變異鏈球菌ldh基因啟動子的克隆及活性檢測

張加勤，黃珊珊,2，徐巧麗，饒慧華，馬曉波，黃朝陽，房麗麗，鄭港森，宋秀宇

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變異鏈球菌ldh基因啟動子的克隆及活性檢測

張加勤1，黃珊珊1,2，徐巧麗1，饒慧華1，馬曉波1，黃朝陽1，房麗麗1，鄭港森1，宋秀宇3

1.廈門大學附屬第一醫院暨福建醫科大學廈門市第一教學醫院檢驗科，廈門361003；2.福建醫科大學第一臨床醫學院，福州350108；3.廈門市中心血站，廈門361003

摘要：目的克隆變異鏈球菌ldh基因啟動子，并驗證其活性。方法以變異鏈球菌UA159基因組為模版，PCR擴增變異鏈球菌ldh基因候選啟動子，將其插入β-葡萄糖醛酸酶 (β-glucuronidase,gusA)報告基因表達載體pIB107 BamH I/Xho I之間，構建ldh基因啟動子gusA報告載體pCKS11，PCR、酶切及測序鑒定；經Sca I酶線性化后轉化變異鏈球菌UA159，卡那霉素篩選陽性克隆SCKS11，經PCR和測序鑒定后，檢測其GusA活性。結果成功擴增出大小為269 bp的ldh基因候選啟動子；經PCR、酶切及測序鑒定，變異鏈球菌ldh基因候選啟動子gusA報告基因表達載體pCKS11構建正確；PCR和測序鑒定，ldh基因候選啟動子gusA報告株SCKS11構建成功；變異鏈球菌ldh基因候選啟動子啟動的GusA活性是無啟動子的陰性對照的5.8倍，是陽性對照變異鏈球菌clpP基因啟動子的0.9倍。結論成功克隆變異鏈球菌ldh基因啟動子序列，具有較強的啟動轉錄活性，為研究ldh基因的表達調控機制奠定基礎。

關鍵詞：變異鏈球菌；ldh基因；啟動子

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81000762) and the Natural Science Foundation of Fujian Province (Nos. 2015J0155 and 2013D002)

變異鏈球菌(Streptococcusmutans，S.mutans)是人類口腔的主要致齲菌之一。 變異鏈球菌在牙面粘附定植形成復雜的被稱為牙菌斑的生物膜結構，并在牙菌斑內代謝碳水化合物產酸，造成局部微環境PH值下降，牙齒硬組織脫礦，羥磷灰石溶解破壞致齲[1]。其致齲的毒力作用主要表現在粘附、產酸和耐酸三個方面。除此之外還可引起牙髓病、牙周病、頜骨炎、感染性心內膜炎等一系列并發癥，嚴重影響人類的身心健康。

變異鏈球菌屬兼性厭氧革蘭氏陽性球菌，其能量來源于無氧糖酵解途徑。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenases，LDH)是無氧糖酵解途徑中重要的酶，廣泛存在于各種生物體中，也是S.mutans能量代謝途徑中不可缺少的固有酶，在無氧糖酵解途徑中，可催化乳酸和丙酮酸相互轉換，調節生物體內酸代謝的平衡。為研究S.mutansldh基因啟動子的結構和ldh基因的表達調控機制，我們構建了S.mutansldh基因5′側翼序列-β-葡萄糖醛酸酶 (β-glucuronidase,gusA)報告基因表達載體，通過同源重組構建了ldh-gusA基因表達報告株，并測定其活性，進而判斷啟動子活性，為研究ldh基因的表達調控機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1菌株和質粒變異鏈球菌UA159由第四軍醫大學饋贈；質粒pIB107由堪薩斯大學醫學中心 Biswas Indranil 教授惠贈；clpP基因啟動子gusA報告基因表達載體pFclpP及其報告株SFclpP由本實驗室構建并保存；大腸埃希菌DH5α和大腸埃希菌Top10為本實驗室保存。

