2型豬鏈球菌Rgg調(diào)控因子的序列結(jié)構(gòu)分析及原核表達(dá)

鄭　峰，劉　鵬，蔡炳岡，朱　進(jìn)，潘秀珍，王長(zhǎng)軍

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2型豬鏈球菌Rgg調(diào)控因子的序列結(jié)構(gòu)分析及原核表達(dá)

鄭峰，劉鵬，蔡炳岡，朱進(jìn)，潘秀珍，王長(zhǎng)軍

南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所，南京210002

摘要：目的克隆2 型豬鏈球菌Rgg轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子編碼基因并進(jìn)行原核表達(dá)和純化，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。方法PCR擴(kuò)增2型豬鏈球菌中國(guó)強(qiáng)毒株05ZYH33基因組的rgg基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30-rgg，轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，篩選陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE 鑒定表達(dá)產(chǎn)物；確定最佳誘導(dǎo)條件后，大量培養(yǎng)誘導(dǎo)重組表達(dá)菌，Ni2+親和層析柱純化重組蛋白，非變性PAGE電泳分析其體外聚合狀態(tài)。結(jié)果整個(gè)Rgg蛋白由15個(gè)α螺旋和2個(gè)β轉(zhuǎn)角組成；構(gòu)建的重組質(zhì)粒在宿主菌中可高效表達(dá)，15 ℃過夜誘導(dǎo)獲得可溶性重組蛋白的比例最高；獲得了較高純度的Rgg重組蛋白，并證實(shí)其在體外可形成同源二聚體。結(jié)論成功地原核表達(dá)并純化了Rgg重組蛋白，證明它存在二聚體結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌；Rgg轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；原核表達(dá)

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2型豬鏈球菌(Streptococcussuisserotype 2，S.suis2)是豬鏈球菌35個(gè)血清型中分布最廣、致病能力最強(qiáng)的一種致病菌，可感染豬和人類引起腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥、肺炎乃至急性死亡，其疫源地主要分布在北歐、東南亞一些養(yǎng)殖和食用豬肉的國(guó)家和地區(qū)[1-3]。我國(guó)1998年和2005年分別在江蘇省和四川省暴發(fā)了S.suis2大規(guī)模感染人和豬的公共衛(wèi)生事件，累計(jì)報(bào)告病例200余例，其中死亡42人[4]，使得S.suis2致病性的研究受到國(guó)內(nèi)外越來越多的關(guān)注。

Rgg家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子廣泛分布于各種革蘭氏陽性菌當(dāng)中。該基因首先于1992年在格氏鏈球菌(S.gordonii)中發(fā)現(xiàn)[5]，之后又在乳酸桿菌和多種鏈球菌中均發(fā)現(xiàn)了與其結(jié)構(gòu)類似的調(diào)控蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，Rgg家族的調(diào)控因子在不同的細(xì)菌中執(zhí)行各種功能，包括控制糖代謝通路、胞外蛋白的分泌、細(xì)菌素的表達(dá)或者細(xì)菌密度感應(yīng)等[6-8]。近年來，學(xué)者們也逐步聚焦于該蛋白的結(jié)構(gòu)功能研究。例如，Loughman等以化膿鏈球菌(S.pyogenes)中的RopB蛋白為模型，證明了3個(gè)保守的氨基酸殘基對(duì)于Rgg 家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能是必需的[9]；Parashar V等成功制備了停乳鏈球菌(S.dysgalactiae)中的Rgg2蛋白晶體，首次解析了Rgg家族蛋白成員的X射線三維晶體結(jié)構(gòu)[10]。本實(shí)驗(yàn)室前期在S.suis2中國(guó)強(qiáng)毒株05ZYH33中對(duì)該基因進(jìn)行了敲除，發(fā)現(xiàn)Rgg的缺失改變了345個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平，占總基因數(shù)的15.87%，并證明它與細(xì)菌的代謝、生長(zhǎng)周期和毒力密切相關(guān)[11]。但是對(duì)于Rgg調(diào)節(jié)因子在S.suis2中的具體調(diào)控機(jī)制，及其特異性調(diào)控轉(zhuǎn)錄的下游基因，我們?nèi)灾跎佟ｈb于此，本研究通過結(jié)構(gòu)域檢索和系統(tǒng)進(jìn)化樹等方法，對(duì)S.suis2的Rgg轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并在大腸桿菌中對(duì)其進(jìn)行體外表達(dá)和純化，為下一步深入研究Rgg 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1質(zhì)粒和菌株菌株S.suis2 05ZYH33為本實(shí)驗(yàn)室分離保存；表達(dá)質(zhì)粒pQE30及其宿主菌E.coliDH5α和E.coliM15為本室保存；質(zhì)粒pMD18-T購自TaKaRa公司。

