問題也不斷引起人們的重視[3]。氨肽酶N(APN)是位于昆蟲中腸刷狀緣膜囊泡(BBMV)上Bt Cry 毒素的特異性受體，在Bt毒素作用于靶標害蟲中的作用非常重要。昆蟲產生Bt抗性的能力以及Bt Cry毒素的殺蟲活性取決于APN與Bt Cry 毒素之間的結合能力[4]。本研究通過提取淡色庫蚊幼蟲的RNA，RT-PCR克隆淡色庫蚊氨肽酶N基因的cDNA全長序列，并對其基因序列及編碼的蛋白進行相應的生物信息學分析，獲得該基因的序列特征，為進一步探討該蛋白的生物學功能及Bt毒素作用機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1蚊蟲樣本淡色庫蚊(敏感種群)來自山東省疾控中心，在實驗室連續飼養，未接觸任何殺蟲劑。蚊飼養條件：溫度26 ℃～28 ℃，相對濕度75%～85%，光照14 h/d的室內，用小白鼠飼喂來產卵傳代。

1.1.2試劑RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；RT-PCR試劑盒、pMD19-T Vector試劑盒、大腸埃希菌感受態細胞EscherichiacoliJM109、DNA分子質量標準(DL-2000、1kbp Ladder )、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；質粒小提試劑盒和凝膠回收試劑盒購于Axygen公司；其余試劑為國產分析純。

1.2方法

1.2.1總RNA提取及第一鏈cDNA的合成取單只淡色庫蚊3齡幼蟲中腸放入無RNase的勻漿器中加入液氮進行充分研磨，根據RNA提取試劑盒(購自QIAGEN公司)的操作步驟提取總RNA，進行1%瓊脂糖凝膠電泳并測定其OD260/OD280值和濃度。以Oligo(dT)15為逆轉錄引物，在反轉錄酶的作用下催化第一鏈cDNA的合成。

1.2.2淡色庫蚊APN基因的克隆根據GenBank中收錄的致倦庫蚊氨肽酶N核苷酸序列(XM_001862270.1)設計引物，上游引物：5′-ATGATGAGAAATGGTCTCGC-3′；下游引物：5′-TTATAAATCGTCCGGATCGTAC-3′。以第一鏈cDNA為模板進行PCR反應，擴增目的基因片段。采用50 μL反應體系：ddH2O 38.5 μL、 10×LA PCR Buffer 5 μL、10 mmol/L dNTP 1 μL 、模板1 μL、LA Taq聚合酶0.5 μL、上下游引物各2 μL。反應條件：94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3PCR產物純化及測序用DNA片段純化/回收試劑盒對目的DNA片段進行純化，將純化后的基因片段連接到pMD-19T simple Vector上，然后轉化至大腸埃希菌感受態細胞E.coliJM109，并將轉化菌涂布到含有氨芐西林的LB固體培養平板上，37 ℃培養過夜，挑取單菌落進行菌體PCR鑒定，陽性克隆搖菌培養并送Invitrogen公司測序。

1.2.4淡色庫蚊APN基因的序列分析及系統進化樹構建將測序結果在NCBI上進行BLAST比對(http://www.ncbi.nlm.gov/blast/)，搜集GenBank中收錄的致倦庫蚊、斯氏按蚊、岡比亞按蚊和埃及伊蚊等的氨肽酶N的氨基酸序列，運用DNAMAN6.0軟件、ClustalX 1.81和Mega4.0軟件進行序列比對，繪制生物進化樹。

1.2.5淡色庫蚊APN基因編碼蛋白的生物信息學分析根據核苷酸序列推導出編碼氨基酸序列，利用ExPASy在線分析APN的結構特征，應用ProtParam、SignalP3.0 Server、SWISSMODEL等不同的分析方法，對氨基酸序列的分子量和等電點、結構域、物理參數、序列特征、三級結構等進行分析和預測。

2結果

2.1總RNA提取利用RNA提取試劑盒提取總RNA，獲得的RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳(圖1)，并測定其OD260/OD280值和濃度。電泳條帶顯示，提取的淡色庫蚊的總RNA樣品質量較好，18S rRNA的亮度大約是28S rRNA的兩倍，產物未被RNase降解；微量紫外分光光度儀測定純度，并對其進行定量，結果顯示1.9

M:DL 2 000 DNA Ladder Marker;1-2：淡色庫蚊幼蟲總RNA

M:DL 2 000 DNA ladder marker; Lane 1-2: The RNA ofGulexpipienspallenslarva.