1.2主要試劑T4 DNA連接酶、限制性內切酶、DL2000 DNA Marker 、DL5000 DNA Marker、1 kb DNA Ladder購自TaKaRa公司；感受態刺激肽CSP、 SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司；2×Taq PCR master Mix試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技公司；PCR產物/凝膠回收純化試劑(QIAquick PCR Purification Kit及QIAquick Gel Purification Kit)購自QIAGEN公司；p-nitrophenyl-β-D-glucoside (PNPG)購自Sigma公司；其余為國產或進口分析純試劑；所有引物合成和DNA測序均由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.3實驗步驟

1.3.1細菌基因組DNA的提取取37 ℃靜置過夜培養變異鏈球菌，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取變異鏈球菌UA159基因組DNA。

1.3.2目的片段的擴增以變異鏈球菌UA159基因組DNA為模版，設計引物BamH I-ldh-p-F1(5′- CGGGATCCCCGAGCAACAATAACACTC-3′)和XhoI-ldh-p-R1(5′-CCGCTCGAGAACATCTCCTTATAATTTATTAAGTATATATT

CTAT-3′)擴增ldh基因候選啟動子。在200 μL PCR反應管中建立如下反應體系：UA159基因組DNA 50 ng，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，加滅菌水至25 μL。反應條件：預熱95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂凝膠電泳120 V，30 min后觀察結果，并進行PCR產物純化回收。

1.3.3ldh基因候選啟動子重組gusA報告載體的構建與鑒定 變異鏈球菌ldh基因候選啟動子序列經QIAquick PCR Purification Kit回收純化后，限制性內切酶BamH I/XhoI酶切，插入經BamH I/XhoI酶切的gusA報告基因表達載體pIB107，轉化大腸埃希菌DH5α感受態細胞。用含氨芐西林(100 μg/mL)和卡那霉素(50 μg/mL)的固體培養基篩選陽性菌落，37 ℃過夜培養并抽提質粒獲得同源重組報告載體pCKS11，用引物BamH I-ldh-p-F1/XhoI-ldh-p-R1進行PCR驗證，并同時進行酶切及測序鑒定。

1.3.4變異鏈球菌ldh基因候選啟動子重組gusA報告基因表達株構建 將含有ldh基因候選啟動子的同源重組gusA報告基因表達載體pCKS11，經限制性內切酶ScaI線性化后，參考文獻[2]轉化變異鏈球菌UA159，卡那霉素(300 μg/mL)篩選陽性菌落，構建ldh啟動子片段gusA報告基因表達株SCKS11。提取細菌基因組，設計引物kan-F2(5′-GGCAATCTGCCTCCTCATC-3′)/gusA-In-R2(5′-CTGCCTGGCACAGCAATTGCCCGGC-3′)，經PCR及測序驗證。

1.3.5變異鏈球菌ldh基因候選啟動子序列活性檢測參照文獻[3]分別測定ldh基因候選啟動子gusA報告基因表達株SCKS11、clpP基因啟動子gusA報告基因陽性對照株SFclpP和無啟動子的陰性對照株SIB107的GusA蛋白活性，鑒定變異鏈球菌ldh基因候選啟動子活性。37 ℃增菌培養至對數生長期，記錄OD600值。將離心后的沉淀物用磁珠法破碎細胞提取上清蛋白液。酶標板中分別加Z-buffer 50 μL，各自細胞裂解液50 μL和PNPG溶液50 μL，混勻，每個樣本做2孔。待活性達到穩定，溶液變成亮黃色后，加入1 mol/L Na2CO350 μL，用分光光度計測定A405值，每個樣本測3次。用公式[1 000×A405]/[time(min) ×cell OD600]計算GusA活性,單位為MU。

2結果

2.1變異鏈球菌ldh基因候選啟動子的體外擴增 采用引物BamH I-ldh-p-F1/XhoI-ldh-p-R1 PCR擴增變異鏈球菌ldh基因候選啟動子序列，產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，在281 bp處有特異性擴增條帶，大小與預期結果一致，且未見非特異擴增帶。(如圖1)。

1：變異鏈球菌ldh基因候選啟動子序列PCR擴增片段；2：陰性對照；M: DNA Marker DL2 000

1: PCR product of candidate promoter ofS.mutansldhgene; 2: Negative control; M: DNA Marker DL2 000

