新生兒缺氧缺血腦損傷大鼠模型的制備

龐 煒，曹帥帥，李樹祎，田雨光，顧為望

（1.南方醫科大學實驗動物中心，廣州 510515；2.廣州醫科大學口腔教研室，廣州 510182）

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新生兒缺氧缺血腦損傷大鼠模型的制備

龐 煒1，曹帥帥2，李樹祎2，田雨光1，顧為望1

（1.南方醫科大學實驗動物中心，廣州 510515；2.廣州醫科大學口腔教研室，廣州 510182）

【摘要】目的 在高原低壓環境模擬倉內，模擬新生兒在高原環境下缺氧缺血腦損傷的過程，制備不同海拔高度下高原腦損傷大鼠模型。方法 10日齡的SD新生大鼠32只，隨機分為4組，即A組（對照組）和3個實驗組：B組（2 000 m組）、C組（4 000 m組）、D組（6 000 m組）。對照組大鼠在屏障環境中飼養，實驗組大鼠置于高原低壓環境模擬倉結合運動的方法制作新生兒高原腦缺氧缺血模型，運動方式為在艙內游泳槽進行60 min/d的游泳運動，且在高原低壓環境模擬倉內生活時間每天不得少于20 h。每組大鼠分別在第3、7、11、15天用Zea Longa 5分制評分標準進行行為學評分并且于第15天采集靜脈血，在掃描電鏡下觀察紅細胞形態。每組處死后取腦組織進行HE染色和TTC染色。結果 （1）神經病學評分：實驗組B組、C組、D組行為學評分與對照組大鼠相比，行為學評分差異顯著（P＜0.05），D組與對照組相比差異非常顯著（P＜0.01）。（2）HE染色結果顯示：與對照組大鼠相比，實驗組大鼠均有炎癥細胞浸潤，且炎癥細胞浸潤程度與海拔高度成正相關。（3）TTC染色表明：在高原環境下大鼠的大腦皮質缺血明顯。（4）電鏡下觀察紅細胞形態顯示：實驗組B組呈帽狀結構；C組呈不規則形；D組呈鋸齒狀。結論 本研究采用高原低壓環境模擬倉結合運動模擬高原環境制作新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）的模型，該模型穩定、可靠，比其他方法更符合缺血缺氧腦損傷的發病機理，與臨床貼近，可用于相關研究。

【關鍵詞】新生兒腦缺氧缺血性腦?。籘TC染色；掃描電鏡；大鼠

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage.HIBD）是因腦組織部分或完全缺氧、腦血流量減少或暫停導致的腦損傷，最終可造成神經細胞的凋亡和壞死。其中一種高發病人群為新生兒，稱為新生兒缺氧缺血性腦病 （hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）［1-3］。是指圍產期窒息缺氧所引起的腦損傷，嚴重者可造成永久性神經功能損害，是兒童神經系統損傷的常見原因之一。重度HIE患兒即使存活下來，也?；加心X癱、智力障礙、癲癇等嚴重的中樞神經系統后遺癥［4，5］。目前臨床上對于HIE的治療主要局限于護理及支持療法。長期以來，研究和開發有效的治療HIE藥物，是新生兒科醫學研究的重要任務。近年來，神經干細胞在胚胎和成年個體神經系統中的發現以及體外培養成功為缺氧缺血性腦病的細胞移植治療和基因治療，提供了新的方法［6，7］。在了解這些治療方案療效及其作用機制的研究中，HIE動物模型起到了非常重要的作用。在高原地區，大氣氧分壓較低，由于高原低氧的影響，新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）在高原地區發病率比較高［8］。本實驗采用高原低壓環境模擬倉結合大鼠游泳運動的方法建立在高原地區新生兒缺氧缺血性腦病模型，觀察其行為學、腦組織病理變化、腦TTC染色和紅細胞，為HIE在高原地區的臨床研究做基礎實驗準備。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：10日齡的SPF級SD新生大鼠32只，體重為30～50 g，雄性，購自南方醫科大學實驗動物中心【SCXK（粵）2011-0015】，使用許可證號：【SYXK（粵）2011-0074】，飼養條件為屏障環境，室溫（20～26）℃，光照控制12 h（7：00 a.m.～7：00 p.m.），自由采食飲水。

