STAT3在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用

許先成,柯昌斌,吳艷瓊,孫艷玲,王賢裕

(湖北醫藥學院附屬太和醫院麻醉科，湖北十堰 442000)

論著·基礎研究

STAT3在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用

許先成,柯昌斌△,吳艷瓊,孫艷玲,王賢裕

(湖北醫藥學院附屬太和醫院麻醉科，湖北十堰 442000)

目的 探討轉錄活化因子3 (STAT3)在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用。方法 將健康成年雄性SD大鼠18只分為3組(n=6)：假手術組(S組)，只分離左冠狀動脈，不結扎；缺血/再灌注組(I/R組)，結扎左冠狀動脈前降支30 min，再灌注120 min；缺血/再灌注+STAT3抑制劑Stattic組(ST組)，于再灌注前10 min經尾靜脈注射STAT3特異性抑制劑Stattic 500 μg/kg。再灌注結束時，取缺血區心肌標本，采用紅四唑(TTC)染色檢測心肌梗死面積；采用原位末端缺口標記法(TUNEL法)檢測細胞凋亡指數；采用Western-blot檢測磷酸化STAT3(p-STAT3)、Fas蛋白表達；采用RT-PCR檢測p-STAT3、Fas的mRNA表達；采用免疫組織化學法檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表達。結果 與S組相比，I/R組心肌梗死面積、心肌細胞凋亡指數、p-STAT3和Fas的蛋白及其mRNA表達、Caspase-3表達水平均增高(P<0.05)；與I/R組比較，ST組心肌梗死面積、心肌細胞凋亡指數升高(P<0.05)，p-STAT3蛋白及mRNA表達水平下調，Fas蛋白及mRNA表達、Caspase-3表達水平增加(P<0.05)。結論 STAT3可能通過調控Fas系統，從而有效的抑制Caspase-3凋亡系統對心肌細胞及其其他組織的損傷。

心肌缺血；再灌注損傷；轉錄活化因子3； Fas；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemic reperfusion injury，MIRI)是心臟外科手術及心血管介入治療中較棘手的問題，如何及時有效的減少MIRI已成為當代醫學亟需解決的難點之一。凋亡被認為是MIRI導致心肌細胞死亡和細胞功能發生不可逆性喪失的主要機制之一[1]，常受到細胞內外多種信號因子及傳導系統的調控。研究證實，轉錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)過表達后可減少缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡，顯著增強心肌細胞抗凋亡能力[2-4]，但其確切機制有待探討。本研究擬評價STAT3在MIRI中的作用，從而為臨床治療心肌缺血性疾病提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇健康成年雄性SD大鼠18只，體質量200～250 g，由湖北醫藥學院動物研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 采用隨機數字表法，將18只SD大鼠隨機分為3組(n=6) ：假手術組(S組)，只分離左冠狀動脈，不結扎；缺血/再灌注組(I/R組)，結扎左冠狀動脈前降支30 min，再灌注120 min；缺血/再灌注+STAT3抑制劑Stattic組(ST組)，于再灌注前10 min經尾靜脈注射STAT3特異性抑制劑Stattic。

1.2.2 大鼠MIRI模型的建立 參照文獻[5]建立大鼠MIRI模型，各組大鼠均于麻醉后，切開氣管行氣管插管連接小動物呼吸機及小動物心電圖監護儀。心前區備皮消毒，左側第四肋間開胸，剪開心包膜，充分暴露心臟，于左心耳與肺動脈圓錐之間找到與左冠狀動脈伴行的冠狀靜脈，在左心耳下方2 mm處，結扎左冠狀動脈前降支，心電圖Ⅱ導聯出現ST段弓背抬高為結扎成功，30 min后剪斷縫線，ST段回落為再通。實驗過程加用保溫毯保暖，保持大鼠直腸溫度在36.5～37.5 ℃。

1.2.3 梗死面積檢測 于再灌注結束后重新阻斷血管，靜脈注射2%伊文思蘭1 mL，迅速取出心臟，置于-20 ℃冰箱冰凍30 min后，將冰凍心臟從心尖至心底橫向切成約2.0 mm的切片，將所有切片置于1%紅四唑(TTC)磷酸緩沖液(pH7.4)中37 ℃水浴15 min，藍染區域為非缺血區，非藍染區域為缺血危險區；梗死心肌呈灰白色，非梗死心肌呈磚紅色。以梗死面積占缺血危險區面積的百分比反映心肌梗死程度。運用IPP2.5全自動圖像分析軟件進行面積計算處理。

