微生物源性抗氧化劑對(duì)小鼠睡眠及抗氧化性能的影響

余思佳，徐建雄

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

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微生物源性抗氧化劑對(duì)小鼠睡眠及抗氧化性能的影響

余思佳1，2，徐建雄1，2

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

【摘要】目的 探究不同劑量微生物源性抗氧化劑對(duì)小鼠睡眠及其抗氧化性能的影響。方法 60只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為4組，低、中、高劑量組分別灌喂0.5 g/kg體重、1.0 g/kg體重和1.5 g/kg體重微生物源性抗氧化劑，對(duì)照組使用生理鹽水進(jìn)行灌胃，試驗(yàn)期30 d。在末次灌胃后，各組動(dòng)物腹腔注射戊巴比妥鈉，通過(guò)翻正反射實(shí)驗(yàn)觀察小鼠睡眠狀況，并在結(jié)束后，檢測(cè)小鼠血清抗氧化性能。結(jié)果 與低、高劑量組相比，中劑量組的微生物源性抗氧化劑可以顯著延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間（P＜0.05）。與對(duì)照組，低，高劑量組相比，中劑量組極顯著提高GSH-Px活力（P＜0.01）、顯著提高SOD活力（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，中劑量組MDA和8-ISO-PGF2α含量有顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論 提示微生物源性抗氧化劑有促進(jìn)小鼠的睡眠、提高機(jī)體抗氧化能力的作用，且在1.0g/kg體重劑量下效果最顯著。

【關(guān)鍵詞】微生物源性抗氧化劑；翻正反射；抗氧化性能；睡眠小鼠

伴隨著社會(huì)的發(fā)展和生活節(jié)奏的加快，失眠已成為困擾人們正常生活的重要問(wèn)題之一。失眠是指無(wú)法入睡或無(wú)法保持睡眠狀態(tài)，導(dǎo)致睡眠不足，又稱(chēng)入睡和維持睡眠障礙。失眠往往會(huì)給患者帶來(lái)極大的痛苦和心理負(fù)擔(dān)。目前治療失眠的藥物主要是化學(xué)合成類(lèi)鎮(zhèn)靜催眠藥，但長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生依賴(lài)和毒副作用，因此研發(fā)安全高效的保健品成為新的方向。睡眠與覺(jué)醒是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要活動(dòng)的結(jié)果，由于腦組織具有高密度膜不飽和脂肪酸、較高的脂肪代謝率、低含量抗氧化劑以及依賴(lài)完整神經(jīng)元突觸傳遞等特性，易受活性氧攻擊導(dǎo)致?lián)p傷，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化及通透性增加；神經(jīng)元發(fā)生細(xì)胞毒性水腫；線粒體遭到破壞，功能喪失等［1］。抗氧化劑能夠干擾自由基連鎖反應(yīng)的引發(fā)以及擴(kuò)散，從而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。而微生物源性抗氧化劑則是由一些具有抗氧化作用的菌體本身以及有抗氧化能力的微生物發(fā)酵產(chǎn)物組成。本試驗(yàn)通過(guò)灌喂小鼠不同劑量微生物源性抗氧化劑，探究其對(duì)小鼠抗氧化能力及睡眠的影響，為研究促進(jìn)睡眠的新型保健食品提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 微生物源性抗氧化劑：由上海創(chuàng)博生態(tài)工程有限公司提供，該產(chǎn)品是刺梨、沙棘等果實(shí)，經(jīng)枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、酪酸桿菌、啤酒酵母等有益微生物經(jīng)固、液復(fù)合發(fā)酵后，再經(jīng)提取、濃縮、滅活性、凍干等加工工藝制成。含有VC、VE、異黃酮、SOD、谷胱甘肽、皂苷、牛磺酸和多種微量元素的金屬衍生物。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：60只清潔級(jí)雄性昆明小鼠，體重15～18 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（許可證號(hào)：SCXK（滬2007-0005）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑：血清中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-px）、超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）、8-異前列腺素F2α（8-ISO-PGF2α）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。戊巴比妥鈉：購(gòu)于默克化工技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理：小鼠隨機(jī)分為4組，每組15只，分別為對(duì)照組、低（L-MA）、中（M-MA）、高劑量組（H-MA）。各組小鼠均飼喂基礎(chǔ)日糧（購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），實(shí)驗(yàn)組分別灌喂0.5 g/kg體重、1.0 g/kg體重、1.5 g/kg體重微生物源性抗氧化劑，對(duì)照組灌喂等體積的生理鹽水，灌胃容量為0.2 mL/10 g體重，每天灌胃1次。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院動(dòng)物室內(nèi)，自由進(jìn)食與飲水，保持動(dòng)物房溫度為（22～25）℃，相對(duì)濕度為50%～60%，光照明暗各12 h。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)和方法：