1.1.2試劑PCR擴(kuò)增試劑盒、T4連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ、DNA marker、蛋白marker均為Fermentas產(chǎn)品；超濾管為Millipore公司產(chǎn)品；抗His-Tag單克隆抗體、辣根過氧化物酶( HRP) 標(biāo)記羊抗鼠IgG購自北京天根生物技術(shù)公司；DAB 顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1Rgg蛋白的生物信息學(xué)分析用Blastp和ClustalW等生物信息學(xué)工具對(duì)05ZYH33的Rgg氨基酸序列進(jìn)行分析，并用ESPript 3.0[12]對(duì)Clustal W比對(duì)結(jié)果進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。再使用MEGA 3.1軟件中的Neighbor-Joining方法繪制Rgg蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.2.2目的基因的PCR 擴(kuò)增及克隆根據(jù)rgg編碼基因序列設(shè)計(jì)合成引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物為5′-ggatccatgagttgttttgggaaaac-3′，劃線部分為BamH I 酶切位點(diǎn)；下游引物為5′-aagcttctactcaataagtatcttttc-3′，劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。引物由南京金斯瑞生物技術(shù)公司合成。PCR體系：10×Taq buffer 4 μL，2.5 mmol/ L dNTP 3 μL，模板DNA 2 μL，10 pmol/μL上游，下游引物各0.5 μL，Ex Taq 酶0.5 μL，雙蒸水補(bǔ)至40 μL。PCR程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，試劑盒回收目的片段。將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)PCR檢測(cè)為陽性者送南京金斯瑞測(cè)序鑒定。

1.2.3重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定質(zhì)粒pMD18T-rgg和pQE30載體分別用BamH I /Hind Ⅲ雙酶切，并用膠回收試劑盒回收目的片段。4 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)為陽性的克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。

1.2.4重組蛋白的表達(dá)及其純化將重組表達(dá)載體pQE30-rgg轉(zhuǎn)化E.coliM15，菌液培養(yǎng)至OD600值約0.6 時(shí)加入IPTG至終濃度1 mmol/L，不同溫度下誘導(dǎo)表達(dá)4 h后收集菌體超聲破碎，離心取上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAG電泳，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。將重組體擴(kuò)大培養(yǎng)并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，PBS重懸后冰浴超聲破碎，離心后上清用Ni2+親和層析柱純化重組蛋白，SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白純度。純化蛋白透析脫鹽除去咪唑，做非變性PAGE電泳分析，鑒定其是否存在聚合體結(jié)構(gòu)。

1.2.5Western blot分析取純化蛋白進(jìn)行PAGE電泳，采用電轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h后，加1∶1 000稀釋的His-Tag單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，加1∶4 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h，加底物DAB/ H2O2顯色。

2結(jié)果

2.1S.suis2編碼Rgg蛋白的序列結(jié)構(gòu)分析將S.suis2中國(guó)強(qiáng)致病株05ZYH33的Rgg氨基酸序列在NCBI進(jìn)行Blastp比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白與S.dysgalactiae、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)、S.pyogenes、變形鏈球菌(S.mutans)、口腔鏈球菌(S.oralis) 和馬鏈球菌獸疫亞種(S.equisubsp.zooepidemicus)中的Rgg家族蛋白的氨基酸序列分別具有26%、28%、26%、20%、40%、32%和42%的一致性。以停乳鏈球菌的Rgg2蛋白晶體結(jié)構(gòu)(Protein data bank (PDB) ID: 4YV6 )為模型，使用ClustalW軟件和ESPript 3.0對(duì)其同源蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖1所示，它們都含有3個(gè)已證實(shí)的對(duì)于Rgg發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能所必需的恒定氨基酸殘基：甘氨酸(G5)、精氨酸 (R12)、和色氨酸 (W150)，而且在二級(jí)結(jié)構(gòu)上具有較高的相似性，整個(gè)蛋白僅由15個(gè)α螺旋和2個(gè)β轉(zhuǎn)角組成，無β折疊結(jié)構(gòu)。