1.1.2 試劑與設備：高原低壓環境模擬倉 LT/ ACR-2002（北京易盛泰和科技有限公司）；掃描電鏡Hitachi型號 S-3400N（日本日立公司）；TTC染料（南京奧多福尼生物科技有限公司）

1.2 方法

1.2.1 動物分組：32只10日齡SD大鼠，編號后，隨機分成4組，即：對照組（A組）、2 000 m海拔高原組（B組）、4 000 m海拔高原組（C組）和6 000 m海拔高原組（D組），每組8只。對照組（A組）大鼠在屏障環境正常飼養，實驗組大鼠在高原低壓環境模擬倉生活和運動15 d（溫度：（26±2）℃；濕度：45%±5%RH；正常晝夜節律）運動方式為在艙內游泳槽進行60 min/d的游泳運動，大鼠不能以尾部支持底部得到休息，水溫為 30℃，水深為鼠尾長1.5倍。實驗組大鼠在高原低壓環境模擬倉內生活時間每天不得少于20 h（其余時間為換水、加飼料、清潔）［9-11］。

1.2.2 神經病學評分：依次在第3、7、11、15天取出對照組和實驗組大鼠，進行Zea Longa 5分制行為學評分，具體評分標準如下：0分，無神經損傷癥狀；1分，對側前爪不能完全伸展；2分，行走時向癱瘓側轉圈；3分，走路不穩，向對側傾倒；4分，不能自發行走，意識喪失［12］。

1.2.3 HE染色：在第15天從對照組和實驗組分別取出4只新生鼠，以3%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于鼠板上，剪開胸腔，暴露出心臟，先用手術剪剪開右心耳，再用1 mL注射器進入左心室插進主動脈，先灌注生理鹽水150 mL左右，再灌注10%多聚甲醛400 mL左右，斷頭取出全腦。置于40 g/L多聚甲醛固定，脫水、透明、浸蠟、包埋、冠狀切片，厚4 μm，制作常規病理切片，進行蘇木精-伊紅染色后用光學顯微鏡觀察。HE染色切片制作流程如下：（1）切片入二甲苯2次，每次20 min，以脫去石蠟；（2）入100%、95%、85%的酒精，每次10～15 min；（3）入蘇木精染液染色5min：（4）用自來水洗去多余的染液；（5）入鹽酸酒精約10 s分色，至細胞核著色較深，其它結構無色時為宜；（6）自來水緩洗10 min，使蘇木精“藍化”，胞核呈藍色；（7）入1%伊紅染液染色約2 min；（8）用蒸餾水洗去多余的伊紅；（9）經濃度遞增的酒精脫水；（10）入100%酒精脫水2次，每次約 l0 min；（11）入二甲苯透明2次，每次約15min；（12）擦去載玻片上多余的二甲苯，在切片上滴中性樹膠1 ～2滴，加蓋玻片封片，干燥環境保存，鏡下觀察、拍照［13］。

1.2.4 TTC染色：在第15天從A、B、C、D 4組中各取出剩余4只新生大鼠，采用頸椎脫臼發處死，小心快速取出全腦，置-20℃冰箱冷凍20 min，取出用刀片切片，第1刀在腦前極與視交叉連線中點處；第2刀在視交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第4刀在漏斗柄與后葉尾極之間，切成五六片，每隔2 mm切一片。將切片置于1%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）用錫箔紙蓋住后，放入37℃水浴鍋中避光染色10～30 min，不時翻動腦片，使均勻接觸到染色液，染色后進行拍照，觀察腦組織［14］：未缺血壞死區顏色呈淡紅色，已缺血壞死組織呈白色。

