SLE患者外周血濾泡輔助性T細(xì)胞的檢測(cè)及其臨床意義

趙 珊，俞 娟，張 虹

(云南省第一人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，云南昆明 650032)

論著·臨床研究

SLE患者外周血濾泡輔助性T細(xì)胞的檢測(cè)及其臨床意義

趙 珊，俞 娟，張 虹△

(云南省第一人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，云南昆明 650032)

目的 探討濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者外周血的比例及其臨床意義。方法 收集60例SLE患者(SLE組)及60例健康體檢者(對(duì)照組)外周血，采用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)CXCR5+ICOS+的CD4+T細(xì)胞(即Tfh細(xì)胞)的比例，并分析Tfh細(xì)胞比例與患者疾病活動(dòng)度及自身抗體的相關(guān)性。結(jié)果 SLE組患者外周血Tfh細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(t=5.830，P<0.01)，且SLE活動(dòng)組明顯高于SLE穩(wěn)定組(t=7.313，P<0.01)，但狼瘡腎炎組患者Tfh比例與無(wú)腎炎狼瘡組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.986，P=0.328)。SLE患者外周血Tfh細(xì)胞比例與疾病活動(dòng)度、血清總IgG、抗核抗體滴度及抗ds-DNA均呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 SLE患者外周血Tfh細(xì)胞的比例升高可能與患者疾病的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。

紅斑狼瘡，系統(tǒng)性；濾泡輔助性T細(xì)胞；自身抗體

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythmatosus，SLE)是一種累及多個(gè)器官的慢性系統(tǒng)性自身免疫病，其發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜。B細(xì)胞的異常活化及大量自身抗體的產(chǎn)生是其一個(gè)重要的病理特征[1]，但B細(xì)胞的活化、分化及抗體的產(chǎn)生都離不開CD4+T細(xì)胞的輔助。濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cells，Tfh)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一群細(xì)胞，高表達(dá)趨化因子CXCR5，定位于淋巴器官的淋巴濾泡，是真正輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的CD4+T細(xì)胞[2-3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證明Tfh細(xì)胞的數(shù)量和功能異常增強(qiáng)能導(dǎo)致小鼠淋巴生發(fā)中心增多，自身抗體水平增加，并表現(xiàn)為系統(tǒng)性自身免疫病的癥狀[4]。本文通過(guò)檢測(cè)SLE患者外周血中Tfh細(xì)胞的比例，并分析其與疾病活動(dòng)度及自身抗體水平的相關(guān)性，探索Tfh細(xì)胞在人SLE疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年6月至2014年8月來(lái)本院風(fēng)濕科就診的SLE患者60例(SLE組)，其中男5例，女55例；年齡21～58歲，平均(37.62±9.81)歲。SLE的診斷均按照1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。采用SLE疾病活動(dòng)度(SLE disease activity index，SLEDAI)對(duì)SLE患者進(jìn)行評(píng)分，SLEDAI≥8分為SLE活動(dòng)組，SLEDAI<8分為SLE穩(wěn)定組[6]；另外，根據(jù)患者是否合并腎炎將SLE患者分為狼瘡腎炎組(平均SLEDAI為8.43分)和無(wú)腎炎狼瘡組(平均SLEDAI為8.25分)。選擇同時(shí)期來(lái)本院進(jìn)行健康體檢者60例(對(duì)照組)，男7例，女53例；年齡20～61歲，平均(38.43±9.76)歲，排除各種自身免疫病及肝腎功能不全等疾病。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tfh細(xì)胞 無(wú)菌采取抗凝外周血5 mL，加5 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)混勻后，輕輕疊加至10 mL 淋巴細(xì)胞分離液Ficoll(Sigma公司)上，2 000 r/min離心20 min后吸取中間白色單個(gè)核細(xì)胞層；以PBS洗滌2次后加入抗體組合CD3-Percp，CD4-APC，CXCR5-FITC，ICOS-PE各1 μL，室溫孵育30 min；加PBS洗滌2遍，重懸于200 μL PBS中上機(jī)檢測(cè)。將CXCR5+ICOS+的CD4+T細(xì)胞定義為Tfh細(xì)胞[7]。

