二甲雙胍抑制骨肉瘤MG63細胞的遷移和侵襲能力*

蘇小桃，何 俊，歐 軍，申瑩瑩

(南華大學:1.附屬南華醫院脊柱外科；2.附屬第一醫院臨床醫學研究所，湖南衡陽 421001)

論著·基礎研究

二甲雙胍抑制骨肉瘤MG63細胞的遷移和侵襲能力*

蘇小桃1，何 俊1，歐 軍1，申瑩瑩2△

(南華大學:1.附屬南華醫院脊柱外科；2.附屬第一醫院臨床醫學研究所，湖南衡陽 421001)

目的 觀察二甲雙胍對骨肉瘤MG63細胞的遷移侵襲能力的影響。方法 以骨肉瘤MG63細胞株為研究對象，二甲雙胍處理后分別采用transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲能力的變化，采用明膠酶譜實驗檢測基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9的活性，采用real-time PCR法檢測細胞中埃茲蛋白(Ezrin) mRNA的表達，采用Western blot檢測Ezrin蛋白的表達；Lipofectamine 2000轉染Ezrin質粒到細胞中觀察其對二甲雙胍誘導的細胞遷移侵襲抑制及對下游信號通路的影響。結果 二甲雙胍可顯著抑制MG63細胞的遷移和侵襲，并降低MMP-2和MMP-9的酶活性。用藥48 h后，MG63細胞內Ezrin的mRNA和蛋白水平均明顯下降，且上調Ezrin可減弱二甲雙胍誘導的骨肉瘤細胞遷移和侵襲抑制及二甲雙胍誘導的MAPK/Erk信號通路抑制。結論 二甲雙胍可抑制MG63細胞的遷移和侵襲能力，可能是通過下調Ezrin和MAPK/Erk信號通路而實現。

二甲雙胍；骨肉瘤；細胞運動；腫瘤浸潤；埃茲蛋白；MAKP/Erk信號通路

骨肉瘤是最常見的原發性骨腫瘤，其特征是具有高度惡性的傾向，能迅速破壞周圍的組織，并發生轉移[1]。當骨肉瘤復發或發生轉移時預后極差[2]。盡管目前療效確切的臨床化療藥物不斷涌現，如大劑量甲氨蝶呤、多柔比星、順鉑和異環磷酰胺等，但化療藥物較大的毒副作用及逐漸出現的耐藥性成為制約其發展的主要問題，而應用血管內皮抑素、端粒酶靶向治療等較新的方法治療骨肉瘤的臨床研究目前尚處于起步階段，其有效性和安全性尚需大量臨床資料證實[3-4]。因此，亟待尋找一種安全、有效的藥物來延緩骨肉瘤進展，提高骨肉瘤患者生存率。二甲雙胍作為一種臨床上使用多年的常見降糖藥，其安全性已經得到了充分驗證。近來，相關研究表明二甲雙胍在一定程度上具有抗腫瘤作用[5-7]，基于此，本實驗擬研究二甲雙胍對骨肉瘤MG63細胞遷移和侵襲的影響并探討其作用機制以期明確其在骨肉瘤治療的可能性。埃茲蛋白(Ezrin)是ERM家族中重要的成員，它最初是在研究雞小腸黏膜細胞刷狀緣微絨毛的細胞骨架的主要成分時被首次發現。Ezrin 作為外層細胞骨架為真核細胞質膜結構提供支持作用。Ezrin是一個相對分子質量為82×103的磷酸化蛋白質，由villin-2基因編碼表達。研究顯示，Ezrin在多種腫瘤的轉移中發揮著重要的作用[8-11]。Ezrin作為一個同時與間葉和上皮來源的多種惡性腫瘤轉移高度相關的蛋白，正越來越引起人們的重視。目前的研究表明二甲雙胍可通過不同的機制抑制多種不同的腫瘤，如二甲雙胍可通過靶向Stat3抑制三陰性乳腺癌細胞的生長并誘導細胞的凋亡，還可通過下調miRNAs減弱胰腺癌干細胞的功能從而抑制胰腺癌細胞的增殖和侵襲轉移能力[5-6]。為明確二甲雙胍抑制骨肉瘤細胞遷移和侵襲能力的分子機制，本研究觀察Ezrin在二甲雙胍處理前后的變化，并探討其是否為二甲雙胍的關鍵靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細胞株MG63購于中國科學院上海細胞庫。RPMI1640培養液、胎牛血清購于美國Gibco公司，二甲雙胍購于Sigma-Aldrich公司，Ezrin抗體和actin抗體購于abcam公司，Akt抗體，p-Akt(Ser473)抗體，Erk1/2抗體，p-Erk1/2(Thr202/Tyr204)抗體，辣根過氧化物酶標記的二抗購于Cell signaling公司，Ezrin質粒購于Origene公司，Lipofectamine 2000 購于invitrogen公司，transwell小室購于corning公司，基質膠購于BD公司，trizol購于invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購于Fermentas公司，q PCR試劑盒購于takara公司。BCA蛋白定量試劑盒，RIPA裂解液，PMSF，上樣緩沖液均購于碧云天公司。明膠酶譜試劑盒購于GENMED公司。蛋白Marker購于Bio-Rad公司，PVDF膜購于Millipore公司，ECL發光液購于Pierce Biotechnology公司，膠片購于Kodak公司。青霉素、硫酸鏈霉素購于北京鼎國生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 MG63細胞接種于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養液中，置于37 ℃，5%CO2及飽和濕度條件的培養箱中培養。