1.2.5 掃描電鏡：在第15天取對照組和模擬組共32只大鼠，采靜脈血1～2滴直接滴5 mL新鮮配制的質量分數2.5%戊二醛固定液中，輕輕振蕩后靜置于4℃冰箱中半小時以上，取適量已固定好血樣于1.5 mL離心管，低速離心（1 500 r/min）去上清液，0.1 mol/L PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min；體積分數50%、70%、80%、90%、100%酒精（2次）脫水，每次都需低速離心（1 500 r/min），最后滴于預先覆有 Formvar膜的潔凈蓋玻片上，室溫自然干燥［15］。3 d后用雙面膠帶將干燥后的蓋玻片粘貼在樣品臺上，SUPER CT-2000離子濺射儀噴金，Hitachi S-3400N掃描電鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 神經病學評分

對照組行為學均正常，在行為學評分中為0分，而實驗組大鼠行為學異常，主要表現為一側肢體感覺和運動功能障礙和平衡功能的異常。實驗組大鼠評分隨海拔升高而升高，行為異常程度與海拔高度呈正相關。并且實驗組大鼠在第3、7、11、15天行為學評分逐漸升高（表1），這一數據表明在高原環境下缺氧時間越長腦損害越嚴重，實驗表明對照組與各實驗組差異有顯著性意義（P＜0.05）海拔6000 m組與對照組比較差異非常顯著（P＜0.01）（圖1）。

圖1 不同海拔高度下新生大鼠神經病學評分Fig.1 Neurological scores of the neonatal rats treated by different altitude hypoxia

2.2 腦組織病理學改變

對照組腦組織神經細胞、神經膠質細胞大小、外形正常，未出現腦水腫；在海拔2 000 m大腦皮質輕度萎縮，神經元細胞輕度水腫，膠質細胞輕度增生；在海拔4 000 m大腦皮質中度萎縮，神經元細胞中度水腫，膠質細胞中度增生；在海拔6 000 m室管膜細胞重度水腫（圖2）。

2.3 TTC染色結果

TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感復合物，它是呼吸鏈中吡啶—核苷結構酶系統的質子受體，與正常組織中的脫氫酶反應而呈紅色，而缺血組織內脫氫酶活性下降，不能反應，故不會產生變化呈蒼白［16］。對照組TTC染色結果為紅色，未出現缺血缺氧表現；海拔2 000 m出現輕度改變，大腦皮質出現小片蒼白；海拔4 000 m大腦皮質區可明顯看見蒼白區域；海拔6000 m接近一半出現蒼白區（圖3）。利用Image-Pro Plus做出海拔2 000 m組腦缺氧面積為26.6%，海拔4 000 m組腦缺氧面積為 34.3%，海拔 6 000 m組腦缺氧面積為56.6%，而對照組則為正常。

2.4 電鏡下紅細胞

在掃描電鏡下可以看見對照組紅細胞呈雙凹圓盤狀，在海拔2 000 m下電鏡表現為輕度改變呈帽狀結構；在海拔4 000 m下表現為不規則形；在海拔6 000 m下表現為鋸齒狀，部分紅細胞會出現空洞，崩解（圖4）。

3 討論

表1 不同海拔高度下新生大鼠神經病學評分Tab.1 Neurological scores of the neonatal rats treated by different altitude hypoxia

A組為對照組；B組為2 000 m組，膠質細胞輕度增生；C組為4 000 m組，膠質細胞中度增生；D組為6 000 m組，室管膜細胞重度水腫圖2 不同海拔下新生大鼠腦病理HE染色切片（×400）Note.A is the control group.B is the 2 000 m group，showing mild hyperplasia of glial cells.C is the 4 000 m group，showing moderate hyperplasia of glial cells.D is the 6 000 m group，showing severe edema of ependymal cells.Fig.2 Histological changes of the neonatal rat brain tissues treated by different altitude hypoxia.HE staining.×400