圖1變異鏈球菌ldh基因候選啟動子PCR擴增結果

Fig.1PCR analysis of candidate promoter of S. mutans ldh gene

2.2變異鏈球菌ldh基因候選啟動子gusA報告基因表達載體的構建與鑒定變異鏈球菌ldh基因候選啟動子經BamH I/XhoI酶切，插入到經BamH I/XhoI酶切的pIB107載體中，獲得ldh基因候選啟動子gusA報告基因表達載體pCKS11。轉入DH5α感受態細胞后，提取質粒，用BamH I-ldh-p-F1/XhoI-ldh-p-R1引物進行PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示在281 bp處有特異性擴增條帶；質粒pCKS11經ClaI單酶切和BamH I/PstI雙酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示：ClaI單酶切片段在2 246 bp和6 689 bp位置出現兩條帶，BamH I /PstI雙酶切片段大小為2 191 bp和6 744 bp，大小與預期結果一致。測序結果證明成功將ldh基因候選啟動子插入pIB107gusA報告基因表達載體，序列與預期結果一致。(如圖2)。

2.3變異鏈球菌ldh基因候選啟動子gusA報告基因表達株的構建與鑒定 變異鏈球菌ldh基因候選啟動子gusA報告基因表達載體pCKS11經線性化后轉入變異鏈球菌UA159，在卡那霉素(300 μg/mL)抗性的THY平板上長出陽性菌株，說明變異鏈球菌ldh基因候選啟動子gusA報告基因以及卡那霉素抗性基因成功整合到變異鏈球菌UA159的基因組中。提取ldh基因候選啟動子gusA報告基因表達株基因組DNA，用引物Kan-F2/GusA-In-R2建立PCR擴增體系，電泳后，結果顯示分別在1 091 bp和822 bp處有特異性擴增條帶，與預期結果大小相符(如圖3)。測序結果證明變異鏈球菌kan抗性基因盒-ldh基因候選啟動子-gusA報告基因已經插入變異鏈球菌轉座酶基因(SMU.1405)中，成功構建ldh候選啟動子gusA報告基因表達株SCKS11。

1: pCKS11質粒; 2: pCKS11質粒ClaI單酶切鑒定;3: pCKS11質粒BamH I /PstI雙酶切鑒定;4: pCKS11質粒PCR鑒定;5: 陰性對照; M: DNA Marker DL5 000

1:Recombinant plasmid pCKS11; 2:ClaI digestion of recombinant plasmid pCKS11; 3:BamH I /PstI digestion of recombinant plasmid pCKS11; 4: PCR product of recombinant plasmid pCKS11; 5: Negative control; M: DNA Marker DL5 000

圖2變異鏈球菌ldh基因候選啟動子gusA報告基因表達載體的鑒定

Fig.2Verification of gusA report vector of ldh gene candidate promoter of S. mutans

1:線性化pIB107質粒gusA報告基因表達株的PCR擴增產物; 2:陰性對照;3:線性化pCKS11質粒gusA報告基因表達株的PCR擴增產物; 4:陰性對照;

M: DNA Marker DL2 000；1: PCR product of strains with linearized gusAreport gene plasmid pIB107; 2: Negative control; 3: PCR product of strains with linearized gusAreport gene plasmid pCKS11; 4: Negative control; M: DNA Marker DL2 000

圖3變異鏈球菌ldh基因候選啟動子gusA報告基因表達株的PCR鑒定

Fig.3Validation of the gusA report strains of ldh gene candidate promoter of S. mutans by PCR

2.4變異鏈球菌ldh基因候選啟動子GusA活性測定結果顯示ldh基因候選啟動子gusA報告基因表達株SCKS11的GusA活性是無啟動子的陰性對照株SIB107的5.8倍，是clpP基因啟動子gusA報告基因陽性對照株SFclpP的0.9倍，表明成功克隆ldh基因啟動子，且該啟動子有較強啟動基因轉錄活性。詳見圖4。

Negative control SIB107 (pIB107); SFclpP (pFclpP); SCKS11 (pCKS11)

