張明昊,蔡曉鐘,羅 娟,薛 白,曾 娣,徐 超,仲煜杰,徐增偉,左國偉△
(1.重慶醫(yī)科大學(xué):1.實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心;2.公共衛(wèi)生與管理學(xué)院;3.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院/臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400016)
·技術(shù)與方法·
比較兩種方法對牛鮑氏計(jì)數(shù)板中細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的影響*
張明昊1,蔡曉鐘1,羅 娟1,薛 白2,曾 娣2,徐 超2,仲煜杰3,徐增偉2,左國偉3△
(1.重慶醫(yī)科大學(xué):1.實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心;2.公共衛(wèi)生與管理學(xué)院;3.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院/臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400016)
目的 比較牛鮑氏計(jì)數(shù)板的傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法和新計(jì)數(shù)方法對細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的影響。方法 用傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法和新計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)118份抗凝血標(biāo)本中的紅細(xì)胞,然后將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值對照。結(jié)果 在109份有效樣本中,有57份(52.29%)用新方法計(jì)數(shù)結(jié)果更準(zhǔn)確,40份(36.70%)用傳統(tǒng)方法計(jì)數(shù)結(jié)果更準(zhǔn)確,12份(11.01%)用兩種方法計(jì)數(shù)引出的誤差相同。新方法計(jì)數(shù)誤差的平均值為(0.071±0.005)×1012/L,明顯低于傳統(tǒng)方法計(jì)數(shù)誤差的平均值(0.079±0.006)×1012/L,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 采用新方法在減小牛鮑氏計(jì)數(shù)板對細(xì)胞計(jì)數(shù)的誤差方面可能有一定的作用。
計(jì)數(shù)方法;標(biāo)準(zhǔn)值;牛鮑氏計(jì)數(shù)板;壓線細(xì)胞;分布誤差
牛鮑氏計(jì)數(shù)板被廣泛地運(yùn)用于計(jì)數(shù)體液細(xì)胞和微生物,且其測定結(jié)果通常被視為“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而操作中,測試者會發(fā)現(xiàn)在某些計(jì)數(shù)方格的4條外邊線上各自分布的壓線細(xì)胞數(shù)目有差異,但傳統(tǒng)方法只要求對其按照“數(shù)上不數(shù)下,數(shù)左不數(shù)右”的原則來處理[1],這樣計(jì)數(shù)可能會由于較大分布誤差的存在而引起結(jié)果偏移。本研究將對比傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法和新計(jì)數(shù)方法 (對分布于4條外邊上的壓線細(xì)胞計(jì)數(shù)后,將計(jì)數(shù)值除以2)對牛鮑氏計(jì)數(shù)板中細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的差異,來揭示運(yùn)用新計(jì)數(shù)方法的意義。
1.1 一般資料 選用2015年6月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院健康體檢者的新鮮抗凝血標(biāo)本118份,全部入選標(biāo)本均征得體檢者的許可并簽署知情同意書。紅細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值為(4.61±0.50)×1012/L,最高6.05×1012/L,最低3.35×1012/L。
1.2 方法
1.2.1 儀器、耗材及試劑 每份全血樣本的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)值由Sysmex公司生產(chǎn)的KX-21全自動三分類血細(xì)胞分析儀和該公司原裝配套的Cellpack稀釋液和溶血劑進(jìn)行測定。采用上海求精生化試劑儀器有限公司生產(chǎn)的改良牛鮑氏計(jì)數(shù)板(內(nèi)置蓋玻片)和山東奧賽特醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的血紅蛋白吸管進(jìn)行紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的手工法操作,紅細(xì)胞稀釋液選用質(zhì)量體積比為3.13%的枸櫞酸鈉蒸餾水溶液。
1.2.2 檢測方法 實(shí)驗(yàn)全過程由3名經(jīng)驗(yàn)豐富的專職實(shí)驗(yàn)老師負(fù)責(zé),并嚴(yán)格參照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)[1]中手工法紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的操作流程來測定每一份樣本:先取規(guī)格為12×100的塑料試管1支,加入紅細(xì)胞稀釋液2 mL;拿1支血紅蛋白吸管吸取抗凝血標(biāo)本10 μL,用醫(yī)用脫脂棉球擦去管外余血后加至裝有紅細(xì)胞稀釋液的試管底部,再輕輕地吸上清液反復(fù)吹洗吸管3次,立即混勻;隨后用血紅蛋白吸管將紅細(xì)胞懸液充入計(jì)數(shù)池,并靜置3 min;高倍鏡下依次計(jì)數(shù)中央大方格內(nèi)4角和正中5個中方格內(nèi)的紅細(xì)胞,對每個中方格4條外邊線上分布的壓線細(xì)胞分別計(jì)數(shù),然后再按照傳統(tǒng)方法和新方法把結(jié)果換算成:紅細(xì)胞數(shù)/L=5個中方格內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)×5×10×201×106/L。當(dāng)兩種方法計(jì)數(shù)出的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值的誤差均小于5%時,該例樣本視作有效。再將兩種方法計(jì)算結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值的誤差均小于2%的樣本劃歸為“低誤差樣本組”,其余的有效樣本劃歸為“高誤差樣本組”。