應(yīng)用RPS-Blast工具對(duì)Rgg蛋白的保守功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行檢索分析，發(fā)現(xiàn)其N-端有數(shù)個(gè)特異的DNA結(jié)合位點(diǎn)，以及1個(gè)可結(jié)合DNA靶序列的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix, HTH)基序，而該部分序列在Rgg蛋白家族成員中非常保守(圖1)，提示其調(diào)控特定DNA靶序列的功能可能非常相似。此外， 等報(bào)道S.dysgalactiae的Rgg2蛋白在第45位的半胱氨酸殘基可產(chǎn)生二硫鍵，使得Rgg2形成同源二聚體，但是序列比對(duì)顯示其它同源蛋白在該位點(diǎn)上并非半胱氨酸殘基(圖1)。

綠色三角：3個(gè)保守氨基酸殘基；紅色*：S.dysgalactiae編碼Rgg2蛋白的二硫鍵位置。

2.2Rgg蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析使用MEGA 4.1軟件中的Neighbor-Joining方法對(duì)上述不同來源的Rgg家族蛋白做進(jìn)化樹分析，由結(jié)果(圖2)可知，S.suis2編碼的Rgg轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與變形鏈球菌中的同源蛋白在進(jìn)化中親緣關(guān)系最近。

2.3目的基因擴(kuò)增及重組表達(dá)載體的構(gòu)建以05ZYH33基因組DNA為模板，對(duì)目的基因rgg進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,產(chǎn)物分子量與預(yù)測(cè)基因分子量大小基本相符。測(cè)序結(jié)果顯示該片段全長(zhǎng)864 bp，編碼287個(gè)氨基酸，與rgg基因序列完全相同。重組表

圖2　Rgg蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹

Fig.2Phylogenetic tree of Streptococcal isolates based on amino acid sequences of Rgg protein

達(dá)載體pQE30-rgg通過BamH I/Hind Ⅲ雙酶切后，1%瓊脂糖電泳顯示PCR鑒定產(chǎn)物和酶切片段的長(zhǎng)度約900 bp(圖3)。

M：DNA marker；1：BamH I/Hind Ⅲ雙酶切鑒定；2. PCR鑒定

M: DNA marker; 1:BamH I/Hind Ⅲ double restriction enzymes; 2: Identification by PCR.

圖3pQE30-rgg重組質(zhì)粒的鑒定

Fig.3Identification of the recombinant plasmid pQE30-rgg

2.4重組蛋白的表達(dá)及其條件優(yōu)化轉(zhuǎn)化重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30-rgg的大腸桿菌M15，經(jīng)1 mmol/L終濃度的IPTG于37 ℃誘導(dǎo)4 h后，SDS-PAGE分析表明在30 kD左右處有一明顯的新生條帶，分子量大小與預(yù)期一致。超聲裂解菌體后離心發(fā)現(xiàn)，目的蛋白在37 ℃下主要是以包涵體形式表達(dá)。通過降低誘導(dǎo)溫度至25 ℃、15 ℃，目的蛋白越來越多地以可溶性蛋白的形式表達(dá)(圖4)。

M：蛋白Marker；NC：未誘導(dǎo)的陰性對(duì)照；T：總蛋白；S：超聲破碎后上清；I：超聲破碎后沉淀；箭頭：目的蛋白的位置

M: Protein Marker; NC: pQE30-rgg/M15 uninduced with IPTG; T: Total protein; S: Soluble fraction; I: Insoluble fraction; arrow: Target protein.