圖1淡色庫蚊幼蟲總RNA電泳圖

Fig.1RNA of Gulex pipiens pallens larva

2.2淡色庫蚊APN全長cDNA的克隆采用兩步法進行RT-PCR反應。第一步反應，在逆轉錄酶的作用下將淡色庫蚊RNA反轉錄為cDNA。第二步反應，以上述獲得的cDNA為模板，利用設計合成的引物進行PCR，擴增淡色庫蚊的APN基因。進行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR的擴增情況。電泳可發現在2 000 bp下方有一條亮的DNA條帶，與APN預期分子量大小相符，如圖2所示。

M: DL 2 000 DNA Ladder Marker;1-2: 淡色庫蚊APN PCR擴增產物;

M: DL 2 000 DNA ladder marker; Lanes 1-2: AmplifiedCpapngene.

圖2PCR產物電泳圖

Fig.2Analysis of PCR amplified Cpapn gene from RNA

2.3菌落PCR鑒定及測序將純化的PCR產物與pMD-19T simple Vector連接并轉化E.coliJM109，37 ℃過夜培養后挑選單菌落進行PCR鑒定，陽性克隆送Invitrogen公司測序。

2.4淡色庫蚊APN基因序列分析及系統進化樹構建測序結果表明，淡色庫蚊氨肽酶N基因cDNA片段全長1 383 bp(含終止密碼子)，其中GC含量為55.8%，AT含量為44.2%，A占23.7% ，C占27.5% ，G占28.3% ，T占20.5%。該基因可編碼的氨基酸為460個，預測蛋白質的分子量為52.9 kDa，等電點為5.98。推測分子式為C2390H3674N632O685S23,半衰期為30 h，不穩定系數39.19，為穩定蛋白，脂肪系數84.63，總平均親水性為-0.256。將測序結果與GenBank中收錄的基因進行Blast同源序列比對，核苷酸序列同XM_001862270.1序列的同源性為100%。將獲得的氨基酸序列與GenBank中收錄的岡比亞按蚊、斯氏按蚊、埃及伊蚊和致倦庫蚊等的氨肽酶N序列進行序列比對，繪制進化樹并進行分析，發現這幾類蚊種的氨肽酶N分屬于不同的分支。如圖3所示。

2.5淡色庫蚊APN基因編碼蛋白質生物信息學分析對該蛋白的二級結構預測發現，α螺旋占49.35%，β轉角為6.30%，無規則卷曲占30.22%。經過Expasy在線分析，前21個氨基酸為N-末端的信號肽，C-末端沒有潛在的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨信號肽。該氨基酸序列存在2個N-糖基化位點(93NLT95和169NVS171)，沒有O-糖基化位點，預測該蛋白有兩個跨膜區(77-100和347-375)。該氨基酸存在肽酶家族M1的序列特征、鋅結合位點HEXXH和谷氨酸鋅化氨肽酶的保守結構GAMEN(圖4)。應用Swissmodel在線分析對該蛋白進行結構建模，其三維結構如圖5所示。