1.2.2.1 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)：在末次灌胃15 min后，試驗(yàn)動(dòng)物按57 mg/kg體重劑量腹腔注射戊巴比妥鈉，注射量為0.1 mg/10 g體重，以小鼠翻正反射消失1 min以上作為入睡判斷標(biāo)準(zhǔn)，翻正反射消失至恢復(fù)這段時(shí)間為動(dòng)物睡眠時(shí)間，記錄入睡動(dòng)物數(shù)及睡眠時(shí)間。

1.2.2.2 抗氧化指標(biāo)測(cè)定：（1）樣品采集制備：翻正反射試驗(yàn)結(jié)束后，小鼠摘眼球采血，3 800 r/min離心10 min，制備血清。（2）測(cè)定指標(biāo)與方法：按照南京建成檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)血清中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-px）、超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）、8-異前列腺素F2（8-ISO-PGF2α）這四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)處理與分析采用 SPSS 17.0的單因素方差分析，并用 LSD法進(jìn)行多重比較，分別以P＜0.05、P＜0.01為差異顯著與極顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果以平均值果以標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 戊巴比妥鈉延長(zhǎng)小鼠睡眠時(shí)間

從表1可以看出，在實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)照組的入睡動(dòng)物數(shù)少，試驗(yàn)組入睡動(dòng)物數(shù)皆高于空白對(duì)照組，其中低劑量組和中劑量組入睡動(dòng)物數(shù)分別是是對(duì)照組的2和1.8倍。四組動(dòng)物的睡眠潛伏期差異無(wú)顯著性。中劑量組與低劑量組和高劑量組對(duì)比，小鼠的睡眠時(shí)間均高于后兩者且呈現(xiàn)差異顯著性（P ＜0.05）。中劑量組睡眠時(shí)間高于空白對(duì)照組（P＞0.05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明中劑量微生物源性抗氧化劑對(duì)延長(zhǎng)戊巴比妥鈉小鼠的睡眠時(shí)間有促進(jìn)作用。

表1 受試物對(duì)戊巴比妥鈉延長(zhǎng)小鼠睡眠時(shí)間的影響Tab.1 The effect of microbe-derived antioxidant on duration of sleep induced by pentobarbital sodium

表2 小鼠血清抗氧化能力Tab.2 The antioxidant ability of the mouse serum

2.2 血清抗氧化能力

從表2可以看出，中劑量組的GSH-px活力與其他各組相比有極顯著的提高（P＜0.01），低劑量組和高劑量組與對(duì)照組相比略有下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。對(duì)于SOD含量，各劑量組與對(duì)照組相比，都有極顯著提高（P＜0.01），其中，中劑量組的SOD含量最高，且與低劑量組、高劑量組都有顯著差異（P＜0.05）。高劑量組較低劑量組SOD含量有提高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)于MDA含量，各劑量組與對(duì)照組相比，皆有不同程度的降低。對(duì)照組與低劑量組差異極顯著（P＜0.01），與中劑量組差異顯著（P＜0.05），與高劑量組差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。對(duì)于8-ISO-PGF2α，各劑量組與對(duì)照組相比，皆有不同程度的降低。對(duì)照組與低劑量組和中劑量組差異顯著（P＜0.05），但與高劑量組差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。

3 討論

3.1 不同劑量的微生物源性抗氧化劑對(duì)小鼠睡眠的影響

研究表明，失眠與氧化應(yīng)激存在著一定的關(guān)系［1，2］。因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)富含不飽和脂肪酸，容易受到氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化的干擾，而睡眠與覺(jué)醒又是主要通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控。所以，睡眠時(shí)間的長(zhǎng)短及質(zhì)量在很大程度上受到氧化應(yīng)激的影響。

