中國實驗動物中鼠管狀線蟲的分子鑒定和感染調查

高正琴，李曉波，馮育芳，王 吉，付 瑞，邢 進，王淑菁，魏 杰，王 洪，鞏 薇，李冠民，賀爭鳴，岳秉飛

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

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技術方法

中國實驗動物中鼠管狀線蟲的分子鑒定和感染調查

高正琴，李曉波，馮育芳，王 吉，付 瑞，邢 進，王淑菁，魏 杰，王 洪，鞏 薇，李冠民，賀爭鳴，岳秉飛

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

【摘要】目的 對鼠管狀線蟲進行分子鑒定和感染調查，為國家標準的修訂提供參考依據。方法 923批5199只SPF動物（包括：1批5只猴，3批25只小型豬，28批55只兔，13批248只地鼠，37批198只豚鼠，93批459只大鼠，742批4179只小鼠，5批25只雞和1批5只鴨）和145批1389只清潔動物（包括：1批3只兔，4批31只地鼠，16批157只豚鼠，32批268只大鼠和92批930只小鼠）來自全國50個不同的廠家。應用直接鏡檢實時動態顯微視屏攝錄技術結合形態學鑒定方法，進行鼠管狀線蟲感染篩查。應用多重PCR和測序技術，鑒定分離的鼠管狀線蟲ITS（內轉錄間隔區）、28S rRNA（28S核糖體RNA）、nad1（NADH脫氫酶亞單位1）和cox1（細胞色素C過氧化物酶亞基1）基因，從分子水平上確證鼠管狀線蟲感染。結果 應用直接鏡檢實時動態顯微視屏攝錄技術，從動物中檢出鼠管狀線蟲的蟲卵、幼蟲和成蟲。根據鼠管狀線蟲的卵細胞、幼蟲、雌雄成蟲的大小和形態來鑒定蟲種。應用多重PCR測序技術，能從分離的單個鼠管狀線蟲的蟲卵、幼蟲和成蟲中鑒定出ITS、28S rRNA、nad1和cox1基因，與其他不同種屬的寄生蟲無交叉反應。應用直接鏡檢實時動態顯微視屏攝錄技術，從5199份SPF和1389份清潔動物樣本中分別檢出鼠管狀線蟲陽性樣本285份和135份。應用多重PCR和測序技術，鑒定證明這些陽性樣本中確實含有鼠管狀線蟲特異性的DNA。測序結果顯示，不同動物分離的鼠管狀線蟲的ITS、28S rRNA、nad1和cox1部分基因序列核苷酸相似性達100%。SPF和清潔動物的鼠管狀線蟲感染率分別為5.5%（285/5199）和9.7%（135/ 1389）。結論 應用直接鏡檢實時動態顯微視屏攝錄技術聯合多重PCR測序技術能夠快速精準檢測鑒定出鼠管狀線蟲。鼠管狀線蟲的人獸共患本質可以視作為公共衛生的一個預警。良好的動物質量控制對保護人類身體健康和保障人民用藥安全具有重要作用。本研究對中國SPF和清潔動物的鼠管狀線蟲進行了分子鑒定和感染調查。

【關鍵詞】實驗動物；鼠管狀線蟲；分子鑒定；感染調查

鼠管狀線蟲隸屬于線蟲綱（Nematoda）、尖尾目（Oxyurida）、管 狀 科 （Syphaciidae）、管 狀 屬（SyPhacia），也稱蟯蟲（Pinworm），寄居于腸道，輕度感染時無明顯臨床癥狀，重度感染時引起神經精神癥狀、生長發育障礙、腹痛腹瀉、腸炎等［1，2］。鼠管狀線蟲感染一方面損壞宿主的神經系統、血液循環系統、呼吸系統、消化系統、泌尿生殖系統、皮膚黏膜功能，另一方面影響宿主的腸道生理學、血液學指標，干擾免疫學、營養學、傳染病學、自生免疫性疾病等的研究，感染還可傳播擴散，增加宿主感染其他病原體的機會［3-6］。國家標準規定了清潔及以上動物中不得檢出全部蠕蟲［7，8］，但未見鼠管狀線蟲（SyPhacia muris）檢測方法，至今尚無精準快速檢測鑒定方法，更缺乏全面監測感染數據。本研究應用直接鏡檢實時動態顯微視屏攝錄技術檢測和形態學鑒定方法聯合多重 PCR（multiple polymerase chain reaction，multiple-PCR）和測序技術，對我國無特定病原體（specific pathogen-free，SPF）和清潔動物的鼠管狀線蟲進行快速檢測和分子鑒定并開展感染調查，對豐富完善國家標準、防控實驗動物疫病暴發、維護社會公共安全具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 儀器設備