A組為對照組；B組為2 000 m組，大腦皮質出現小片蒼白；C組為4 000 m組，大腦皮質蒼白區明顯；D組為6 000 m組，大腦皮質近一半出現蒼白圖3 不同海拔下新生大鼠腦切片TTC染色Note.A is the control group.B is the 2 000 m group，showing small pale areas of cerebral cortex.C is the 4 000 m group，showing more distinct pale area of cerebral cortex.D is the 6 000 m group，showing nearly half of the cerebral cortex became pale.Fig.3 Gross appearance of the brains of neonatal rats，treated by different altitude hypoxia.TTC staining

A組為對照組；B組為2 000 m組呈帽狀結構；C組為4 000 m組呈不規則形；D組為6 000 m組呈鋸齒狀圖4 不同海拔下新生大鼠電鏡下紅細胞（×10 000）Note.A is the control group.B is the 2 000 m group，showing cap-like shape.C is the 4 000 m group，showing irregular shape.D is the 6 000 m group showing zigzag shape.Fig.4 Scanning electron microscopic appearance of erythrocytes of the neonatal rats treated by different altitude hypoxia.×10 000

新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）是指圍產期窒息缺氧所引起的腦損傷，嚴重者可造成永久性神經功能損害，是兒童神經系統損傷的常見原因之一。重度HIE患兒即使存活下來，也常患有腦癱、智力障礙、癲癇等嚴重的中樞神經系統后遺癥在臨床多見，死亡率高。而在高原地區，大氣氧分壓較低，由于高原低氧的影響，新生兒缺氧缺血性腦病（HIE）在高原地區發病率比平原地區更高。所以建立高原環境下的缺氧缺血動物模型是了解HIE在高原環境下的發病機制，評估各治療方法療效的重要研究基礎。本實驗在模型制備上不同于近年來常見的缺氧缺血模型制作方法：比如孕鼠腹腔感染、大腦中動脈阻塞、結扎雙側頸動脈等，孕鼠腹腔感染的致死率比較高；大腦中動脈阻塞的方法制作模型雖然更貼近新生兒缺氧缺血臨床病因，但是線栓法結扎大腦中動脈操作復雜有難度，不易成功；結扎雙側頸動脈的方法雖然比大腦中動脈阻塞操作簡單，但是手術后溫度要保證在36℃～37℃，不然術后動物死亡率高。［17］上述三種造模方法會造成損傷，難以量化。本實驗采取的是模擬高原情況下缺氧缺血合并運動的模型制作方法，因為這種方法容易操作，可以量化，并且結合游泳運動的方法，模擬人在高原環境中運動下的腦缺氧缺血，更加接近高原環境臨床疾病的發生的條件，故選取此方法。

行為學測試結果表明，實驗組大鼠評分為明顯高于對照組，差異有顯著性意義（P＜0.05），實驗組大鼠評分隨海拔升高而升高，行為異常程度與海拔高度呈正相關，并且通過實驗組大鼠在第3、7、11、15 d行為學評分可以看出高原環境下缺氧時間越長腦損害越嚴重。病理結果表明，隨著海拔高度從2 000 m、4 000 m到6 000 m上升，腦組織的病理變化逐漸加重，在海拔2 000 m、4 000 m以膠質細胞增生為主，而在6 000 m以室管膜細胞重度水腫為明顯改變。TTC染色結果表明在模擬高原環境下新生大鼠在不同海拔高度顯示出不同程度的缺血表現，并且隨著海拔高度的增高，腦缺血逐漸加重，主要以大腦皮質的缺血為主。掃描電鏡的結果表明對照組紅細胞的形態為正常雙凹圓盤狀，實驗組在不同海拔高度下缺氧時紅細胞的形態有不同程度的改變。以上實驗結果均可說明由于在高原環境的缺氧可導致新生大鼠的腦缺氧缺血的形成［18］，則造模成功。