1.2.2 實驗分組 于6孔細胞培養板每孔接種2×105個MG63細胞，單層培養至細胞覆蓋率為80%左右。細胞分為實驗組和對照組。對照組：不加藥；實驗組：加入二甲雙胍，使其終濃度為10 mmol/L，培養48 h后收集細胞進行后續實驗。濃度選取理由：查閱多篇文獻發現二甲雙胍抑制多種腫瘤侵襲遷移效果較明顯時濃度均為10～30 mmol/L，故采納了最低的整倍數濃度10 mmol/L[6,12-13]。

1.2.3 實時熒光定量PCR MG63細胞接種于6孔板，加入或不加入10 mmol/L二甲雙胍培養48 h后，收集細胞。Trizol試劑法提取總RNA，按照RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉錄反應。每組取50 ng cDNA，用SYBR Premix Ex TaqⅡKit試劑盒進行實時熒光定量PCR反應。Ezrin的正向和反向引物分別是5′-ACG TCT GAG AAT CAA CAA GC-3′,5′-TTC TCC TCA TAG TCC TGC AG-3′;GAPDH的正向和反向引物分別是5′-TGC CAC TCA GAA GAC TGT GG-3′,5′-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3′。每孔反應體積為20 μL，每組3個重復孔。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共計35個循環，72 ℃再延伸10 min。反應在Roche Lighcycler 480系統進行，結果處理用△Ct值法。

1.2.4 Western blot檢測 MG63細胞接種于6孔板，加入或不加入10 mmol/L二甲雙胍培養48 h后，收集細胞，PBS洗1次，加入 RIPA(含蛋白酶抑制劑)裂解細胞，冰上放置30 min，超聲斷裂 DNA，低溫離心取上清于另一EP 管。二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，取40 μg總蛋白變性后100～130 V恒壓電泳約90 min，200 mA恒流轉膜約120 min。5%牛奶搖床室溫封閉1 h，一抗室溫搖床孵育1 h后4 ℃ 過夜。PBST洗3次，二抗室溫搖床孵育1 h。PBST洗2次，PBS洗1次，曝光。

1.2.5 細胞侵襲和遷移實驗 細胞侵襲實驗：MG63細胞種板，加入10 mmol/L二甲雙胍培養48 h，將存活的骨肉瘤細胞種入已鋪好Matrigel基質膠的Tranwell小室上層，行無血清培養36 h，吸去孔中培養基，用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，稍微晾干后用結晶紫染色20 min，用棉簽擦去上室面上的細胞，PBS洗3次，取出小室，晾干，鏡下拍照。100倍顯微鏡下計數上下左右中5個隨機不同視野的穿膜細胞數，取均值。實驗重復3次。細胞遷移實驗：方法同侵襲實驗，只是transwell上室不用基質膠處理，觀察時間為24 h。