生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，美國）；LEICA DM2500生物顯微鏡（Leica Microsystems，德國）；倒置顯微鏡及成像系統（Nikon，日本）；二氧化碳培養箱（北京五洲東方科技發展有限公司）；基因擴增儀（Applied Biosystyem，美國）；凝膠成像分析系統（東樂自然基因生命科學公司）。

1.2 樣品來源

923批5199只SPF動物（包括：1批5只猴，3 批25只小型豬，28批55只兔，13批248只地鼠，37 批198只豚鼠，93批459只大鼠，742批4179只小鼠，5批25只雞和1批5只鴨）和145批1389只清潔動物（包括：1批3只兔，4批31只地鼠，16批157只豚鼠，32批268只大鼠和92批930只小鼠）來自全國50個不同的廠家。對于猴、小型豬、兔等活體采集其直腸內容物或新鮮糞便樣本，對于地鼠、豚鼠、大鼠、小鼠等則安樂死后采集其回盲部內容物樣本。

1.3 直接鏡檢實時動態顯微視屏攝錄技術檢測和形態學鑒定鼠管狀線蟲

在負壓生物安全柜內，分別將采集的直腸內容物、回盲部內容物和新鮮糞便樣本，置潔凈離心管中，加生理鹽水充分混勻，棄上清液，沉淀置于新的潔凈離心管中，洗滌數次后重新懸浮，迅速連續滴片，應用直接鏡檢實時動態顯微視頻攝錄技術和形態學鑒定方法進行蠕蟲檢定。根據蠕蟲的蟲卵、幼蟲、成蟲的形態和大小等進行蟲種鑒定。

1.4 鼠管狀線蟲離體生存能力試驗

在負壓生物安全柜內，無菌移取新分離的鼠管狀線蟲，置培養瓶中，加入新鮮配制的含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM培養液，置37℃5% CO2實驗條件下培養，倒置顯微鏡觀察，實時拍攝記錄結果。

1.5 多重PCR和測序技術鑒定鼠管狀線蟲

為了后續鼠管狀線蟲DNA條形碼分子鑒定體系的建立，本研究選定的靶標基因是鼠管狀線蟲內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）、28S核糖體RNA（28 S ribosomal RNA，28 S rRNA）、NADH脫氫酶亞單位1（NADH dehydrogenase subunits 1，nad1）和細胞色素C過氧化物酶亞基1（cytochrome c oxidase subunit 1，cox1）基因，設計合成四對引物（表1）。建立優化多重PCR檢測體系和反應條件，進行特異性、靈敏性、穩定性試驗和方法評價驗證，應用于SPF和清潔動物鼠管狀線蟲檢測。將直接鏡檢實時動態顯微視屏攝錄技術檢出，經形態學鑒定為鼠管狀線蟲的單個蟲卵、幼蟲、雌性成蟲和雄性成蟲，提取DNA。分別以抽提的蟲卵、幼蟲和成蟲DNA為模板，同時用已知鼠管狀線蟲、四翼無翅線蟲（AsPiculuris tetraPtera）、隱匿管狀線蟲（SyPhacia obvelata）基因組DNA作陽性和陰性對照。鼠管狀線蟲PCR檢測總反應體系為50 μL，包括5.0 μL 10 ×buffer（Mg2+Plus）、4.0 μL dNTP mixture、各0.5 μL正反向引物、0.25 μL EX Taq、2.0 μL模板DNA、37.75 μL nuclease-free water。循環參數：95℃1 min 1 cycle；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，40 cycles；72℃ 10 min 1 cycle。瓊脂糖凝膠電泳檢測多重PCR擴增產物。提取SPF和清潔動物樣本DNA，作為模板DNA同上進行多重PCR檢測。陽性樣本進一步作多基因測序鑒定。