1.2.2 血清自身抗體檢測(cè) 血清總IgG及抗核抗體(anti-nuclear antibody，ANA)的測(cè)定采用間接免疫熒光法，試劑盒購(gòu)自Bio-Rad公司；血清抗ds-DNA抗體測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，試劑盒購(gòu)自Seraamun Diadnostic GmbH診斷公司。操作均嚴(yán)格按照試劑盒的要求進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 兩組對(duì)象外周血Tfh細(xì)胞百分比比較 對(duì)照組外周血Tfh細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞所占的比例為(1.28±0.94)%，SLE組患者外周血Tfh細(xì)胞的比例為(2.57±1.44)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.830，P<0.01)，見圖1。

2.2 SLE組患者各亞組間Tfh細(xì)胞百分比比較 SLE活動(dòng)組外周血Tfh細(xì)胞為(3.43±1.05)%，顯著高于SLE穩(wěn)定組(1.55±0.86)%及對(duì)照組(1.28±0.94)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，SLE穩(wěn)定組Tfh細(xì)胞比例略高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.493，P=0.139)；狼瘡腎炎組患者外周血Tfh細(xì)胞為(2.74±1.19)%略高于無(wú)腎炎狼瘡組(2.45±1.10)%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.986，P=0.328)。

2.3 SLE患者Tfh細(xì)胞百分比與SLEDAI及自身抗體的相關(guān)性 Tfh細(xì)胞的比例與SLEDAI呈正相關(guān)(r=0.533,P=0.000)；Tfh細(xì)胞的比例與血清總IgG及抗ds-DNA呈正相關(guān)(均P<0.01)，與ANA的滴度也有微弱相關(guān)性(r=0.340,P=0.032)，見圖2。

a:P<0.01，與對(duì)照組比較。

圖1 兩組對(duì)象外周血Tfh細(xì)胞百分比比較

圖2 SLE患者外周血Tfh細(xì)胞百分比與SLEDAI及自身抗體的相關(guān)性分析

3 討 論

Tfh是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類區(qū)別于Th1、Th2、Th17、Treg的新型CD4+T細(xì)胞亞群。Tfh細(xì)胞定位于淋巴器官的濾泡區(qū)，表面高表達(dá)趨化因子受體CXCR5及共刺激分子ICOS[7]；Bcl-6是Tfh細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，控制CD4+T細(xì)胞朝Tfh細(xì)胞定向分化[8]；IL-21是Tfh細(xì)胞重要功能性細(xì)胞因子，可促進(jìn)B細(xì)胞的增殖、分化及漿細(xì)胞的發(fā)育、成熟和抗體的分泌[9]。Tfh細(xì)胞在生發(fā)中心的形成過(guò)程中扮演重要角色，Tfh細(xì)胞敲除的小鼠生發(fā)中心形成缺陷，B細(xì)胞發(fā)育障礙，抗體產(chǎn)生降低[10]。相反，一些自身免疫疾病小鼠Tfh細(xì)胞水平升高，造成生發(fā)中心過(guò)度增生，甚至出現(xiàn)異位生發(fā)中心的形成[11]，并誘導(dǎo)B細(xì)胞的過(guò)度活化及自身抗體的過(guò)度分泌[12-13]。上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Tfh細(xì)胞與自身免疫病及自身抗體的密切關(guān)系，本研究在此基礎(chǔ)上探討Tfh細(xì)胞在人SLE疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用，為SLE的病理機(jī)制研究及免疫干預(yù)策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞表面CXCR5及ICOS的表達(dá)情況，將CXCR5+ICOS+的CD4+T細(xì)胞定義為Tfh細(xì)胞，本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血的Tfh細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例明顯高于對(duì)照組。該結(jié)果與已有的文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，說(shuō)明SLE患者存在Tfh細(xì)胞的過(guò)度增殖。另外通過(guò)比較活動(dòng)期和穩(wěn)定期SLE患者的Tfh差異，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期SLE患者的Tfh細(xì)胞比例明顯高于穩(wěn)定期患者，說(shuō)明Tfh細(xì)胞在SLE患者疾病活動(dòng)過(guò)程中扮演角色，可能參與介導(dǎo)SLE疾病的發(fā)病。但是根據(jù)患者是否合并腎炎將SLE患者分為狼瘡腎炎組和無(wú)腎炎狼瘡組，兩組患者的Tfh細(xì)胞比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.986，P=0.328)，考慮到兩組患者SLEDAI評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(8.43vs.8.25，P>0.05)，說(shuō)明Tfh細(xì)胞與SLE患者的合并癥無(wú)關(guān)，僅反映疾病的活動(dòng)狀態(tài)。