1.2.6 明膠酶譜實驗 MG63細胞加入10 mmol/L二甲雙胍處理48 h后，每孔加入1 mL無血清培養基繼續培養24 h，收集上清液，將上清液移入離心管中2 000 r/min，4 ℃離心10 min，上清液用Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Deviceces濃縮，測定蛋白濃度于-80 ℃儲存備用。配置8%分離膠和5%濃縮膠(膠中均含1%明膠)，取30 μg蛋白與上樣緩沖液(非還原型)混合，不加熱。4 ℃電泳，80 V約1.5 h。電泳結束后，將凝膠用去離子水洗兩次后，用1×buffer A震蕩洗脫2次，每次30 min。將凝膠置于孵育液buffer B中37 ℃溫箱中孵育42 h。用考馬斯亮藍染色液染色2 h，脫色液(冰醋酸∶甲醇∶去離子水=5∶7∶88)震蕩脫色2 h后，顯示出基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)約72×103和MMP-9約92×103為位于藍色背景上的白色透亮帶，掃描儀掃描圖片備用。

2 結 果

2.1 二甲雙胍抑制骨肉瘤MG63細胞體外的遷移和侵襲能力 當用二甲雙胍10 mmol/L處理MG63細胞48 h后細胞的遷移和侵襲能力明顯減弱(圖1)，遷移從(171.70±6.60)個/視野減少到(50.30±4.30)個/視野，侵襲從(159.30±3.50)個/視野減少到(46.00±4.40)個/視野，處理前、后比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 Transwell遷移與侵襲實驗結果(×200)

a:P<0.01，與對照組相比。

圖2 二甲雙胍抑制MG63細胞的遷移和侵襲能力比較

2.2 二甲雙胍抑制MMP2和MMP-9的酶活性 對照組細胞的上清液均可降解明膠，表現出72×103和92×103位置的透明條帶；而實驗組的細胞上清液降解明膠的能力顯著下降，表現為明膠上的消化條帶減弱(圖3)，結果提示二甲雙胍可以降低MMP-2和MMP-9的酶活性。

圖3 二甲雙胍抑制MMP-2和MMP-9的酶活性

2.3 二甲雙胍抑制MG63細胞中Ezrin的表達 二甲雙胍可顯著降低MG63細胞中Ezrin基因的mRNA表達，從(100.00±5.20)%降到(30.20±1.70)%(圖4A)。Western blot結果亦顯示，10 mmol/L二甲雙胍處理細胞48 h可明顯下調Ezrin蛋白的表達，見圖4B。

A：Ezrin的mRNA水平，a：P<0.01，與對照組相比；B：Ezrin蛋白水平。

圖4 二甲雙胍下調Ezrin的mRNA和蛋白水平

2.4 二甲雙胍抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲依賴于Ezrin的下調 侵襲實驗結果顯示，上調Ezrin可使MG63細胞的遷移和侵襲能力均明顯增強，遷移從(175.00±8.70)個/視野增加到(300.00±5.80)個/視野，侵襲從(153.70±3.50)個/視野增加到(290.00±5.20)個/視野。而上調Ezrin還可降低二甲雙胍對MG63細胞遷移和侵襲的抑制作用，高表達Ezrin后，遷移從(50.00±9.80)個/視野恢復到(99.30±5.80)個/視野，侵襲從(43.70±3.00)個/視野恢復到(90.30±6.10)個/視野，結果均有統計學意義(P<0.01)，見圖5、6。

圖5 Transwell遷移與侵襲實驗結果(×200)

2.5 二甲雙胍通過下調Ezrin減弱MAPK/Erk信號通路 二甲雙胍能下調MG-63細胞中p-Erk的蛋白水平，且不影響Erk的總蛋白水平，但p-Erk的降低可因過表達Ezrin而有所減少，卻不會因過表達vector而有所變化(圖7A)。而經二甲雙胍處理MG-63細胞后Akt的磷酸化水平和總蛋白水平均未發生明顯的改變(圖7B)。

a:P<0.01，與同組未加Ezrin比較；b:P<0.01，與對照組比較。

圖6 兩組骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力比較

A：二甲雙胍對MAPK/Erk信號通路的影響及過表達Ezrin對此信號通路的影響；B：二甲雙胍對Akt/mTOR信號通路的影響。

圖7 二甲雙胍通過下調Ezrin減弱MAPK/Erk信號通路

3 討 論

骨肉瘤常見于兒童和青少年，具有早期遠處轉移和高度局部復發傾向。盡管近年來在外科手術以及新輔助化療上取得了很大進展，但病死率仍很高，其主要原因之一是骨肉瘤易復發轉移[14-15]。目前臨床治療骨肉瘤的藥物主要是化療藥物，如大劑量甲氨蝶呤、多柔比星、順鉑和異環磷酰胺等，多毒副作用大且易產生耐藥性[3-4,16]。因此，尋找一種新的安全、有效的藥物對提高骨肉瘤患者生存具有非常重要的意義。