圖4變異鏈球菌ldh基因候選啟動子GusA活性檢測

Fig.4GusA activity analysis of ldh gene candidate promoter of S. mutans

3討論

無氧糖酵解途徑中，乳酸脫氫酶催化丙酮酸形成乳酸，是變異鏈球菌糖代謝過程中極為重要的酶，為細菌的生長代謝提供能量，并且該酶在細菌體內穩定表達[4]。最早，由ldh基因編碼的乳酸脫氫酶LDH是由M.J.Duncan等在變異鏈球菌中分離純化出的細菌體內固有酶，菌內含量高。正由于LDH在菌體無氧糖酵解過程中的重要作用，其可作為代謝活性的指示劑[5]。同時，在原核生物中，由于細菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子，因此采用變異鏈球菌ldh基因的啟動子構建報告質粒，使其可在原核生物中轉錄翻譯，從而監測ldh基因的表達情況。

轉錄翻譯是原核生物基因的主要調控方式，通過RNA聚合酶、轉錄因子、啟動子和終止子的相互作用實現轉錄調控，改變細胞表型，從而實現細胞生理狀態的改變。原核生物的啟動子是結構基因上游的一段DNA序列，本研究所選取的ldh基因候選啟動子序列在轉錄起始點到其上游269 bp，而一般是從翻譯起始位點到其上游200 bp左右，說明所選取的序列為啟動子的可能性較高。啟動子的核心元件主要包括RNA聚合酶的識別和結合位點、間隔區、SD序列和轉錄起始位點，在轉錄翻譯中起重要作用。據生物信息學軟件分析結果顯示，在S.mutans中，ldh基因翻譯起始點上游-79 bp～-74 bp 處有在RNA聚合酶在σ亞基的協助下被RNA聚合酶識別結合的序列5′-GTGACT-3′，形成封閉的RNA聚合酶全酶-啟動子復合物。與通常被認為最優化-35區序列5′-TTGACA-3′相比，同源性67 %，認為其是-35區的可疑序列；分析顯示，在S.mutans中，ldh基因翻譯起始點上游的-20 bp～-15 bp處有與RNA聚合酶的核心酶緊密結合形成開放性啟動子復合物的序列 5′-TATAAG-3′。形成的開放性啟動子復合物可將DNA解鏈，當RNA聚合酶移動到轉錄起始點時，加入三磷酸核苷酸開始轉錄[6-7]。此序列與-10區最優化序列5′-TATAAT-3′相比同源性83 %，研究發現第1，2，6位三個堿基最保守，但是對啟動子的識別和解鏈作用主要在第2位的A堿基上，說明此序列為-10區的可能性較高。通過分析結果，我們發現翻譯起始位點上游-17 bp～-13 bp處，有強SD序列的偏好模式5′-AAGGA-3′，可與核糖體16s rRNA 3′末端富含嘧啶序列互補。研究表明，SD序列越強，基因表達水平越高。綜上所述，ldh基因候選啟動子有啟動子的特征可作為候選啟動子。成功定位啟動子的區域是研究啟動子，構建報告基因表達載體的關鍵步驟。

生物工程領域通常選用由報告基因、抗性基因和轉錄終止子構成，但缺乏啟動子的克隆表達載體為報告基因載體，從而研究某個基因在菌體內的表達情況和對其他基因的相互作用影響[8]。目前，基因工程領域常用的報告基因有cat(氯霉素乙酰轉移酶基因)、lacZ(β-半乳糖苷酶基因)、lux(熒光素酶基因)、gusA(β-葡萄糖醛酸酶基因)和熒光蛋白等。cat基因和lux基因的表達產物分析成本高，lacZ基因的表達背景高，熒光蛋白不能定量測定，而gusA基因編碼的β-葡萄糖醛酸酶能水解多種β-葡萄糖醛酸衍生物，且GusA活性可以用分光光度法、熒光光度法、組織化學法等不同方法檢測分析。本實驗采用分光光度法檢測gusA基因編碼的β-葡萄糖醛酸酶，具有較高靈敏度、不需要昂貴的儀器設備和操作簡便等優點。