在模型制作中，由于在高原環境下海拔2 000 m的高原居民多見，所以2 000 m做為實驗組的最低海拔組，在此海拔高度上做出的模型更貼近實際情況。為了讓實驗有比較與對比，更符合高原環境，實驗組還加入了4 000 m組和6 000 m組。而海拔6 000 m以上幾乎無人居住，為模型分組的最高極限值，所以以海拔6 000 m組為實驗組的海拔最高組，未選入8 000 m組。標準大氣壓為：1.013×105Pa，等于760 mmHg且每升高12 m，大氣壓約下降133 Pa。由于在不同海拔高度的高原地區，大氣壓在低于平原地區的情況下新生兒的健康就成為一個迫切的問題。目前應該對高原地區有神經系統異常表現的新生兒進行頭顱超聲或者頭顱CT的檢查，確診后及時治療，而非當地居民的孕婦最好在平原地區待產，以確保新生兒的健康。綜上所述，本實驗建立了比較理想的高原新生兒缺氧缺血腦損傷模型。

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〔修回日期〕2016-02-22

調查與觀察

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）06-0061-06

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.012

［基金項目］高新區發展引導專項（2012B011000004）；廣東省科技基礎條件建設項目（2012B060300003）；高新區發展引導專項（2010A011200003）；廣東省科技基礎條件建設項目（2013B030300040）；廣東省科技基礎條件建設項目（2013B060300001）；廣東省科技基礎條件建設項目（2010B060500001）；國家國際科技合作專項項目（2011DFA33290）。

［作者簡介］龐煒（1989-），女，碩士，南方醫科大學，主要從事實驗動物的研究。E-mail：1583281060@qq.com。

［通訊作者］田雨光（1987-），男，博士，南方醫科大學，主要從事實驗動物的研究。郵箱471977663@qq.com；顧為望（1956-），男，教授，博士研究生導師，南方醫科大學，主要從事實驗動物與比較醫學的研究。E-mail：guww100@163.com。environment.Zea Longa 5 point scale standard was used to determine the behavioral scores at the 3 th 7 th 11 th 15 th days，and samples were collected on the 15thday to observe red blood cell morphology using HE and 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride（TTC）staining and ultrastructure by scanning electron microscopy.Result （1）The neurological scores of the test groups A，B，C were significantly different from that of the control group（P＜0.05），and the scores of test group D and control group were very significantly different（P＜0.01）.（2）The histopathological examination using HE staining showed inflammatory cell infiltration in all rats of the test groups，and the extent of inflammatory cell infiltration was positively correlated with the increase of altitude.（3）The histopathology with TTC staining revealed prominent ischemia in the cerebral cortex of rats in the plateau hypoxic environment.（4）Scanning electron microscopy showed that the rat erythrocytes were cap-like in the group B，irregular in the group C，and zigzag shape in the group D.Conclusions In this study，a rat model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy（HIE）is successfully established by hypoxic cabin combined with sport activity.This model is stable，reliable，more closely mimicking the pathogenesis and clinical manifestation of neonatal HIE than models prepared with other methods，therefore，may be used in related research.

Preparation of a rat model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy

PANG Wei1，CAO Shuai-shuai2，LI Shu-yi2，TIAN Yu-guang1，GU Wei-wang1
（1.Experimental Animal Center，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2.Department of Stomatology，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，China）

【Abstract】Objective To simulate the process of hypoxic-ischemic brain injury at high altitude in a simulated cabin with plateau low pressure environment，and to prepare a rat model of cerebral injuries at different high altitudes. Method Thirty-two 0-day-old neonatal SD rats were divided into four groups，namely group A（control group）and three test groups：group B（2000 m group），group C（4000 m group），and group D（6000 m group）.The rats of control group were reared in a barrier environment.The rats of test groups were placed in a simulated cabin with plateau low pressure environment，and to prepare neonatal cerebral ischemia-hypoxia model by sport activities.The sport movements were carried out in the cabin in a swimming groove 60 min/d，and not less than 20 hours a day at high altitude low pressure

【Key words】Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy，Hypoxic-ischemic encephalophathy，HIE；2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC；Histopathology；Scanning electron microscopy；Rats