大量自身抗體的產(chǎn)生是SLE疾病的重要發(fā)病機(jī)制之一，鑒于Tfh細(xì)胞在輔助B細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中的重要作用[15]，推測(cè)Tfh細(xì)胞可能通過(guò)介導(dǎo)B細(xì)胞的過(guò)度活化及自身抗體的大量產(chǎn)生參與SLE的發(fā)病機(jī)制。分析Tfh細(xì)胞比例與SLE疾病活動(dòng)度的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)Tfh細(xì)胞比例與SLE疾病活動(dòng)度成顯著正相關(guān)，說(shuō)明Tfh細(xì)胞是SLE疾病出現(xiàn)活動(dòng)性的重要因素之一。另外，分析Tfh細(xì)胞比例與血清總抗體水平及自身抗體ANA滴度及抗ds-DNA水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Tfh細(xì)胞與這些抗體水平均呈正相關(guān)，說(shuō)明Tfh細(xì)胞是誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生及總抗體水平升高的重要機(jī)制之一。

總之，本文通過(guò)檢測(cè)SLE患者外周血的Tfh細(xì)胞比例，并分析其與疾病活動(dòng)度及自身抗體水平的相關(guān)性，揭示Tfh細(xì)胞通過(guò)介導(dǎo)自身抗體的過(guò)量產(chǎn)生誘發(fā)SLE疾病活動(dòng)度升高，為針對(duì)Tfh細(xì)胞的免疫治療提供理論依據(jù)。

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Detection and clinical significance of peripheral blood follicular helper T cells in SLE patients

ZhaoShan,YuJuan,ZhangHong△

(DepartmentofRheumatology,theFirstPeople′sHospitalofYunnanProvince,Kunming,Yunnan650032,China)

Objective To investigate the percentage of peripheral blood follicular helper T (Tfh) cells and its clinical significance in the patients with systemic lupus erythmatosus (SLE).Methods 60 patients with SLE(SLE group) and 60 individuals undergoing the healthy physical examination (control group) were collected and detected the percentage of CXCR5+ICOS+CD4+T cells by using the flow cytometry.The correlation between Tfh cells with the disease activity of SLE and auto-antibodies was also analyzed.Results The percentage of peripheral blood Tfh cells in SLE patients was significantly higher than that in the control group (t=5.830,P<0.01),moreover the active SLE group was significantly higher than the stable SLE group (t=7.313,P<0.01);but the percentage of Tfh cells had no statistical difference between the lupus nephritis group and the non-lupus nephritis group (t=0.986，P=0.328).The percentage of peripheral blood Tfh cells had significantly positive correlation with the disease activity index (DAI) of SLE,serum total IgG,anti-nuclear antibody (ANA) titer and anti-ds-DNA.Conclusion Increase of peripheral blood Tfh cells percentage in the SLE patients might contribute to the occurrence and development of SLE.

lupus erythmatosus,systemic;follicular helper T cells;autoantibodies

趙珊(1972-)，副主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事結(jié)締組織病合并肺間質(zhì)纖維化、肺動(dòng)脈高壓、感染、冠心病的臨床診治研究。△

，Tel：13577008899；E-mail：0428zhanghong@sina.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.019

R392.7

A

1671-8348(2016)05-0636-03

2015-07-24

2015-10-22)