Ikeda M等［3］（2005）在給小鼠第三心室以100 μL/10 h的流速注射叔丁基過(guò)氧化氫（TBHP，一種強(qiáng)氧化劑）的實(shí)驗(yàn)中表明，0.1 μmol/L的TBHP能夠顯著延長(zhǎng)非快速眼動(dòng)睡眠的時(shí)間（NREM）和快速眼動(dòng)睡眠時(shí)間（REM），而REM的延長(zhǎng)能夠顯著增加整個(gè)睡眠時(shí)間。但繼續(xù)增加劑量（1 μmol/L），睡眠時(shí)間并沒(méi)有增加。高劑量（10 μmol/L）TBHP反而減少了NREM，顯示出了顯著的睡眠抑制效應(yīng)。產(chǎn)生的原因可能是因?yàn)楦邼舛鹊腡BHP所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激效應(yīng)使中視前區(qū)區(qū)域神經(jīng)（睡眠及體溫的控制中心）受到損傷。而注射低濃度TBHP時(shí)，并不能觀察到注射區(qū)附近的氧化損傷，這一結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有一定的一致性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在氧化應(yīng)激程度最低時(shí)，小鼠睡眠時(shí)間最長(zhǎng)。從表2可以看出，各實(shí)驗(yàn)組的MDA以及8-ISO-PGF2α與對(duì)照組相比，皆有顯著下降，說(shuō)明在飼養(yǎng)過(guò)程中，小鼠受到了氧化損傷，而灌胃的微生物源性抗氧化劑在一定程度上緩解了氧化損傷的作用。同時(shí)，在中劑量組時(shí)，GSH-px和SOD活力顯著高于其他劑量組。說(shuō)明在此劑量下微生物源性抗氧化劑的抗氧化效果最好，受到的氧化應(yīng)激損傷最低。而從表1中可以看出，中劑量組小鼠的睡眠時(shí)間也顯著高于低、高劑量組小鼠的睡眠時(shí)間。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前的研究［4，5］，微生物源性抗氧化劑具有顯著的抗氧化能力，其中含有886 mg/ 100 g含量的GSH。GSH是一種重要的抗氧化劑。而氧化型谷胱甘肽（GSSG）可由GSH轉(zhuǎn)化形成，是一種重要的睡眠促進(jìn)物質(zhì)，在谷氨酸受體的突觸水平上能夠抑制神經(jīng)傳遞的興奮性。在 10～100 nmol/L范圍注射氧化型谷胱甘肽（GSSG）和還原型谷胱甘肽的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GSSH及GSH對(duì)睡眠時(shí)間的作用呈現(xiàn)鐘形趨勢(shì)。在25 nmol（GSSG）和50 nmol（GSH）時(shí)分別呈現(xiàn)最顯著的提高［6］。這一結(jié)論也與本實(shí)驗(yàn)中，在受到氧化應(yīng)激損傷程度最小的中劑量組時(shí)睡眠時(shí)間顯著高于低、高劑量組小鼠的睡眠時(shí)間這一鐘形曲線相吻合。

