絞股藍總皂甙對肝HepG2細胞三酰甘油代謝的影響及機制*

陳建萍，任新生，李 青，孫中華，郭再玉

(1.天津泰達醫院急診科；2.天津泰達醫院ICU；3.天津泰達醫院腎內科；4.天津泰達國際心血管病醫院心內科；5.天津泰達醫院神經外科，天津300457)

論著·基礎研究

絞股藍總皂甙對肝HepG2細胞三酰甘油代謝的影響及機制*

陳建萍1，任新生2，李 青3，孫中華4，郭再玉5△

(1.天津泰達醫院急診科；2.天津泰達醫院ICU；3.天津泰達醫院腎內科；4.天津泰達國際心血管病醫院心內科；5.天津泰達醫院神經外科，天津300457)

目的 探討絞股藍總皂甙(GPs)對培養肝HepG2細胞三酰甘油(TG)代謝的影響及機制。方法 采用HepG2細胞為模型細胞，加入GPs進行孵育，觀察其對細胞內TG的影響，并采用熒光定量PCR的方法，分析脂代謝過程中的關鍵酶基因，包括乙酰輔酶A羧化酶(ACAC)A、ACACB、脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰輔酶A乙酰轉移酶(ACAT1)、棕櫚酰輔酶A氧化酶(ACOX1)及肉堿脂酰轉移酶(CPT)1、2。并進一步在細胞水平干擾關鍵酶基因，驗證其對TG代謝的影響。結果 GPs可顯著降低HepG2細胞的TG水平，發現GPs可顯著抑制FASN基因的表達及其在較高水平下促進CPT1基因的表達，其蛋白水平的表達改變與基因表達一致。在細胞水平瞬時干擾FASN的表達，在干擾FASN后，GPs降低TG的幅度顯著減少，提示GPs主要通過抑制FASN起作用。結論 GPs可減少肝HepG2細胞內TG水平，其作用主要是通過抑制FASN的表達而抑制脂肪酸的合成。

絞股藍總皂甙；甘油三酯類；脂肪酸合成酶復合物；肉堿脂酰轉移酶

絞股藍(gynostemma pentaphyllum)為葫蘆科絞股藍屬植物絞股藍的根狀莖或全草，為我國常用中藥，具有清熱解毒、止咳化痰、補氣生津、健脾安神之功效。現代藥學研究表明，其主要藥效成分為絞股藍總皂苷(gypenosides，GPs)，它是從絞股藍中分離獲得的80 余種皂苷的總稱，現已研究發現其抗腫瘤、抗血小板聚集、抗氧化、抗缺血再灌注損傷及調節脂質代謝等作用顯著，并能夠有效地保護心腦血管和肝臟損傷[1]。近年來，越來越多的研究顯示GPs對血脂代謝有重要的調節作用，能有效防治高脂血癥及動脈粥樣硬化。如灌胃給予高脂乳劑的大鼠服用GPs后，大鼠血脂中總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及三酰甘油(TG)水平有顯著降低，對高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)有升高作用，顯示絞股藍提取物具有改善高脂血癥的作用[2]。在實驗中發現GPs能通過對血脂的調節，減少動脈粥樣硬化的發生[3-4]。其降低TC、可能與促進肝細胞低密度脂蛋白受體(LDLR)的表達有關[5]。盡管這些研究提示GPs對血脂代謝有重要的調節效應，但具體的機制并不十分清楚。鑒于肝臟在脂質代謝中的核心作用及TG在肝臟中蓄積導致脂肪肝的發生、發展，因此，本文選擇肝HepG2細胞模型，探討GPs對TG的影響，并探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2細胞購自美國ATCC細胞庫(ATCC HB-8065)，培養基為含10%胎牛血清FBS (Gibco,Grand Island,NY) 的MEM (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA) ，置于37 ℃的5%CO2的培養箱。GPs購自上海同田生物技術有限公司， 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自江蘇碧云天生物技術研究所。TG測定試劑盒購自上海生物制品研究所。乙酰輔酶A羧化酶(ACAC)A、ACACB、脂肪酸合成酶(FASN)、肉堿脂酰轉移酶Ⅰ(CPT1)及GAPDH的抗體均購自美國的Abcam公司(Cambridge，MA)公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖活力測定 采用MTT法檢測細胞的增殖活性。GPs用二甲基亞砜DMSO配成10 mg/mL的母液，實驗時用培液稀釋至相應的濃度。HepG2接種于96孔培養板，每孔細胞數為5×103個，實驗組分別給予終濃度為125、25、5、1 μg/mL的GPs，以0.1% DMSO為溶劑對照。加藥孵育時間為48 h，然后每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT，孵育4 h，棄培養液，然后每孔加入150 μL的DMSO，搖勻10 min，然后置于酶標儀測波長490 nm的每孔吸光度(A)，以對照組細胞為100%，其他組根據A值進行相應的換算。每組有4個重復孔，實驗重復3次。