1.2.3 質(zhì)控 為了減小KX-21血細(xì)胞分析儀的定標(biāo)誤差,測試中每間隔10份樣本就用Sysmex公司生產(chǎn)的原裝血液學(xué)質(zhì)控物對測量結(jié)果進(jìn)行監(jiān)控。參考的定標(biāo)點(diǎn)選用紅細(xì)胞值分別為5.49×1012/L和4.12×1012/L的兩個質(zhì)控品輪流監(jiān)測,結(jié)果12個監(jiān)控點(diǎn)的測試值依次為(5.50、4.12、5.51、4.11、5.48、4.12、5.50、4.10、5.49、4.13、5.51、4.11),其中的最大誤差小于0.50%,符合測試要求。蓋玻片的厚度用精密度為10 μL的游標(biāo)卡尺丈量,各測量點(diǎn)讀數(shù)無差異;血紅蛋白吸管容積的精密度用重鉻酸鉀比色法校準(zhǔn),組間的吸光度值無明顯差異,符合實(shí)驗(yàn)要求。為了避免紅細(xì)胞隨放置時間延長被逐步破壞,每一份樣本的儀器法定標(biāo)和手工法計(jì)數(shù)過程均控制在40 min內(nèi)完成。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩種計(jì)數(shù)方法對誤差大小的影響是否具有獨(dú)立性用χ2檢驗(yàn)分析,紅細(xì)胞計(jì)數(shù)誤差的組間差異采用配對樣本t檢驗(yàn)比較,其相關(guān)性用Pearson檢驗(yàn)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 基本情況 在118份樣本中,有9份因?yàn)檎`差偏大(當(dāng)任一種方法的計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值的誤差大于5%)而淘汰,109份標(biāo)本計(jì)數(shù)結(jié)果有效。其中兩種方法計(jì)數(shù)值均偏大46份,均偏小43份,一大一小20份。分布于左上邊和右下邊的壓線紅細(xì)胞平均值分別為(88.06±10.98)/份和(88.18±10.47)/份,P=0.873。用傳統(tǒng)方法和新方法計(jì)算出的全血紅細(xì)胞水平分別為(4.620±0.505)×1012/L和(4.621±0.495)×1012/L,然后再對比標(biāo)準(zhǔn)參考值的紅細(xì)胞水平(4.620±0.492)×1012/L,兩種方法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.969、0.915),表明兩種方法測得的數(shù)據(jù)具有可比性。
2.2 壓線紅細(xì)胞分布的特殊性 雖然壓線紅細(xì)胞在左上邊和右下邊分布數(shù)目的平均值相當(dāng),但在個例中,分布的均勻性仍不一致。典型標(biāo)本中央中方格壓線紅細(xì)胞分布,壓線細(xì)胞在左上線和右下線各分布12個、13個,見圖1;典型標(biāo)本右下角中方格壓線紅細(xì)胞分布,壓線細(xì)胞在左上線和右下線各分布13個、22個,見圖2。

圖1 典型標(biāo)本中央中方格壓線紅細(xì)胞分布
2.3 兩種方法下對紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果誤差頻數(shù)比較 與傳統(tǒng)方法相比,新計(jì)數(shù)方法在控制誤差方面,不具備明顯優(yōu)勢。兩種方法下對紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行誤差分析的頻數(shù)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。
2.4 兩種方法下紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值差異的平均值和配對樣本t檢驗(yàn)比較 在總有效樣本組和低誤差樣本組中,新方法計(jì)數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)值的誤差明顯小于傳統(tǒng)方法計(jì)數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)值的誤差,二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

圖2 典型標(biāo)本右下角中方格壓線紅細(xì)胞分布

組別n傳統(tǒng)方法新方法誤差相等χ2P總有效樣本組10940(36.70)57(52.29)12(11.01)1.3400.247低誤差樣本組5620(35.71)29(51.78)7(12.50)0.7090.400高誤差樣本組5320(37.74)28(52.83)5(9.43)0.5960.440

表2 兩種方法下對紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值差異的 平均值比較
2.5 兩種方法下紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值的Pearson相關(guān)性檢驗(yàn) 在3組樣本中,兩種方法的計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值都具有極高的正相關(guān)性(r>0.95,P<0.01)。3組新方法計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值的相關(guān)性均高于傳統(tǒng)方法計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值的相關(guān)性(表3),表明新方法計(jì)數(shù)的結(jié)果更具可靠性。