表1 鼠管狀線蟲多重PCR引物Tab.1 Multiplex-PCR primers of SyPhacia muris

2 結果

2.1 直接鏡檢實時動態顯微視屏攝錄技術檢測和形態學鑒定鼠管狀線蟲結果

鏡下可見：許多細小、乳白色蟲體游走蠕動，雌蟲較活潑且個體比雄蟲大，同時可見處于不同發育階段的幼蟲和蟲卵。雌蟲長2.8～4.0 mm，口孔在蟲體頭部頂端，有3片唇瓣環繞，頭端的角皮向周圍膨起形成頭翼，食管下部膨大成球狀（圖1A），陰門開口于蟲體前1/4處的腹側，陰門上方為一較長的陰道，陰道與前后排列的2根子宮相接，交配后有雄蟲射精管腺體分泌的棕黃色物質栓塞雌蟲陰門，子宮與輸卵管、卵巢相接，內部充滿卵（圖1B），蟲體中部膨大，尾端直而尖細，肛門開口于蟲體后1/6處（圖1C）。雄蟲長1.2～1.3 mm，射精管與直腸末端共同構成泄殖腔，經肛門通向外界，尾端明顯向腹側彎曲，尾端有引帶、交合刺，尾端角皮上有乳突（圖1D）。蟲卵大小為（72～82）μm×（25～36）μm，無色透明，殼薄，兩側稍不對稱，一側扁平，一側隆起，呈腎形，內含物為發育中的幼蟲，在卵一端的凹面有一粗糙小區，是幼蟲孵化出口或稱卵蓋（圖1E）。依據雌雄成蟲、幼蟲的形態、大小、構造和蟲卵的大小、形狀、顏色、卵殼、內含物特征，鑒定為鼠管狀線蟲。應用實時動態顯微視屏攝錄直接鏡檢技術檢測和形態學鑒定鼠管狀線蟲，結果從5199份SPF動物樣本中分離鑒定獲得285份鼠管狀線蟲活體陽性樣本，陽性率5.5%（285/5199）；從1389份清潔動物樣本中分離鑒定獲得135份鼠管狀線蟲活體陽性樣本，陽性率9.7%（135/1389）。自SPF和清潔動物中分離獲得，經形態學鑒定為鼠管狀線蟲的活體陽性樣本中，精心挑選出形態完整、特征典型的新鮮的鼠管狀線蟲單個蟲卵、幼蟲、雌性成蟲和雄性成蟲，特殊方法固定，保存備用。在研究中，筆者發現了一些動物個體同時自然感染鼠管狀線蟲與其他種屬寄生蟲（如：隱匿管狀線蟲、四翼無刺線蟲、鞭毛蟲、纖毛蟲、體外寄生蟲）的現象（另文報道）。形態學鑒定經驗不足者極易將鼠管狀線蟲誤判為隱匿管狀線蟲，筆者鑒別二蟲要點有五：第一，蟲卵：兩者均呈腎形，但前者較小且兩端鈍圓，后者較大且兩端尖銳；第二，成蟲：前者雌雄成蟲個體均小于后者，前者雌蟲陰門在蟲體前1/4處，交配后陰門有栓塞，而后者在蟲體前1/6處，陰門前后緣均有唇狀隆起；第三，蟲體頭端：前者角皮向周圍膨起形成頭翼，后者頸翼膜窄小而平緩；第四：食道：兩者食道前部皆為棒狀，但前者食管下部膨大如容量瓶樣球形，而后者恰似燒瓶樣球狀；第五，蟲體：前者中部膨大而尾部直且尖細，后者中部勻稱而尾部長且細尖。

2.2 鼠管狀線蟲離體生存能力試驗結果

對鼠管狀線蟲培養觀察發現：37℃5%CO2實驗條件下，鼠管狀線蟲離體至少能存活10 d。第2天時，鼠管狀線蟲的幼蟲可見包絡鞘，說明蛻皮發生。第3天，雌雄特征已清晰可辨。第4天，雌性成蟲陰門有深色陰道栓塞封閉，表明已發生交配。第5天，雄性成蟲行動遲緩出現死亡，雌性成蟲子宮中可見少量蟲卵。第6天，雌性成蟲子宮中可見大量蟲卵。第7天，雌性成蟲子宮中充滿成熟的卵。第8天，妊娠的雌性成蟲在暴露的空氣中產卵。第9天，產卵后的雌蟲形體萎縮死亡，蟲卵中含有發育完全的、活動的、有感染性的幼蟲。