圖4SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白在不同溫度下的表達(dá)形式

Fig.4Expression analysis of target protein at different induction temperatures by SDS-PAGE

2.5重組蛋白的純化與Western blot分析將重組表達(dá)菌轉(zhuǎn)接培養(yǎng)37 ℃至對(duì)數(shù)期后，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，15 ℃誘導(dǎo)24 h。離心收集菌體，超聲破碎，離心后收集上清，利用鎳離子親和層析純化重組蛋白，電泳可見純化產(chǎn)物只有一條特異的條帶(圖5A)，表明得到了較高純度的Rgg重組蛋白。 Western blot 結(jié)果顯示, 重組Rgg蛋白可與抗His-Tag單抗發(fā)生特異性反應(yīng), 在約33 kD 處出現(xiàn)明顯的顯色條帶(圖5B), 表明該蛋白條帶的確是pQE30-rgg載體所表達(dá)的重組Rgg蛋白。

圖A：純化過程的SDS-PAGE分析。M：蛋白Marker；1-8：250 mM咪唑洗脫后的收集液；9：過柱前樣品。圖B：目的蛋白與His-tag單抗的western分析。M：蛋白Marker；1-2：純化蛋白。

A: SDS-PAGE analysis of the purification. M: Protein Marker; 1-8: Eluted fraction with 250 mM imidazole; 9: Lysate.B: Western blot with monoclonal antibody against His-tag. M: Protein Marker; 1-2: Purified protein.

圖5純化蛋白的SDS-PAGE和western分析

Fig.5Purified recombinant protein by SDS-PAGE and Western blot

2.6純化重組蛋白的非變性PAGE電泳分析由于文獻(xiàn)報(bào)道有HTH基序的DNA結(jié)合蛋白能夠在體外形成同質(zhì)二聚體，因此我們將純化的重組蛋白脫鹽后進(jìn)行了非變性PAGE電泳分析。結(jié)果如圖6所示，泳道內(nèi)除了之前的30 kD條帶外，在約60 kD處明顯增加了一條新的蛋白條帶，提示Rgg重組蛋白經(jīng)過純化和脫鹽后出現(xiàn)了二聚體結(jié)構(gòu)。

M：蛋白Marker；1：純化脫鹽后的Rgg重組蛋白；箭頭：蛋白二聚體

M: Protein Marker; 1: Purified Rgg recombinant protein; arrow: Homodimeric protein.

圖6純化蛋白的非變性PAGE分析

Fig.6Native-PAGE analysis of purified recombinant protein

3討論

Rgg家族的調(diào)節(jié)因子是在革蘭氏陽性菌中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的一種保守蛋白，在各種細(xì)菌中執(zhí)行不同的調(diào)控功能，例如在格氏鏈球菌中調(diào)節(jié)葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的Rgg[5]、乳酸乳球菌中對(duì)酸性環(huán)境耐受所必需的GadR[13〗[14]、化膿鏈球菌中影響大量代謝與毒力基因表達(dá)的全局調(diào)控因子RopB[15]、無乳鏈球菌中調(diào)控毒力因子表達(dá)的RovS[16]。在一些細(xì)菌基因組中，如化膿鏈球菌[17]、肺炎鏈球菌[18]等，還存在多個(gè)該家族的調(diào)節(jié)因子。

我們對(duì)S.suis2中國(guó)強(qiáng)毒株05ZYH33基因組中05ssu1997基因編碼的蛋白進(jìn)行了序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)它同無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌等多種鏈球菌中的Rgg家族調(diào)控因子均為同源蛋白，而且通過結(jié)構(gòu)域分析也發(fā)現(xiàn)它們的N端都具有DNA結(jié)合蛋白中常見的HTH基序和Rgg家族蛋白的3個(gè)保守氨基酸殘基。由序列分析結(jié)果中可見，不同細(xì)菌中的Rgg家族成員之間在氨基酸序列的一致性上并不是很高，基本不超過40%。但是其N端具有較強(qiáng)的保守性(圖1)，而該部分正是Rgg蛋白能夠結(jié)合DNA序列從而調(diào)控靶基因的功能區(qū)域，提示它們作為同一個(gè)調(diào)控蛋白家族的成員，具有其共同的結(jié)構(gòu)特征和類似的調(diào)控機(jī)制。