3討論

蘇云金桿菌是目前應用前景最為廣泛的微生物殺蟲劑，通常認為其作用機制是產生的毒素晶體蛋白與昆蟲中腸受體相互作用，使細胞膜形成穿孔而導致昆蟲死亡[5]。位于昆蟲中腸的Bt毒素受體有氨肽酶N、鈣黏蛋白、糖脂類、堿性磷酸酶等，其中，氨肽酶N是研究較多的Bt毒素受體[6]。氨肽酶N(APN)是一種鋅離子依賴性的蛋白水解酶，屬于金屬蛋白酶Ml家族中的gluzincins亞族，以同源二聚體的形式存在于細胞膜上，能夠從蛋白質多肽鏈的N末端降解中性或堿性氨基酸，從而激活體內一系列重要的生化反應過程。APN結構中含有多個糖基化位點，可以與不同細胞因子結合而發揮細胞信號傳導或者受體的作用。近年來，APNs也被認為是瘧疾傳播阻斷疫苗研發的最有潛力的蛋白[7]。

本實驗以淡色庫蚊為研究對象，成功提取了淡色庫蚊總RNA，通過RT-PCR反應獲得cDNA，然后以cDNA為模板擴增得到了淡色庫蚊氨肽酶N的基因編碼序列。序列測定結果分析表明淡色庫蚊氨肽酶N基因編碼序列全長約1 383 bp(含終止密碼子)，編碼460個氨基酸，預測蛋白質分子量為52.9 kDa，等電點為4.98。通過同源序列比對分析，核苷酸序列同XM_001862270.1序列的同源性為100%。將獲得的氨基酸序列與GenBank中收錄不同蚊種及果蠅的部分的氨肽酶N序列進行多物種同源性序列比對，圖中藍黑色區域為完全保守區域，藍色和粉色區域為相似區域，對這些保守區域和相似區域的分析預測，可以為進一步研究氨肽酶N的各功能位點提供一定的實驗依據。繪制系統進化樹并進行分析，發現這幾類蚊種的氨肽酶N分屬于不同的分支，其中按蚊屬為獨立分支，與庫蚊屬、伊蚊屬分屬于不同的分支，淡色庫蚊與致倦庫蚊的同源性最高，與東方果實蠅屬于同一分支。

本實驗對淡色庫蚊APN基因編碼蛋白二級結構進行預測，結果顯示α螺旋和無規則卷曲占較高比例。蛋白結構及功能分析發現，該蛋白具有昆蟲

注：以上為圖A。藍黑色：高度保守區域；藍色和粉色：相似區域

A.Colour black: highly conserved region; Colour blue and pink: similar region.

A: 不同蚊種氨肽酶N序列比對; B: 氨肽酶N生物進化分析斯氏按蚊(Anophelessinensis) KFB52687.1；岡比亞按蚊(Anophelesgambiae) ACJ10211.1；埃及伊蚊(Aedesaegypti)AGT95897.1；致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)EDS31007.1 XP_001862305.1；東方果實蠅(Bactroceradorsalis)JAC39216.1；

A: Alignment of the derived amino acid sequences of APN with a selected set of homologies from other mosquitoes; B: Phylogenetic analysis of APN from different organisms.AnophelessinensisKFB52687.1;AnophelesgambiaeACJ10211.1;AedesaegyptiAGT95897.1;CulexquinquefasciatusEDS31007.1, XP_001862305.1;BactroceradorsalisJAC39216.1.

圖3不同蚊種的氨肽酶N氨基酸序列比對及進化分析

Fig.3Sequence alignment and evolution analysis of APN

N端信號肽用雙下劃線標出；潛在的N-糖基化位點用單下劃線標出；保守結構GAMAN用虛線標出；鋅結合位點HEXXH結構用三角標出；GPI錨定位點用圓點標出。

Signal peptidase at N-terminal are double underlined. Potential N-glycosylaion sites are single underlined. The conserved GAMAN motif are marked by a broken line. The zinc-binding motif HEXXH are marked by triangle. The GPI anchor point is showed by solid circle.