圖1 中國SPF和清潔動物鼠管狀線蟲鏡檢形態（A：雌性成蟲前部；B：雌性成蟲腹部；C：雌性成蟲尾部；D：雄性成蟲尾部；E：蟲卵）Fig.1 Microscopic morphology of SyPhacia muris isolated from SPF and clean animals in China. A，Anterior portion of a female adult；B，Ventral side of a female adult；C，Posterior portion of a female adult；D，Posterior portion of a male adult；E，egg）

2.3 多重PCR和測序技術鑒定鼠管狀線蟲結果

對鼠管狀線蟲蟲卵、幼蟲、成蟲DNA分別進行多重PCR檢測，結果在單個蟲卵、幼蟲、雌性成蟲和雄性成蟲DNA樣本中，均可檢出鼠管狀線蟲靶標基因ITS（702 bp）、28S rRNA（507 bp）、nad1（396 bp）和cox1（296 bp）特異性目的片段，而作為陰性對照的四翼無翅線蟲、隱匿管狀線蟲卻未見特異性片段。將目的條帶回收純化后進行測序鑒定。將所獲得的鼠管狀線蟲多基因測序數據，在線提交NCBI，通過BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）進行比對分析，結果顯示本研究分離獲得的鼠管狀線蟲靶標基因ITS、28 S rRNA、nad1和cox1序列，與國際上已公布的不同國家不同來源的鼠管狀線蟲ITS、28 S rRNA、nad1和cox1基因核苷酸同源性達99% ～100%（GenBank登錄號為 EU263106.2、AB500174.1、HM204802.1和HM204808.1）。多重PCR和測序技術從基因角度證明了實驗動物鼠管狀線蟲感染。多重PCR和測序技術檢測鼠管狀線蟲結果與直接鏡檢實時動態顯微視屏攝錄技術檢測鼠管狀線蟲結果相一致。研究結果說明應用直接鏡檢實時動態顯微視屏攝錄技術聯合多重PCR和測序技術，能夠快速檢測精準鑒定鼠管狀線蟲。

本研究應用該技術對我國SPF和清潔動物的鼠管狀線蟲自然感染進行了監測，檢測5199只SPF動物（包括：5只猴，25只小型豬，55只兔，248只地鼠，198只豚鼠，459只大鼠，4139只小鼠，25只雞，5只鴨），檢測結果顯示，SPF動物的鼠管狀線蟲陽性檢出率為5.5%（285/5199），其中：SPF豚鼠、大鼠和小鼠的鼠管狀線蟲感染率分別為2%（4/198）、12.4%（57/459）和5.4%（224/4179），而SPF猴、小型豬、兔、地鼠、雞和鴨未檢出鼠管狀線蟲；檢測1389只清潔級動物（包括：3只兔，31只地鼠，157只豚鼠，268只大鼠，930只小鼠），檢測結果顯示，清潔動物鼠管狀線蟲陽性檢出率為9.7%（135/ 1389），其中：清潔豚鼠、大鼠和小鼠的鼠管狀線蟲感染率分別為5.1%（8/157）、10.8%（29/268）和10.5%（98/930），而清潔兔、地鼠未檢出鼠管狀線蟲（表2）。

表2 中國SPF和清潔動物鼠管狀線蟲感染監測結果Tab.2 Prevelance of SyPhacia muris infestation in SPF and clean animals in China