為了下一步能更好地對(duì)Rgg調(diào)控因子進(jìn)行結(jié)構(gòu)和DNA結(jié)合功能的研究，其重組表達(dá)蛋白需要盡可能保持天然構(gòu)象。我們前期使用了PET32a表達(dá)載體對(duì)其進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，而且調(diào)整誘導(dǎo)條件后上清中的目的蛋白含量增加不多。因此本實(shí)驗(yàn)更換了pQE30載體進(jìn)行Rgg蛋白的原核表達(dá)，雖然37 ℃下誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)上清中目的蛋白量很少，但是將其置于15 ℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白的可溶性表達(dá)水平顯著增高，超聲破碎后上清中的目的蛋白量甚至多于沉淀。純化獲得最大產(chǎn)量的可溶性、有活性及正確折疊的Rgg重組表達(dá)蛋白，對(duì)于我們今后通過凝膠遷移阻滯等實(shí)驗(yàn)鑒定其下游基因和特異性DNA結(jié)合序列非常重要。

此前，Loughman等已證明了化膿鏈球菌中的RopB蛋白和其它擁有HTH基序的DNA結(jié)合蛋白一樣能夠在體外形成同質(zhì)二聚體[9]，Parashar V等根據(jù)S.dysgalactiae編碼Rgg2蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，證明其通過半胱氨酸(C45)產(chǎn)生的二硫鍵形成同源二聚體[10]。雖然序列比對(duì)顯示S.suis2中的 Rgg蛋白在該位置上并非半胱氨酸，但本實(shí)驗(yàn)將其原核表達(dá)后純化，通過非變性PAGE電泳證實(shí)其在體外也能形成二聚體結(jié)構(gòu)，提示Rgg蛋白家族成員之間產(chǎn)生二硫鍵的位置或發(fā)生聚合的機(jī)制可能會(huì)有所不同。

本研究對(duì)S.suis2 中國(guó)強(qiáng)毒株中的Rgg調(diào)控因子進(jìn)行了序列結(jié)構(gòu)分析和原核表達(dá)，并獲得了較高純度的Rgg重組蛋白，該結(jié)果將有助于我們進(jìn)一步研究其具體的調(diào)控功能，從而更加系統(tǒng)全面地認(rèn)識(shí)S.suis2的致病機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1]Higgins R, Gottschalk M, Boudreau M, et al. Description of six new capsular types (29-34) ofStreptococcussuis[J]. J Vet Diagn Invest, 1995, 7(3): 405-406. DOI:10.1177/104063879500700322

[2]Staats JJ, Feder I, Okwumabua O, et al.Streptococcussuis: past and present[J]. Vet Res Commun, 1997, 21(6): 381-407.

[3]Silva LM, Baums CG, Rehm T, et al. Virulence-associated gene profiling ofStreptococcussuisisolates by PCR[J]. Vet Microbiol, 2006, 115(1-3): 117-127. DOI:10.1016/j.vetmic.2005.12.013

[4]Tang J, Wang C, Feng Y, et al. Streptococcal toxic shock syndrome caused byStreptococcussuisserotype 2[J]. PLoS Med, 2006, 3: e151. DOI:10.1371/journal.pmed.0030151

[5]Sulavik MC, Tardif G, Clewell DB. Identification of a gene, rgg, which regulates expression of glucosyltransferase and influences the Spp phenotype ofStreptococcusgordoniiChallis[J]. J Bacteriol, 1992, 174(11): 3577-3586.

[6]Vickerman MM, Sulavik MC, Clewell DB.Oralstreptococciwith genetic determinants similar to the glucosyltransferase regulatory gene,rgg[J]. Infect Immun, 1995, 63(11): 4524-4527.