1.2.4 細胞凋亡指數檢測 再灌注120 min后，取左室心尖部全層心肌標本，將標本置入4%中性多聚甲醛溶液中固定后常規石蠟包埋切片，用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT 酶)介導的帶熒光的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)測定心肌細胞凋亡指數。每張切片隨機取6個高倍鏡視野，檢測每個高倍鏡視野下調亡細胞數和總細胞數，凋亡指數=凋亡細胞數/總觀察細胞數×100%，凋亡細胞胞核呈棕黃色或棕褐色顆粒，正常細胞核為藍色。

1.2.5 Western-blot檢測p-STAT3、Fas蛋白表達 取保存在液氮中的心肌組織勻漿，RIPA蛋白裂解液提取蛋白，用紫外分光光度計檢測提取蛋白水平。采用10%SDS-PAGE進行電泳，轉至PVDF膜上。加入兔抗大鼠p-STAT3和Fas抗體(稀釋度1∶1 000，Santa Cruz公司，美國)，加入HRP標記的山羊抗兔二抗(稀釋度1∶3 000，Santa Cruz公司，美國)。ECL試劑顯色，暗室X光膠片曝光，掃描底片，Gelpro條帶分析軟件進行曝光條帶光密度值分析，以目的蛋白條帶與內參β-actin條帶光密度值的比值反映目的蛋白p-STAT3和Fas的表達。

1.2.6 RT-PCR檢測p-STAT3、Fas mRNA表達 取左室心肌組織，保存于液氮中備用。用Trizol一步法提取總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA及純度后水平，配制20 μL逆轉錄體系合成cDNA，逆轉錄產物作為下一步PCR模板，采用Primer Premier5軟件設計引物。STAT3上游引物：5′-CGC CAC TCT GGT GTl TrC ATA-3′，下游引物：5′-TTC GCA GGT TGT GCT GAT AG-3′；Fas上游引物：5′-TCT AGT TGG AAA GAA CCG AAG G-3′，下游引物 5′-CCA CAA ACG AGA TGC AAT CAC-3′；β-actin上游引物：5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′，下游引物：5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′。采用25 μL體系行PCR，反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環，并在每個循環延伸末端收集信號，繪制擴增曲線，采用2-△△CT法計算目的基因表達。

1.2.7 免疫組化檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表達 石蠟包埋標本制成5 μm厚的連續組織切片，脫蠟水化，高壓抗原修復，過氧化物酶封閉，室溫冷卻后，滴加一抗Caspase-3兔抗多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)孵育，滴加二抗二步法免疫組化試劑P6001(北京中杉金橋生物公司)，DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明，封片。光鏡下進行觀察Caspase-3，以細胞核染成棕黃色或黃褐色為陽性細胞。每張切片隨機取5個高倍視野，采用Image-Pro Plus 6．0圖像分析系統(Media Cybernetics公司，美國)計算光密度值，取其平均值反映Caspase-3的表達。

2 結 果

2.1 3組大鼠心肌梗死面積及心肌細胞凋亡指數比較 與S組比較，I/R組心肌梗死面積、心肌細胞凋亡指數增加(P<0.05)；與I/R組比較，ST組心肌梗死面積、心肌細胞凋亡指數亦顯著增加(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 3組大鼠心肌梗死面積及心肌細胞凋亡指數 比較

a：P<0.05，與S組比較；b：P<0.05，與I/R組比較。

A：S組，未見明顯凋亡細胞核；B：I/R組，可見明顯棕黃色凋亡細胞核；C：ST組，可見大量棕黃色凋亡細胞核。

圖1 TUNEL法檢測3組大鼠心肌細胞凋亡結果(×100)表2 各組大鼠心肌細胞p-STAT3、Fas蛋白和mRNA表達比較

a：P<0.05，與S組比較；b：P<0.05，與I/R組比較。

2.2 3組大鼠p-STAT3、Fas蛋白和mRNA、Caspase-3表達水平比較 與S組比較，I/R組p-STAT3、Fas蛋白和mRNA、Caspase-3表達水平均增高(P<0.05)；與I/R組比較，ST組p-STAT3蛋白及mRNA表達水平顯著下調，Fas蛋白及mRNA表達、Caspase-3表達水平增加(P<0.05)。各組大鼠心肌細胞p-STAT3、Fas蛋白和mRNA表達比較，見表2、圖2。S、I/R、ST組大鼠Caspase-3表達分別為0.18±0.05、0.68±0.21、1.02±0.30；與S組比較，I/R組、ST組Caspase-3表達增高(P<0.05)，見圖3。

圖2 各組大鼠心肌組織p-STAT3蛋白表達比較

A：S組，未見陽性表達細胞；B：I/R組，可見明顯棕黃色細胞；C：ST組，可見大量棕黃色。

圖3 免疫組化檢測Caspase-3蛋白表達(×200)