3 討論

鼠管狀線蟲生活史屬直接型，感染期蟲卵被宿主攝食后，在十二指腸內經消化液的作用，幼蟲孵出，沿小腸下行，經幾次蛻皮發育為成蟲。成蟲寄生在盲腸、結腸及回腸下部，重度感染時可達胃和食管等處。雌、雄蟲交配后，雄蟲很快死亡并排出體外，故宿主腸道內雌蟲數比雄蟲多。雌蟲在腸道內低氧、溫度及pH等影響下不排卵或僅排少量卵。而在宿主睡眠時肛門括約肌處于松弛狀態下，妊娠雌蟲便乘機移行至肛門外，受肛周溫濕度及氧氣的刺激，蟲體頭尾交替收縮蠕動，子宮發生強有力的收縮，瞬間排出大量蟲卵。粘附在肛周的蟲卵6 h后發育成熟，蛻皮1次后成為感染期蟲卵，卵細胞內是發育完全的、活動的、有感染性的幼蟲。排卵后的雌蟲或孵化出的幼蟲可經肛門逆行進入腸內或鉆入陰道、尿道內引起新的感染［9-12］。蟲卵輕得可以漂浮在空氣中，造成大面積的環境污染［13］。蟲卵可經空氣中的粉塵、污染的設備、動物和人進行傳播。Stone［14］報道美國研究人員在兒童和猴子的糞便中檢出鼠管狀線蟲卵。Lytvynets［15］報道捷克實驗動物繁育設施中的灰塵、空調、飼養籠和技術人員手的鼠管狀線蟲卵檢出率分別為7.6%、28.7%、50.8%和37.9%。鼠管狀線蟲卵高度耐受各種環境因素如低溫、干燥和消毒劑［16］，一旦污染不易去除。Meade［17］報道鼠管狀線蟲卵在外界環境中暴露7個月依然具有活力。本文作者在37℃5%CO2實驗條件下研究發現，鼠管狀線蟲可在體外存活近十天。本研究獲得的鼠管狀線蟲可作為模式生物，用于抗寄生蟲藥物篩選研究，也可作為人類寄生蟲病動物模型制備材料，進一步開展該蟲的致病機理研究。

鼠管狀線蟲的自然感染在世界各地流行。Tung等［18］報道臺灣野生大鼠的鼠管狀線蟲感染率為28.6%。Paramasvaran等［19］報道馬拉西亞野生大鼠的鼠管狀線蟲感染率為17.6%。Kataranovski等［20］報道南斯拉夫野生大鼠的鼠管狀線蟲感染率為7.4%。Sharma等［21］報道印度野生大鼠和小鼠的鼠管狀線蟲感染率分別為 6.97% 和 8.57%。Kamranrashani等［22］報道伊朗野生小鼠的鼠管狀線蟲感染率為2.89%。Hayashimoto等［23，24］報道日本實驗小鼠和寵物小鼠鼠管狀線蟲感染率分別為6.2%和46.4%。Hussey等［25］報道美國實驗鼠鼠管狀線蟲感染率為100%。Beyhan等［26］報道土耳其實驗大鼠和小鼠的鼠管狀線蟲感染率均為100%。我們的研究調查結果顯示：我國SPF和清潔動物鼠管狀線蟲感染率分別為5.5%和9.7%，其中：SPF豚鼠、大鼠和小鼠的鼠管狀線蟲感染率分別為2%、12.4%和5.4%；清潔豚鼠、大鼠和小鼠的鼠管狀線蟲感染率分別為5.1%、10.8%和10.5%。實驗動物寄生蟲感染對人類寄生蟲感染起一定的儲存和傳播作用，在流行病學上具有重要意義。即使當下進行的胚胎干細胞移植也并不能消除所有的感染性的病原體［27］。人獸共患病名錄中人獸共患寄生蟲病69種，我國存在60種［28-30］。最近我國時有SPF或清潔動物因人獸共患寄生蟲感染致病或致死的報道［31-33］。當前，我國實驗動物感染人獸共患寄生蟲的現狀不容樂觀。實驗動物攜帶的人獸共患寄生蟲，不僅會污染環境、飲水、食品、空氣，同時也會對人類健康造成危害，已污染的實驗動物用于食品藥品生物制品醫療器械檢定或動物種質資源收集保存分發后果不堪設想。因此，各實驗動物種子中心承擔單位和動物繁育生產單位一定要高度重視人獸共患寄生蟲病原體的生物安全性問題，切實落實自查抽查工作，及時發現并處理被污染的動物、糞便、墊料、飼料、飲水、籠器具、通風排氣系統，徹底殺滅病原體并作無害化處理，避免污染公共水源和周邊環境，要認真查找、嚴格控制并切斷污染源，強化公共衛生安全防控意識，保證動物質量，保障人員安全，保護生態環境。