二甲雙胍是一種臨床上常用的降血糖藥物，近年來人們發現其對多種惡性腫瘤的生長具有抑制作用，可能成為治療腫瘤的輔助藥物，但其作用機制尚不完全清楚[5-7]。本研究首次發現二甲雙胍對骨肉瘤細胞的遷移和侵襲具有抑制作用，并探討了它的作用機制。Transwell小室實驗結果表明二甲雙胍處理骨肉瘤MG63細胞后細胞的穿膜能力降低，遷移和侵襲能力減弱。MMP-2和MMP-9的活性是與腫瘤侵襲轉移能力密切相關的指標，明膠酶譜實驗結果提示二甲雙胍降低了MMP-2和MMP-9的酶活性，即骨肉瘤細胞降解細胞外基質的過程受到了抑制，骨肉瘤的侵襲轉移能力減弱。已知Ezrin蛋白在多種人類腫瘤的轉移中發揮了重要作用[8-11]。Folio等[17]研究表明，Ezrin蛋白是在一項骨肉瘤配對分析研究中鑒定出來的與骨發病相關的16種蛋白中的一種。在本研究中發現二甲雙胍可以下調Ezrin的表達，并且高表達Ezrin可以降低二甲雙胍對骨肉瘤細胞的遷移侵襲抑制，這很可能是因為二甲雙胍通過下調Ezrin的表達從而抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲。此外，還發現二甲雙胍可以通過抑制Ezrin表達間接下調MAPK/Erk信號通路，導致骨肉瘤細胞的遷移和侵襲受到抑制。雖然有研究認為Ezrin蛋白能夠調節Akt信號[18]，但本研究發現二甲雙胍處理骨肉瘤細胞后Akt通路的活化沒有發生明顯的改變，這與以前對胰腺癌細胞的研究相一致[19]。因此，本研究認為二甲雙胍抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲可能是通過下調Ezrin和MAPK/Erk信號通路而實現。作為一種腫瘤抑制藥物，二甲雙胍抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力是通過下調Ezrin的表達，繼而抑制MAPK/Erk信號通路的激活，即通過二甲雙胍-Ezrin-Erk軸。

二甲雙胍抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力為骨肉瘤的治療提供了一個新策略，也為增加骨肉瘤的化療敏感性提供了一個新方法。二甲雙胍通過下調Ezrin的表達從而抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲，也提示了Ezrin作為骨肉瘤潛在治療靶點的可能性。

綜上所述，本研究的完成為二甲雙胍用于臨床治療骨肉瘤患者奠定了理論基礎，提供了臨床轉化方面的有力依據，對于獲得新的骨肉瘤治療靶點、克服骨肉瘤臨床藥物耐受也具有重要意義。目前骨肉瘤動物模型中二甲雙胍的抗腫瘤作用尚不清楚，二甲雙胍的抗骨肉瘤作用是否還有其他的分子機制參與也尚不明確，有待進一步深入探討研究。

[1]Link MP,Goorin AM,Miser AW,et al.The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity[J].N Engl J Med,1986,314(25):1600-1606.

[2]Meyers PA,Heller G,Healey J,et al.Chemotherapy for nonmetastatic osteogenic sarcoma:the Memorial Sloan-Kettering experience[J].J Clin Oncol,1992,10(1):5-15.

[3]楊英年.骨肉瘤治療進展[J].中國醫藥科學,2014,4(6):49-52.

[4]王威,畢文志.骨肉瘤治療現狀與展望[J].解放軍醫學院學報,2013,34(2):198-200.

[5]Deng XS,Wang S,Deng A,et al.Metformin targets Stat3 to inhibit cell growth and induce apoptosis in triple-negative breast cancers[J].Cell Cycle,2012,11(2):367-376.

[6]Bao B,Wang Z,Ali S,et al.Metformin inhibits cell proliferation,migration and invasion by attenuating CSC function mediated by deregulating miRNAs in pancreatic cancer cells[J].Cancer Prev Res (Phila),2012,5(3):355-364.

[7]Tsenq CH.Diabetes,metformin use,and colon cancer:a population-based cohort study in Taiwan[J].Eur J Endocrinol,2012,167(3):409-416.