3 討 論

STAT3是Stats家族的重要成員，廣泛參與細胞的增殖分化、細胞凋亡、以及免疫調節等多種病理生理過程[6]。Liu等[7]在研究小鼠腦缺血再灌注損傷保護機制發現，STAT3信號傳導通路的激活能夠降低 Bax/Bcl-2 的比值，減少腦梗死后凋亡細胞數量，減小腦梗死體積，發揮腦保護作用[8]。有研究表明，特異性激活心肌STAT3基因的轉基因小鼠能夠耐受阿霉素引起的心肌細胞損傷[9]，說明STAT3介導并觸發了心肌內源性細胞保護作用，但確切機制尚不清楚。Sattic是一種卟啉類非肽小分子，能抑制STAT3的核轉運，是STAT3的特異性抑制劑[10]。在本研究中，ST組于心肌再灌注早期給予STAT3抑制劑干預，p-STAT3蛋白及mRNA表達明顯下調，心肌梗死面積和心肌細胞凋亡指數顯著增加，明確了STAT3能夠在MIRI中發揮保護作用。

Caspase-3被認為是Caspase家族中重要的凋亡執行者之一，它在各種生理和病理因素刺激下被激活，通過裂解核酸酶、蛋白激酶等作用底物，引起細胞特征性的凋亡形態學上的改變[11]， 如細胞核濃縮、脫氧核糖核酸鏈斷裂等，從而發揮促凋亡作用，加重組織或器官的功能損害。本研究表明，與S組比較，I/R組出現Caspase-3高表達，證實了Caspase-3參與了大鼠MIRI。

Caspase-3是Fas介導的凋亡信號途徑下游的關鍵性效應蛋白酶，Fas在細胞表面的高表達只能說明細胞對凋亡的敏感性增強，而決定細胞是否產生凋亡，關鍵在于細胞質中被活化的Caspase-3水平[12]。當 FasL與Fas以三聚體的形式結合，激活凋亡基因產物Caspase-3蛋白[13]，可以誘導表達Fas的細胞凋亡，Caspase-3被認為是介導凋亡最終步驟的實施者[14]。有研究報道，STAT3實際上是作為一種抗凋亡轉錄因子來抑制Caspase-3表達[15-16]，因此，為進一步闡明STAT3信號通路與心肌細胞凋亡之間的相互關系，于心肌再灌注早期給予STAT3抑制劑處理可以顯著抑制p-STAT3蛋白及mRNA的表達，同時呈現Fas蛋白及mRNA、Caspase-3的表達增高，說明STAT3心肌保護機制之一是通過調控Fas死亡信號及Caspase-3凋亡通路實現的。

綜上所述，本實驗通過建立大鼠MIRI模型，證實了STAT3在MIRI中的作用，其可能機制是通過作用于Fas系統，從而有效的抑制Caspase-3凋亡系統對心肌細胞及其他組織的損傷。

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Role of signal transducer and activator of transcription 3 in rat myocardial ischemia-reperfusion injury

XuXiancheng,KeChangbin△,WuYanqiong,SunYanling,WangXianyu

(DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedTaiheHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan,Hubei442000,China)

Objective To investigate the role of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT 3) in rat myocardial ischemia-reperfusion(I/R) injury.Methods 18 healthy adult male SD rats were randomly divided into three groups (n=6).The sham operation group(group S) was only performed the left coronary artery separation without ligation; the I/R group was performed the left anterior descending coronary artery ligation for 30 min,then the 120 min reperfusion; the I/R+ STAT3 inhibitor Stattic group(group ST),on the basis of the group I/R,Stattic 500 μg/kg was injected at 10 min by the tail vein before reperfusion.The myocardial specimens at the ischemic area were taken at the end of reperfusion，the TTC staining was adopted to determine the myocardial infarct size,and the myocardial cell apoptosis index(AI) was detected by TUNEL.The expression of phosphorylated-STAT3 (p-STAT3) and Fas protein were detected by Western-blot.RT-PCR was used to determine mRNA level of p-STAT3 and Fas protein,and the immunohistochemical method to detect the Caspase-3 expression.Results Compared with the group S,the myocardial infarct size,AI and the expressions of p-STAT3,Fas and Caspase-3 in the group I/R were significantly increased (P<0.05);compared with the group I/R,the myocardial infarct size,AI,the expression of p-STAT3 protein and mRNA in the group ST were significantly down-regulated,while Fas protein and mRNA expression,Caspase-3 expression level were increased (P<0.05).Conclusion STAT3 effectively suppresses the injury of Caspase-3 apoptosis system to myocardial cells and other tissues through exerting the action on Fas system.

myocardial ischemia;reperfusion injury;signal transducer and activator of transcription3;Fas;Caspase-3

許先成(1963-)，主任醫師，大學本科，主要從事圍術期器官保護的臨床研究。△

，Tel:(0719)8801437；E-mail:kcbzzzz@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.009

R542.2

A

1671-8348(2016)05-0606-04

2015-09-01

2015-10-28)