目前，直接檢查腸道內容物仍是蠕蟲檢測的“金標準”，其局限性是安樂死動物［34］。肛周膠帶法可檢測宿主肛周粘附的蟯蟲卵，但漏檢率較高［35］。糞便漂浮法常用于檢測產糞量較大的動物糞便中蟲卵，不太適合實驗動物［36］。Parel等［37］曾用ITS2區PCR-RFLP鑒定鼠管狀線蟲，PCR擴增后再進行酶切和電泳，操作繁瑣且易污染。Leblanc等［38］曾在蟯蟲通用引物PCR中得到了假陽性結果。Dole等［39］曾認為PCR檢蟲卵比糞檢法靈敏，但后來在PCR檢測陰性樣本中竟然發現了活的蟲體，提示單純PCR方法不適合感染性的寄生蟲病原體檢測。本研究中，我們將直接鏡檢實時動態顯微視屏攝錄技術和形態學鑒定方法聯合多重PCR和測序技術應用于鼠管狀線蟲的快速檢測和分子鑒定，進行了方法學研究和驗證，并對動物鼠管狀線蟲感染情況進行了監測，對鼠管狀線蟲篩查和確認的有效性進行了評價。應用多重PCR能夠檢測出單個鼠管狀線蟲卵、幼蟲、雌性成蟲和雄性成蟲DNA，經多基因測序技術鑒定出鼠管狀線蟲靶標基因ITS、28S rRNA、nad1和cox1，與其他不同種屬的寄生蟲無交叉反應，尤其是形態學鑒定上與鼠管狀線蟲容易混淆的隱匿管狀線蟲和四翼無刺線蟲，表明：多重PCR結合測序技術檢測鑒定鼠管狀線蟲具有較高的靈敏度和特異性。對直接鏡檢實時動態顯微視屏攝錄技術檢出，經形態學鑒定為活體鼠管狀線蟲的285份SPF和135份清潔動物陽性樣本，分別提取DNA后，用多重PCR檢測，均能獲得預期目的條帶，陽性樣本測序證實獲得的是鼠管狀線蟲靶標基因ITS、28S rRNA、nad1和cox1。測序結果顯示，不同SPF和清潔動物分離獲得的鼠管狀線蟲的ITS、28S rRNA、nad1和cox1基因核苷酸相似性達100%。應用多重PCR和測序技術檢測SPF和清潔動物樣本中的鼠管狀線蟲，結果分別檢出285份和135份陽性，SPF和清潔動物鼠管狀線蟲陽性率分別為5.5%（285/5199）和9.7%（135/1389）。診斷靈敏度二者無差異。直接鏡檢實時動態顯微視屏攝錄技術通過形態學鑒定鼠管狀線蟲聯合多重PCR和測序技術通過基因分析方法鑒定鼠管狀線蟲的分子驗證結果相吻合，顯示多重PCR和測序技術檢測鑒定鼠管狀線蟲的特異性，提示今后可將ITS、28 S rRNA、nad1和cox1基因作為鼠管狀線蟲快速檢測精準識別的分子靶標，有效擴展目前檢疫檢測方法和常規健康監測途徑，為國家標準修訂提供技參考依據和技術支撐，獲得的多基因位點數據可用于鼠管狀線蟲遺傳多樣性研究，為進一步開展分子流行病學調查奠定基礎。

歐洲實驗動物學會聯合會制定了統一的歐洲標準，規定腸道蠕蟲是實驗動物要求檢測的病原體［40］。日本中央實驗動物研究所實驗動物質量控制標準規定必檢蟯蟲。隨著中國社會經濟的發展和國內外交流合作的增加，實驗動物在諸多領域中的作用日益重要，因此，適應全球經濟一體化，研究國外標準，以我國實驗動物寄生蟲監測調研基礎數據作為科學依據，修訂完善國家標準顯得非常必要，這需要我們今后繼續開展更多確定的研究予以支持。

