HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物聯合苦杏仁苷體外對膀胱癌EJ細胞殺傷作用的研究

張　沖，劉麗春，郭利君，王　磊

（甘肅省人民醫院，甘肅 蘭州 730000）

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HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物聯合苦杏仁苷體外對膀胱癌EJ細胞殺傷作用的研究

張沖，劉麗春，郭利君*，王磊

（甘肅省人民醫院，甘肅 蘭州 730000）

摘要：目的 本實驗將鼠源性免疫球蛋白G1（以下簡稱HMFG1）與β-葡萄糖苷酶連接，研究HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物聯合苦杏仁苷在體外特異性殺傷人膀胱癌細胞（以下簡稱EJ細胞）的作用，探討HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物聯合苦杏仁苷用于膀胱癌治療的前景。方法 將不同濃度的苦杏仁苷加入HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物、HMFG1單抗、HMFG1單抗加β-葡萄糖苷酶中，作用于EJ細胞，采用四氮噻唑藍比色法（以下簡稱MTT法）與水溶性四唑鹽比色法（以下簡稱WST-8法）進行實驗。結果 在不同方法下，不同苦杏仁苷濃度的HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物對EJ細胞的殺傷活性吸光度值與其他組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；在不同方法下，各組對EJ細胞的抑制率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。偶聯物在250 mmol·l-1濃度下，MTT法IC50為2.12 mmol·l-1、WST-8法IC50為1.17 mmol·l-1。結論 本實驗證明HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物聯合苦杏仁苷具有明顯特異性殺傷EJ細胞的作用，HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物聯合苦杏仁苷可能成為治療膀胱癌的有效策略，可以進入動物實驗進行進一步驗證。

關鍵詞：HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物；苦杏仁苷；EJ細胞

苦杏仁苷（amygdalin）在自然界中主要存在于苦杏、苦扁桃、油桃、枇杷、蘋果、黑櫻桃等果仁和葉子當中，1920年美國首次將苦杏仁苷用于治療腫瘤?？嘈尤受债a生的氰化物雖然能殺傷腫瘤細胞，但缺乏特異性，對機體可造成嚴重的系統毒性［1］。為了發揮苦杏仁苷的抗腫瘤作用，本實驗將HMFG1（鼠源性免疫球蛋白G1）與β-葡萄糖苷酶連接，使酶與抗體偶聯為一體。采用MTT（四氮噻唑藍比色法）［2］與WST-8法（水溶性四唑鹽比色法）研究HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物兼有抗原MUC1結合活性及水解苦杏仁苷的β-葡萄糖苷酶活性，對EJ細胞（人膀胱癌細胞）有特異性殺傷作用，為治療膀胱癌、降低復發率、控制術后轉移提供進一步的實驗基礎，現介紹如下。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

EJ細胞購于中科院上海細胞庫；RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute）培養基（美國Gibco公司）；新生小牛血清（蘭州榮曄生物科技有限責任公司）；胰蛋白酶粉末（美國Gibco BRL公司）；MTT（美國Fluka公司）；HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物、CCK-8試劑盒（同仁化學研究所）；苦杏仁苷（美國波士頓生物技術公司）。儀器：CO2細胞培養箱（型號：shellab 2306）；酶標儀（ELX800型）；細胞培養瓶、96孔培養板（丹麥NuNc公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus產品）。

HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物的制備：本實驗選用異型雙功能交聯劑間-馬來酰亞胺基苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（MBS）。MBS具有兩個不同的選擇性反應基團，N-羥基琥珀酰亞胺酯可專一地與蛋白質分子中的氨基結合，馬來酰亞胺可與蛋白質中的巰基反應，再通過還原劑2-亞胺基四氫噻吩（2-IT）與單抗反應，在抗體中引入了巰基，使先與β-葡萄糖苷酶的氨基結合了的MBS只能同巰基化的抗體結合，避免了連接反應中抗體與抗體、酶與酶之間的自身聚合，提高了交聯反應的效率。