[8]Ghaffari A,Hoskin V,Szeto A,et al.A novel role for ezrin in breast cancer angio/lymphangiogenesis[J].Breast Cancer Res,2014,16(5):438-443.

[9]Chen MJ,Gao XJ,Xu LN,et al.Ezrin is required for epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-β1 in A549 cells[J].Int J Oncol,2014,45(4):1515-1522.

[10]LoVascoVR,LeopizziM,PuggioniC,et al.Ezrin silencing remodulates the expression of Phosphoinositide-specific Phospholipase C enzymes in human osteosarcoma cell lines[J].J Cell Commun Signal,2014,8(3):219-229.

[11]Mao J,Zhang M,Zhong M,et al.MicroRNA-204,a direct negative regulator of ezrin gene expression,inhibits glioma cell migration and invasion[J].Mol Cell Biochem,2014,396(1/2):117-128.

[12]Cerezo M,Tichet M,Abbe P,et al.Metformin blocks melanoma invasion and metastasis development in AMPK/p53-dependent manner[J],Mol Cancer Ther,2013,12(8):1605-1615.

[13] Wu B,Li S,Sheng L,et al.Metformin inhibits the development and metastasis of ovarian cancer[J].Oncol Rep,2012,28(3):903-908.

[14] Whelan J,McTieman A,Cooper N,et al.Incidence and survival of malignant bone sarcomas in England 1979-2007[J].Int J Cancer,2012,131(4):508-517.

[15]Wu PK,Chen WM,Chen CF,et al.Primary osteogenic sarcoma with pulmonary metastasis:clinical results and prognostic factors in 91 patients[J].Jpn J Clin Oncol,2009,39(8):514-522.

[16]Petrilli AS,de Camargo B,Filho VO,et al.Results of the Brazilian Osteosarcoma Treatment Group Studies Ⅲ and Ⅳ:prognostic factors and impact on survival[J].J Clin Oncol,2006,24(7):1161-1168.

[17]Folio C,Mora MI,Zalacain M,et al.Proteomic analysis of chemonaive pediatric osteosarcomas and corresponding normal bone reveals multiple altered molecular targets[J].J Proteome Res,2009,8(8):3882-3888.

[18]Khanna C,Wan X,Bose S,et al.The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis[J].Nat Med,2004,10(2):182-186.

[19]Meng Y,Lu Z,Yu S,et al.Ezrin promotes invasion and metasisi of pancreatic cancer cell[J].J Transl Med,2010,23(8):61-75.

Inhibition effect of metformin on migration and invasion in osteosarcoma MG63 cell line*

SuXiaotao1,HeJun1,OuJun1,ShenYingying2△

(1.DepartmentofSpinalSurgery,AffiliatedNanhuaHospital;2.InstituteofClinicalMedicine,FirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

Objective To observe the effect of metformin on the migration and invasion of osteosarcoma MG63 cells.Methods Osteosarcoma MG63 cells as the research objects were treated with metformin and then the transwell chamber assay was used to detect the change of cell migration and invasion ability.The gelatin zymography was used to detect the activity of MMP-2 and MMP-9.Real-time PCR was used to measure the expression level of Ezrin mRNA level.Western blot was used to detect the expression level of Ezrin protein;Ezrin plasmid was transfected into cells by lipofectamine 2000 and its influence on metformin-induced cell migration and invasion inhibition and the downstream signaling pathways was observed.Results Metformin could significantly inhibit the migration and invasion of MG63 cells and decreased the enzymatic activity of MMP-2 and MMP-9.The mRNA and protein levels of Ezrin in MG63 cells were decreased remarkably after 48 h medication treatment.Moreover,up-regulating Ezrin could attenuate metformin-induced osteosarcoma cell migration and invasion inhibition and metformin-induced MAPK/Erk signaling pathway inhibition.Conclusion Metformin could inhibit the migration and invasion ability of MG63 cells by possibly down-regulating the Ezrin and MAPK/Erk signaling pathway.

metformin;osteosarcoma;cell movement;neoplasm invasiveness;Ezrin;MAPK/Erk signaling pathway

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.008

國家自然科學基金資助項目(81502276)。 作者簡介：蘇小桃(1972-)，副主任醫師，副教授，碩士研究生，主要從事骨腫瘤與脊柱相關疾病診治的研究。△

，Tel：18273435520；E-mail：shenyingying1113@126.com。

R73-37

A

1671-8348(2016)05-0602-04

2015-06-26

2015-09-06)