[7]Rawlinson EL, Nes IF, Skaugen M. Identification of the DNA-binding site of the Rgg-like regulator LasX within the lactocin S promoter region[J]. Microbiology, 2005, 151(Pt 3): 813-823. DOI:10.1099/mic.0.27364-0

[8]Bortoni ME, Terra VS, Hinds J, et al. The pneumococcal response to oxidative stress includes a role for Rgg[J]. Microbiology, 2009, 155(Pt 12): 4123-4134. DOI: 10.1099/mic.0.028282-0

[9]Loughman JA, Caparon MG. Contribution of invariant residues to the function of Rgg family transcription regulators[J]. J Bacteriol, 2007, 189(2): 650-655. DOI:10.1128/JB.01437-06

[10]Parashar V, Aggarwal C, Federle MJ, et al. Rgg protein structure-function and inhibition by cyclic peptide compounds[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2015, 112(16): 5177-5182. DOI:10.1073/pnas.1500357112

[11]Zheng F, Ji H, Cao M, et al. Contribution of the Rgg transcription regulator to metabolism and virulence ofStreptococcussuisserotype 2[J]. Infect Immun, 2011, 79(3): 1319-1328. DOI:10.1128/IAI.00193-10

[12]Xavier R, Patrice G. Deciphering key features in protein structures with the new ENDscript server[J]. Nucl Acids Res, 2014, 42(W1): W320-W324.

[13]Sanders JW, Leenhouts K, Burghoorn J, et al. A chloride-inducible acid resistance mechanism inLactococcuslactisand its regulation[J]. Mol Microbiol, 1998, 27(2): 299-310. DOI:10.1046/j.1365-2958.1998.00676.x

[14]Qi F, Chen P, Caufield PW. Functional analyses of the promoters in the lantibiotic mutacin II biosynthetic locus inStreptococcusmutans[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(2): 652-658.

[15]Chaussee MS, Ajdic D, Ferretti JJ. The rgg gene ofStreptococcuspyogenesNZ131 positively influences extracellular SPE B production[J]. Infect Immun, 1999, 67(4): 1715-1722.

[16]Samen UM, Eikmanns BJ, Reinscheid DJ. The transcriptional regulator RovS controls the attachment ofStreptococcusagalactiaeto human epithelial cells and the expression of virulence genes[J]. Infect Immun, 2006, 74(10): 5625-5635. DOI:10.1128/IAI.00667-06

[17]Ferretti JJ, Mcshan WM, Ajdic D, et al. Complete genome sequence of an M1 strain ofStreptococcuspyogenes[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(8): 4658-4663. DOI:10.1073/pnas.071559398

[18]Tettelin H, Nelson KE, Paulsen IT, et al. Complete genome sequence of a virulent isolate ofStreptococcuspneumoniae[J]. Science, 2001, 293(5529): 498-506. DOI:10.1126/science.1061217

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.004

通訊作者：鄭峰，Email：zhengf82@gmail.com

中圖分類號(hào)：R378.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2694(2016)03-0229-05

Corresponding author:Zheng Feng, Email: zhengf82@gmail.com

收稿日期：2015-09-07；修回日期:2015-12-09

Sequence and structure analysis of Rgg transcription regulator in Streptococcus suis serotype 2 and prokaryotic expression

ZHENG Feng,LIU Peng,CAI Bing-gang,ZHU Jin,PAN Xiu-zhen,WANG Chang-jun

(HuadongMedicalInstituteofBiotechniques,Nanjing210002,China)

Abstract:To identify and demonstrated the properties of Rgg transcription regulator in highly virulent strains of Streptococcus suis serotype 2, the rgg gene from the genomic DNA in the virulent strain 05ZYH33 was amplified by PCR and subcloned into plasmid pMD18-T and pQE30 with double digestion of BamHⅠand Hind Ⅲ. Subsequently, the prokaryotic expression plasmid pQE30-rgg was transformed to E. coli M15 after identification by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. Upon induction with IPTG, E. coli M15 containing the recombinant plasmid could express a distinct band with a molecular weight of 30 kDa, which was similar to the predicted band of Rgg protein as demonstrated by SDS-PAGE and Western blot. It was demonstrated that the recombinant protein expression could be the highest soluble yield after induction for overnight at 15 ℃. The recombinant Rgg protein was purified by Ni2+NTA affinity chromatography. Native-PAGE results showed that the purified protein forms homodimers in vitro, consistent with data for other members of the Rgg family. Secondary structure analysis displayed Rgg protein contained 15 α-helices and 2 β-turn. These results would be useful in the further studies on the function of Rgg transcription regulator.

Keywords:Streptococcus suis; Rgg transcription regulator; prokaryotic expression

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31300119, 31170124, 81471920)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.BK2012080)