表3 各組樣本在兩種方法下紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與 標(biāo)準(zhǔn)值的相關(guān)性分析
隨著醫(yī)學(xué)科技水平的不斷提高,各類全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀相繼投入到臨床檢驗(yàn)的應(yīng)用中。以尿沉渣檢查為例,傳統(tǒng)的顯微鏡檢查已經(jīng)逐步被高效、快捷的尿沉渣分析儀取代[2]。然而,近年來已有較多來自臨床的報(bào)道證實(shí)尿沉渣分析儀對某些成分不能做出正確的判斷,以致醫(yī)師做出錯誤的結(jié)論[3]。運(yùn)用儀器對腦脊液成分分析也是如此。2009年張慶芳[4]報(bào)道,直接用Sysmex XS-500i對腦脊液細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果把很多有形成分直接視為白細(xì)胞,最終使有核細(xì)胞計(jì)數(shù)出現(xiàn)較大誤差。其原因是該儀器對非血體液樣本中的特殊成分識別能力不足[5]。臨床上,精準(zhǔn)的定量報(bào)告有助于動態(tài)觀察疾病的發(fā)展和治療[6]。目前,利用手工法在顯微鏡下對細(xì)胞和特殊成分來計(jì)數(shù)依然是最可靠的檢查手段,也是最重要的參考方法[7]。
牛鮑氏計(jì)數(shù)板是一種用玻璃制成的特殊測定工具,主要用于對體液細(xì)胞和微生物進(jìn)行計(jì)數(shù),需與顯微鏡配合使用,操作技術(shù)要求較高[8]。與各種全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀相比,牛鮑氏計(jì)數(shù)板的測量原理更為科學(xué),所以臨床上用其計(jì)數(shù)結(jié)果來為儀器的校準(zhǔn)提供參考依據(jù)。牛鮑氏計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)誤差主要來自于操作誤差和固有誤差:當(dāng)中由于取樣不合理、器材使用不當(dāng)、稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確、細(xì)胞識別錯誤等因素所形成的誤差屬于操作誤差;而由于計(jì)數(shù)板、蓋玻片、血紅蛋白吸管不夠精準(zhǔn)引起的誤差稱儀器誤差,由于細(xì)胞在計(jì)數(shù)板內(nèi)分布不均而帶來的誤差稱分布誤差,儀器誤差和分布誤差統(tǒng)稱為固有誤差[9]。操作誤差和儀器誤差一般可以由提高實(shí)驗(yàn)者的技術(shù)熟練程度和規(guī)范操作流程來避免,但細(xì)胞分布誤差卻難以消除[9]。2004年Douglas等[10-11]報(bào)道:由于受流體動力學(xué)的作用,較大分布誤差明顯存在于低深度的計(jì)數(shù)池中,而這種現(xiàn)象不存在于計(jì)數(shù)池深度為100 μL的計(jì)數(shù)池中;由于受毛細(xì)現(xiàn)象的牽制,低深度的計(jì)數(shù)池還可能會給出偏低的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果[12]。目前國際上通用計(jì)數(shù)池深度為100 μL的牛鮑氏計(jì)數(shù)板,壓線細(xì)胞的處理是計(jì)數(shù)過程中的重要環(huán)節(jié),傳統(tǒng)方法要求對其按照“數(shù)上不數(shù)下,數(shù)左不數(shù)右”的原則來計(jì)算,但實(shí)踐操作中,測試者會發(fā)現(xiàn)在許多計(jì)數(shù)方格的4條邊線上各自分布的壓線細(xì)胞數(shù)目有顯著差異,因此這樣計(jì)數(shù)可能會引入較大分布誤差。
本研究發(fā)現(xiàn)在總有效樣本中,新方法計(jì)數(shù)誤差的平均值明顯低于傳統(tǒng)方法計(jì)數(shù)誤差的平均值,且相似的情況也存在于低誤差樣本組中。另外,在3組樣本中,兩種方法的計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值都具有顯著且極高的正相關(guān)性;而且所有用新方法計(jì)數(shù)的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值的相關(guān)性均高于同組中用傳統(tǒng)方法計(jì)數(shù)的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值的相關(guān)性。以上數(shù)據(jù)均說明新方法計(jì)算出的結(jié)果更具可靠性。本研究還發(fā)現(xiàn),52.29%的樣本用新方法計(jì)數(shù)結(jié)果更準(zhǔn)確,36.70%的樣本用傳統(tǒng)方法計(jì)數(shù)結(jié)果更準(zhǔn)確,11.01%的樣本用兩種方法計(jì)數(shù)引出的誤差相同,但經(jīng)過χ2檢驗(yàn)后確認(rèn)該百分比的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.5)。
本研究選用自動化分析儀對全血樣本中紅細(xì)胞水平進(jìn)行定標(biāo)的操作在理論上存在一定爭議,畢竟儀器的計(jì)數(shù)結(jié)果不是“金標(biāo)準(zhǔn)”。采用這種定標(biāo)方法也源于本實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡奶厥庑允潜容^牛鮑氏計(jì)數(shù)板的兩種計(jì)數(shù)方法,故參考值需要通過非手工計(jì)數(shù)方法來獲取。本研究選用紅細(xì)胞作為計(jì)數(shù)對象是基于兩點(diǎn)考慮:(1)在血液成分中,紅細(xì)胞壽命較長;(2)自動化分析儀對紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性相對較高。盡管如此,紅細(xì)胞特殊的延展性決定了它的平均體積會隨著存放時間的延長而逐漸增大,細(xì)胞穩(wěn)定性隨之降低[13]。所以本實(shí)驗(yàn)中的測試者在較短時間內(nèi)完成了每份樣本的儀器法定標(biāo)和手工法計(jì)數(shù),還多次用原裝血液學(xué)質(zhì)控品來監(jiān)測儀器的計(jì)數(shù)過程,以確保其結(jié)果的可信度。