圖4淡色庫蚊APN基因的cDNA全長及推導出的氨基酸序列

Fig.4Nucleotide and deduced amino acid sequences of Culex pipiens pallens APN gene

圖5　CpAPN三級結構預測

氨肽酶N典型的結構特征，有鋅結合位點HEXXH和谷氨酸鋅化氨肽酶GAMEN的保守結構。APN高度保守的GAMEN基元被認為是形成催化活性位點的一部分[8]。前21個氨基酸為N-末端的信號肽序列，C-末端含有一個具有親脂性和跨膜特性的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定位點，APN正是通過GPI-錨定在BBMV上。該氨基酸序列存在2個N-糖基化位點(93NLT95和169NVS171)，但是不具備O-糖基化位點。三級結構預測分析，N-末端含有一個N-乙酰半乳糖胺結構，該結構能被Cry毒素識別。

目前對APN與Cry毒素作用機制的研究較多，Chen J等通過實驗成功分離了埃及伊蚊APN1，并確定了其與Cry11Aa具有高度的親和性，而與Cry11Ba具有較低的親和力[9]。Zhang R等確定了岡比亞按蚊中一個大小為106 kDa的APN是Cry11Ba的特異性受體，之后在大腸桿菌中表達了岡比亞按蚊的APN2蛋白片段，證實該片段和Cry11Ba有高度的親和力。為了進一步證實APN2的功能位點，APN2蛋白片段被剪切為30 kDa tb和ta片段以及28 kDa片段，發現AgAPN2ta可以使Cry11Ba的毒力降低85%，表明Cry11Ba主要和28 kDa AgAPN2ta發生作用[10-11]。雖然APN的研究取得了一定的進展，但是由于Cry毒素與APNs的結合非常復雜，尚有許多問題有待研究。淡色庫蚊是我國流行性乙型腦炎和班氏絲蟲病的重要傳播媒介，對淡色庫蚊氨肽酶N(APN)的研究國內外尚無相關報道。本研究成功克隆了淡色庫蚊氨肽酶N基因并對其編碼蛋白進行信號肽、保守區域、分子結構、跨膜區等進行分析，由于APN在生物體內的特殊而重要的生物學功能，淡色庫蚊APN的研究為進一步探討Bt毒素的作用機制及Bt抗性機制有重要意義。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.006

通訊作者：公茂慶，Email:maoqingg@yahoo.com

中圖分類號：Q969.44

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)03-0240-06

Corresponding author:Gong Mao-qing, Email: maoqingg@yahoo.com

收稿日期：2015-10-14；修回日期:2016-01-19

Molecular cloning and bioinformatics analysis on aminopeptidase N of Culex pipiens pallens

GUO Xiu-xia,CHENG Peng,WANG Hai-fang,LIU Li-juan,YANG Pei-pei,ZHANG Chong-xing,WANG Huai-wei,GONG Mao-qing

(ShandongInstituteofParasiticDiseases,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jining272033,China)

Abstract:In order to clone the gene of aminopeptidase N (APN), the receptor of Bt insecticidal crystal protein of Culex pipiens pallens, and analyze the biological information of the coding protein, single mosquito larva RNA was extracted from Cx. pipiens pallens and the APN cDNA sequence was amplified by RT-PCR. The PCR products were cloned into the pMD-19T simple vectors and sequenced. The sequence homology and the structural feature of the coding protein were analyzed by biological information systems. Results showed that the full-length of CpAPN was 1 383 bp that encoded a protein of 460 amino acid residues. The homology with Culex quinquefasciatus (XM_001862270.1) was 100%. The predicted molecular weight and isoelectric point were 52.9 kDa and 6.33, respectively. It contained an N-terminal signal peptide with 21 amino acids, and two N- glycosylaion sites (93NLT95and169NVS171), showing the typical characteristics of peptidase family M1, and with the zinc-binding motif HEXXH and the conserved GAMAN motif. Aminopeptidase N gene of Culex pipiens pallens was cloned successfully and analyzed by bioinfomatics technique. The results provided experimental evidence for revealing the function of CpAPN and the insecticidal mechanism of Bt toxin.

Keywords:Culex pipiens pallens; aminopeptidase N; gene cloning; bioinformatics analysis

國家自然科學基金項目(No.81271877)