3.2 不同劑量的微生物源性抗氧化劑對(duì)小鼠抗氧化性能的影響

從表2中可以看出，灌注中劑量微生物源性抗氧化劑，小鼠的GSH-px和SOD活力顯著高于其他劑量組，且低、中、高劑量組的MDA和8-ISO-PGF2α的濃度皆低于對(duì)照組。綜上數(shù)據(jù)表明，微生物源性抗氧化劑有一定抗氧化功效，但抗氧化效能并非隨著抗氧化劑劑量的增加而增加，在1.0 g/kg體重/d劑量下效果最好。說(shuō)明超高劑量的抗氧化會(huì)導(dǎo)致過(guò)氧化作用，實(shí)踐中盲目使用抗氧化劑不僅不能有效發(fā)揮機(jī)體抗氧化作用，反而可能使氧化應(yīng)激更加嚴(yán)重［7］。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在一定程度上也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。雖然ROS可攻擊不飽和脂肪酸，促使其發(fā)生氧化或過(guò)氧化，生成脂質(zhì)過(guò)氧化物，并降解成為丙二醛；可引發(fā)細(xì)胞內(nèi)蛋白氧化，線粒體損傷，誘發(fā)DNA結(jié)構(gòu)破壞，促使端粒變短，激活細(xì)胞凋亡信號(hào)，最終影響細(xì)胞壽命［8］。但在正常生理?xiàng)l件下生成的微量的ROS對(duì)維持細(xì)胞的正常功能（包括信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控）具有十分重要的意義［7］。在高等動(dòng)物的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，正常生理功能的維持需要較高水平的ROS，且神經(jīng)細(xì)胞對(duì)ROS濃度的變化能夠作出較為敏感的反應(yīng)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，ROS可增強(qiáng)體內(nèi)胰島素信號(hào)的敏感性［9］，這表明，ROS可能作為細(xì)胞內(nèi)生命代謝的介導(dǎo)物，并作為一種信號(hào)分子從細(xì)胞外環(huán)境到細(xì)胞進(jìn)行傳遞［7］。

綜上，正常生理?xiàng)l件下低劑量的ROS處于平衡狀態(tài)，并對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和生理功能起著十分重要的作用。當(dāng)在生理?xiàng)l件下添加抗氧化劑過(guò)度清除ROS，而導(dǎo)致氧化還原失衡，也可誘發(fā)細(xì)胞信號(hào)紊亂，觸發(fā)機(jī)體中自我代償性的促氧化系統(tǒng)的啟動(dòng)［7］。由上可知，大劑量補(bǔ)充抗氧化劑對(duì)機(jī)體是有害的，非氧化應(yīng)激條件下抗氧化劑的大量補(bǔ)充也存在著促氧化的潛在可能。因而，確定適宜的劑量對(duì)抗氧化劑的抗氧化效應(yīng)的發(fā)揮極為關(guān)鍵。

4 結(jié)論

1.0 g/kg.d體重的微生物源性抗氧化劑可以顯著延長(zhǎng)小鼠的戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間，顯著提高GSHPx和 SOD活力，著降低 MDA和8-ISO-PGF2α含量，說(shuō)明微生物源性抗氧化劑有促進(jìn)小鼠睡眠、提高機(jī)體抗氧化能力的作用，且在1.0 g/kg體重劑量下效果最顯著。

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〔修回日期〕2016-03-28

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）06-0028-04

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.006

［作者簡(jiǎn)介］余思佳（1992-），女，研究方向：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)E-mail：scarlettyu@yeah.net。

［通訊作者］徐建雄（1962-），男，教授，博士，研究方向：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)Email：jxxu1962@sjtu.edu.cn。

Effects of microbe-derived antioxidant on sleep and antioxidant ability in the rat

YU Si-jia1，2，XU Jian-xiong1，2
（1.School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China；2.Shanghai Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Shanghai 200240，China）

【Abstract】Objective To investigate the effect of different doses of microbe-derived antioxidant on sleep and antioxidant ability in mice.Methods Sixty male Kunming mice with similar body weight were randomly divided into 4 groups.The control group received normal saline，and the experimental groups received microbe-derived antioxidant in a dose of 0.5 g/kg bw，1.0 g/kg bw or 1.5 g/kg bw once per day，respectively.The experiment period was 30 days.At the end of experiment，the mice of each group were intraperitoneally injected sodium pentobarbital to induce sleep.The mice fall sleep was judged by righting reflex.After the test of sleep，blood was taken for detection of serum antioxidant ability. Results Compared with the low dose and high dose groups，the middle dose group showed a significantly prolonged sodium pentobarbital-induced sleeping time（P＜0.05）.Compared with the control group，low and high dose groups，the middle dose group had highly significantly increased GSH-Px activity（P＜0.01）and significantly increased content of SOD.Under these conditions，the middle dose group reduced both the contents of MDA and 8-ISO-PGF2α（P＜0.05）compared with the control group.Conclusions Our results suggest that microbe-derived antioxidant exerts effect on sleep and antioxidant ability in rats.Supplement of 1.0 g/kg bw/d shows the most significant effects.

【Key words】Microbe-derived antioxidant；Righting reflex；Antioxidant ability；Sleep；Rat