1.2方法

1.2.1MTT法 分為：（1）HMFG1單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物組；（2）HMFG1單抗加β-葡萄糖苷酶組；（3）HMFG1單抗組。準備苦杏仁苷溶液，濃度分別為1 mmol·l-1，5 mmol·l-1，10 mmol·l-1，15 mmol·l-1。將對數生長的EJ細胞接種于96孔板（1×105/孔），待細胞貼壁后［3-4］去除培養基，分別加入以上3組藥物，終濃度為250 mmol·l-1，不加藥組為陰性對照組，并以不加細胞只加培養基作為空白進行調零。繼續培養2小時，然后用無血清RPM-1640培養基洗3次，再在3組中加入4個濃度的苦杏仁苷，每個濃度設3個復孔，繼續培養24小時。然后加入MTT 20 μl/孔（濃度5 mg/ml），培養4小時，吸去上清液，加入DMSO 150 μl/孔，充分震蕩10分鐘，放入酶標儀，在490 nm下測定各孔吸光度值（A），取平均值，按公式計算細胞抑制率：細胞抑制率=（1-A實驗組/A對照組）×100%，求出細胞生長抑制50%時的苦杏仁苷濃度，即IC50值，并進行比較。

1.2.2WST-8法 分為：（1）HMFG1單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物組；（2）HMFG1單抗加β-葡萄糖苷酶組；（3）HMFG1單抗組。準備苦杏仁苷溶液，濃度分別為 1 mmol·l-1，5 mmol·l-1，10 mmol·l-1，15 mmol·l-1。將對數生長的EJ細胞接種于96孔板（1×105/孔），37℃，5%CO2培養箱培養12小時，待細胞貼壁后，分別加入以上3組藥物，終濃度為250 mmol·l-1，不加藥組作為陰性對照組，并以不加細胞只加培養基作為空白進行調零。繼續培養2小時，然后用無血清RPM-1640培養基洗3次，再在3組中加入4個濃度的苦杏仁苷溶液，每個濃度設3個復孔，繼續培養24小時。然后加入CCK-8 10 μl/孔，培養4小時，充分震蕩10分鐘，放入酶標儀，在450 nm波長下測定各孔吸光度值（A）。計算IC50值同上，之后進行比較。

1.3數據統計

數據采用SPSS15.0軟件統計［5］，組間比較采用方差分析，IC50的計算用Probit分析，兩方法比較采用非參數兩相關樣本Wlicoxon統計分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

由結果可以看出，采用不同方法，結果均顯示HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物組有較強的細胞抑制作用，對苦杏仁苷呈劑量依賴性。偶聯物組與其他各組間的吸光度值比較，有顯著性差異（P＜0.01）。在不同方法下，各組對EJ細胞的抑制率比較，無顯著性差異（P＞0.05）。經計算，藥物劑量曲線［6］顯示，MTT法IC50為2.12 mmol·l-1，WST-8法IC50為1.17 mmol·l-1，見表1～3。

3　討論

膀胱癌是國內男性泌尿生殖系統腫瘤中最常見的惡性腫瘤，據中國癌癥基金會腫瘤數據庫統計顯示，膀胱癌的發生約占所有惡性腫瘤的5%，并呈逐年上升趨勢。在膀胱癌中，90%以上為移行細胞癌，膀胱癌術后極易復發，復發率為80%，其中10%進展為較高分級。為治療以及降低術后復發率，通常采用膀胱灌注藥物局部化療，但用化療藥物進行膀胱灌注時也能被機體吸收，造成全身毒性反應，且治療效果并不理想。這就需要研制出一種新的、特異性高的藥物，能夠在早期識別并靶向殺傷膀胱腫瘤細胞，降低術后復發率，且對正常組織細胞無毒性作用或毒性作用很小，減輕患者痛苦，提高其生存質量［7］。