綜上所述,新方法的引入在減小牛鮑氏計(jì)數(shù)板對細(xì)胞計(jì)數(shù)的誤差方面可能有一定的作用。從計(jì)數(shù)池的顯微結(jié)構(gòu)上看,計(jì)數(shù)方格的4條外邊是劃分方格內(nèi)、外區(qū)域的界線,故分布于4邊上的壓線細(xì)胞約1/2的概率是屬于計(jì)數(shù)方格內(nèi)的細(xì)胞,所以采用新方法來計(jì)數(shù)在理論上也更具合理性。但從另一方面來看,對4條邊都進(jìn)行計(jì)數(shù)勢必會增加測試者的工作量,并相繼延長計(jì)數(shù)時間,且參照本研究的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),雖然用兩種方法計(jì)數(shù)出的結(jié)果對比標(biāo)準(zhǔn)值的偏差有顯著的不同,但是兩種方法計(jì)數(shù)出的結(jié)果值并無明顯差異。因而作為測試者,需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來靈活選擇計(jì)數(shù)方法,或者在時間相對充裕的條件下聯(lián)合運(yùn)用兩種方法來判斷細(xì)胞分布的均勻性。目前,國內(nèi)外鮮有針對壓線細(xì)胞的分布不均引起計(jì)數(shù)誤差的報(bào)道和研究,而本實(shí)驗(yàn)又受時間、條件等因素的限制難以對兩種計(jì)數(shù)方法的優(yōu)劣性作出全面的評價(jià),故闡明其中的奧秘仍有待時機(jī)。將來,還需要開展更多關(guān)于控制牛鮑氏計(jì)數(shù)板中細(xì)胞分布誤差的方法研究,并從實(shí)驗(yàn)對象和參考標(biāo)準(zhǔn)的選擇開始就周密布控、逐步斟酌,相信最終能探索出更有效、更快捷的控制分布誤差的計(jì)數(shù)方法。
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Comparison of influence of two methods on cell count results in Neubauer counting chamber*
ZhangMinghao1,CaiXiaozhong1,LuoJuan1,XueBai2,ZengDi2,XuChao2,ZhongYujie3,XuZengwei2,ZuoGuowei3△
(1.CenterforLabTeaching&Management,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2.CollegeofPublicHealthandManagement,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;3.KeyLaboratoryofMedicalDiagnostics,MinistryofEducation,CollegeofLaboratoryMedicine,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)
Objective To compare the influence of the classical counting method and the bran-new counting method in Neubauer counting chamber on cell count results.Methods 118 anti-coagulated blood samples were selected.The two methods mentioned above were applied respectively to count the number of red blood cells,and results were compared with the standard references.Results Among 109 effective samples,the results of 57 samples(52.29%) had more accuracy through using the new counting method,whereas the results of only 40 samples (36.70%) had more accuracy through using the conventional counting method,and the results of 12 samples (11.01%) had the same errors through using two methods.The average deviation caused by the new method was (0.071±0.005)×1012/L,which was significantly lower than (0.079±0.006)×1012/L (P<0.01) by the conventional method,the difference was statistically significant(P<0.01).Conclusion Adopting the new counting method could have certain effect in the aspect of lessening the error of cell counts in Neubauer counting chamber.
counting methods;standard value;Neubauer counting chamber;pressing-line cells;distribution error
10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.026
國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81102035);重慶醫(yī)科大學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)基金資助項(xiàng)目(2015-56)。 作者簡介:張明昊(1984-),實(shí)驗(yàn)師,留美醫(yī)學(xué)碩士,主要從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)研究。△
,Tel:(023)65715003;E-mail:707017380@qq.com。
R331
A
1671-8348(2016)05-0658-03
2015-07-31
2015-10-13)