為了研究變異鏈球菌ldh基因啟動子的活性，本研究克隆ldh基因候選啟動子，采用Indranil Biswas 課題組所構建的pIB107gusA報告基因表達載體，成功構建了變異鏈球菌ldh-gusA報告株，并證實了ldh基因啟動子的活性。該報告株的優點是將kan抗性基因盒-ldh基因候選啟動子-gusA報告基因整合到變異鏈球菌的染色體DNA中，既可穩定表達目的基因，又可通過kan抗性基因篩選陽性菌株進行GusA活性檢測。pIB107gusA報告基因表達載體與變異鏈球菌發生同源重組原理是pIB107載體的卡那霉素抗性基因盒的5′側翼和gusA報告基因及3′側翼序列分別為變異鏈球菌轉座酶基因(SMU1405)5′端及3′端同源臂[3]。線性化的載體可以通過同源重組的方法將同源臂整合到變異鏈球菌轉座酶基因上，那么，卡那霉素基因和gusA報告基因就被重組到變異鏈球菌基因組上，用卡那霉素抗性基因可篩選出陽性菌落。同法，將ldh基因啟動子克隆到pIB107的gusA報告基因上游，卡那霉素基因和gusA報告基因連同ldh基因啟動子就可被重組到變異鏈球菌基因組上，整合到基因組上的ldh基因啟動子啟動gusA報告基因，轉錄翻譯GusA蛋白即β-葡萄糖醛酸酶。β-葡萄糖醛酸酶催化水解底物PNPG，產生黃色水解產物對-硝基苯酚，終止反應后，可用分光光度計或酶標儀檢測酶反應所釋放的對-硝基苯酚的A405值，用公式計算GusA活性，通過此方法測定GusA活性從而判斷插入的啟動子活性[9]。從研究結果中可看出，ldh基因候選啟動子gusA報告基因表達株SCKS11的啟動子活性是無啟動子的陰性對照的5.8倍，是陽性對照變異鏈球菌clpP基因啟動子的0.9倍，說明ldh基因啟動子具有較強的啟動基因轉錄活性。

變異鏈球菌ldh基因啟動子的成功克隆和ldh-gusA報告株的成功構建為后續研究ldh基因啟動子的結構和功能提供了生物模型和實驗依據，并且將為研究ldh基因的表達調控機制奠定基礎。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.003

通訊作者：宋秀宇，Email：songxyxm@126.com

中圖分類號：R378.1

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)03-0224-05

Corresponding author:Song Xiu-yu, Email: songxyxm@126.com

收稿日期：2015-11-26；修回日期:2016-01-06

Activity detection of ldh gene promoter of Streptococcus mutans

ZHANG Jia-qin1,HUANG Shan-shan1,2,XU Qiao-li1,RAO Hui-hua1,MA Xiao-bo1,HUANG Chao-yang1,FANG Li-li1,ZHENG Gang-sen1,SONG Xiu-yu3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofXiamenUniversity,Xiamen361003,China;2.TheFirstClinicalMedicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350108,China;3.XiamenCentralBloodServiceStation,Xiamen361003,China)

Abstract:We cloned the ldh gene promoter of Streptococcus mutans and explored it′s activity. The candidate promoter of S. mutans ldh gene was amplified from S. mutans UA159 chromosome DNA by PCR, then was inserted into pIB107 by BamH I/Xho I to construct β-glucuronidase report plasmids pCKS11. The plasmids pCKS11 were verified by PCR, restriction enzyme and sequencing. After being linearized by Sca I, the plasmids pCKS11 were transformed into S. mutans UA159. Then, the strain was screened out by THY agar contain 300 μg/mL kanamycin. After being confirmed by PCR and sequencing, the GusA activity of homologous recombination β-glucuronidase report strain SCKS11 and it parental strains were measured. Results showed that the 269 bp candidate promoter of ldh gene was amplified successfully. PCR, restrictive endonuclease digest and sequencing confirmed the validity of the ldh-gusA report plasmids and strains. The result of GusA assays showed that the activity of the candidate promoter of S. mutans ldh gene were 5.8 folds of that of the negative control without any promoter and 0.9 folds of that of the clpP gene promoter of S. mutans positive control. The success of locating the promoter of S. mutans ldh gene and construction of report strains offered an experimental basis to the further study of the expression and regulation of ldh gene of S. mutans.

Keywords:Streptococcusmutans ; ldh; promoter

國家自然科學基金(No.81000762)與福建省自然科學基金(No.2015J0155,2013D002)聯合資助