從天然產物中提取的苦杏仁苷本身毒性很低，但經β-葡萄糖苷酶水解后能產生氰化物，且有極強的細胞毒性。正常細胞中存在硫氰酸酶，可將一部分氰化物轉化為無毒的硫氰酸鹽，而腫瘤細胞無硫氰酸酶，所以對腫瘤細胞的作用更明顯［8］。HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物就是一種針對腫瘤細胞特異性高表達的MUC1黏蛋白，且符合（Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy，ADEPT）理念［9］的前體藥物。本實驗采用MTT法與WST-8法測定不同濃度的苦杏仁苷與偶聯物聯合共同作用于膀胱癌EJ細胞24小時后的抑制率，結果顯示，1 mmol·l-1、5 mmol·l-1、10 mmol·l-1、15 mmol·l-1的苦杏仁苷溶液與HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物聯合共同作用后，表現出明顯的抑制效應，與其他各組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），并且隨著苦杏仁苷濃度的加大而增加，呈現劑量依賴性。MTT法IC50為2.12 mmol·l-1、WST-8法IC50為1.17 mmol·l-1，從而證明HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物聯合苦杏仁苷具有特異性殺傷EJ細胞活性的作用，提示HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯物聯合苦杏仁苷可能是治療膀胱癌、進行早期干預、降低復發率、進行個體化治療、改善預后、控制術后轉移的有效策略，值得進一步研究。

表1　MTT法不同組EJ細胞特異性殺滅活性吸光度值（±s）

表1　MTT法不同組EJ細胞特異性殺滅活性吸光度值（±s）

注：*與其他組比較，P＜0.01

苦杏仁苷濃度1 mmol·l-15 mmol·l-110 mmol·l-115 mmol·l-1單抗加酶組0.639±0.006 0.618±0.005 0.420±0.008 0.340±0.009陰性對照組0.678±0.008 0.678±0.008 0.678±0.008 0.678±0.008偶聯物組0.620±0.007*0.604±0.006*0.429±0.009*0.268±0.008*單抗組0.658±0.007 0.621±0.008 0.601±0.009 0.467±0.006

表2　WST-8法不同組EJ細胞特異性殺滅活性吸光度值（±s）

表2　WST-8法不同組EJ細胞特異性殺滅活性吸光度值（±s）

注：*與其他組比較，P＜0.01

單抗加酶組0.629±0.008 0.607±0.005 0.413±0.010 0.328±0.009苦杏仁苷濃度1 mmol·l-15 mmol·l-110 mmol·l-115 mmol·l-1陰性對照組0.667±0.008 0.667±0.008 0.667±0.008 0.667±0.008偶聯物組0.610±0.009*0.594±0.007*0.418±0.006*0.264±0.005*單抗組0.647±0.008 0.611±0.007 0.591±0.006 0.466±0.006

表3　MTT法與WST-8法不同組對EJ細胞的抑制率比較（%）

參考文獻：

［1］沈映君.中藥藥理學［M］.2版.北京：人民衛生出版社，2011.

［2］方蓉，李芳秋，武建國，等.MTT比色法的條件探討［J］.臨床檢驗雜志，2003，21（1）：34-35.

［3］張卓然.實用細胞培養技術［M］.北京：人民衛生出版社，2001.

［4］葉蘭萍，徐華，茍海濤，等.重離子對人肝癌細胞凋亡及bcl-2/bax基因表達的研究［J］.蘭州大學學報：醫學版，2006，32（2）：1-3.

［5］胡志潔.SPSS 11.5軟件在正交試驗設計中的應用［J］.醫學信息，2007， 20（5）：737-740.

［6］劉桂芬.醫學統計學［M］.2版.北京：中國協和醫科大學出版社，2007.

［7］Kaufman D S，Shiply W U，Feldman A S.Bladder cancer［J］.Lancet，2009，373（9686）：239-249.

［8］許寧俠.苦杏仁苷的研究進展［J］.內蒙古中醫藥，2012（9）：66-67.

［9］Schellmann N，Deckert P M，Bachran D，et al.Targeted enzyme prodrug therapies［J］.Mini-Rev in Medic Chem，2010，10（10）：887-904.

（*通訊作者：郭利君）■

中圖分類號：G642.423

文獻標識碼：B

文章編號：1671-1246（2016）12-0146-02

基金項目：甘肅省科技廳自然基金項目（0710RJZA008）