綜上所述，直接鏡檢實時動態顯微視屏攝錄技術和形態學鑒定聯合多重PCR及測序技術可有效應用于鼠管狀線蟲感染的快速檢定和感染監測中。本研究首次對中國SPF和清潔動物的鼠管狀線蟲進行了分子鑒定和感染調查，整體而言調查的面還不夠寬廣，還需要擴大樣本的容量和豐度，以獲得更全面的監測數據。鼠管狀線蟲作為一種重要的人獸共患病病原，其對動物質量和人類健康造成的危害不容忽視，今后一定要加強人獸共患病的防控工作，聯合使用多種技術精準科學做好監測工作，切實保護人民生命健康，保障人民用藥安全。

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〔修回日期〕2016-02-19

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）06-0067-08

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.013

［基金項目］國家科技支撐計劃（No.2013BAK11B03）。

［作者簡介］高正琴，副研究員，研究方向：病原生物學和快檢新技術研究。

［通訊作者］岳秉飛，研究員，研究方向：實驗動物學。monkeys，3 batches of 25 mini-pigs，28 batches of 55 rabbits，13 batches of 248 hamsters，37 batches of 198 guinea pigs，93 batches of 459 rats，742 batches of 4179 mice，5 batches of 25 chickens and one batch of 5 ducks）and 145 batches of 1389 clean animals（including one batch of 3 rabbits，4 batches of 31 hamsters，16 batches of 157 guinea pigs，32 batches of 268 rats and 92 batches of 930 mice）came from 50 different manufactures in China.Direct microscopy real-time dynamic video recording techniques in combination with morphological identification method were applied to screen the SyPhacia muris infestation.A multiple polymerase chain reaction（multiple-PCR）testing of the isolate based on amplification of the conserved portions of the SyPhacia muris internal transcribed spacer（ITS），28S ribosomal RNA（28S rRNA），NADH dehydrogenase subunits 1（nad1）and cytochrome c oxidase subunit 1（cox1）genes，and the molecular sequencing of the multiple-PCR amplicons was used to confirm the SyPhacia muris infection.Results SyPhacia muris eggs，larvae and adults were detected by using direct microscopy real-time dynamic video recording technique.SyPhacia muris were detected based on the morphology and size of ovum，larvae，and female and male adult worms.Multiple-PCR and sequencing were performed to identify ITS，28S rRNA，nad1 and cox1 genes of DNA extracted from the single egg，larva and adult parasite SyPhacia muris.This approach allowed the specific identification with no amplicon being amplified from heterogeneous DNA samples，and sequencing confirmed the identity of the amplified sequences.Molecular characterization by multiple-PCR amplification and sequencing of the ITS，28S rRNA，nad1 and cox1 genes demonstrated the presence of SyPhacia muris.Multiple-PCR followed by sequencing confirmed 285 of 5199 SPF and 135 of 1389 clean animal samples classified as positive by using direct microscopy real-time dynamic video recording technique in the study as containing SyPhacia muris-sPecific DNA.Comparison of the partial sequences of the ITS，28S rRNA，nad1 and cox1 genes revealed 100%similarity amongst SyPhacia muris from different animals.The prevalence of SyPhacia muris infection in SPF and clean animals were 5.5% （285/5199）and 9.7% （135/1389），respectively.Conclusions Direct microscopy realtime dynamic video recording technique，multiple-PCR and sequencing can be used to rapidly detect and accurately identify SyPhacia muris.The zoonotic nature of SyPhacia muris can be regard as a public health alter，hence the good quality control of animal has an important role in protecting human health and safeguarding people safety.This is the first molecular identification and infection investigation of SyPhacia muris in SPF and clean animals in China.

Prevalence and molecular identification of Syphacia muris in laboratory animals in China

GAO Zheng-qin，LI Xiao-bo，FENG Yu-fang，WANG Ji，FU Rui，XING Jin，WANG Shu-jing，WEI Jie，WANG Hong，GONG Wei，LI Guan-min，HE Zheng-ming，YUE Bing-fei
（National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

【Abstract】Objective To acquire the prevalence and molecular identification data on SyPhacia muris and provide reference for the revision of national standard.Methods 923 batches of 5199 SPF animals（including one batch of 5

【Key words】laboratory animal，SyPhacia muris，Molecular identification，Infection investigation