1.2.2 細胞內TG的測定 HepG2細胞接種于6孔板，每孔的細胞數為4×105個，接種過夜后再加入不同濃度的GPs孵育24 h，選用50 μmol/L的非諾貝特(Fenofibrate)作為陽性對照。細胞經加藥處理后，收集細胞，進行TG的測定。具體方法如下：各管加入800 μL異丙醇，置冰上靜置提取1 h，然后置4 ℃ 12 000×g離心15 min。取上清真空抽干，最后用20 μL異丙醇溶解，用于測定細胞TG水平。TG水平的測定采用TG試劑盒根據說明書進行測定。另外取離心后的沉淀用20 μL的蛋白RIPA裂解液溶解后測定其蛋白水平，采用BCA方法按照操作說明進行，結果表示為每毫克細胞總蛋白中所含的TG(μg/mg)。每組有3個重復孔，實驗重復3次。

1.2.3 熒光定量PCR HepG2細胞接種于6孔板，每孔的細胞數為4×105個，接種過夜后再加入不同濃度的GPs孵育24 h。收集細胞，每孔加入1 mL TRIzol裂解細胞后收集至1.5 mL無RNA酶離心管，提取總RNA。然后用Invitrogen產品的反轉錄酶試劑盒(SuperScript II Reverse Transcriptase kit)合成cDNA。以cDNA為模版，采用TOYOBO公司的熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix)進行檢測，內參基因選擇GAPDH。具體方法如下：模版為2 μg，引物為0.2 μmol/L，PCR預混合試劑為10 μL，加水補至20 μL的終體積，混合試劑置于ABI7300定量PCR儀進行檢測。反應結束后計算△△CT值，并設對照組為1。各基因的引物序列，見表1。

1.2.4 蛋白免疫印跡分析 HepG2細胞接種于6孔板，每孔的細胞數為4×105個，接種過夜后再加入不同濃度的GPs孵育24 h，選用50 μmol/L的非諾貝特(Fenofibrate)作為陽性對照。收集細胞，用蛋白裂解液(RIPA)收集細胞的總蛋白直接用于蛋白免疫印跡分析。蛋白免疫印跡方法如下：每孔細胞總蛋白的上樣量為10 μg，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后用轉移至硝酸纖維素膜。用5%脫脂奶粉的含0.1%的Tris緩沖液(TBST)室溫封閉2 h，再用一抗在4 ℃孵育過夜。一抗用TBST洗滌后，再用相應的二抗在室溫孵育1 h，最后用相應靈敏度的ECL發光劑進行發光。

1.2.5 siRNA檢測 HepG2細胞接種于6孔板，每孔的細胞數為2×105個，接種過夜后再加入干擾RNA(siRNA)，FASN的siRNA是購自于商品化的4個siRNA的混合物 (Dharmacon Inc.,Lafayette,Co.)，并用scrambled siRNA 作為陰性對照。使用Invitrogen公司的lipofectamine 2000按標準操作說明進行轉染。轉染48 h后，再加入GPs處理24 h，一部分樣本采用蛋白免疫印跡方法進行干擾效率的驗證，一部分樣本用于測定細胞內TG水平，方法同上。

2 結 果

2.1 GPs可降低培養HepG2細胞的TG水平 采用MTT的方法，觀察GPs對HepG2細胞的增殖活性影響。GPs為125 μg/mL時可顯著降低HepG2細胞的增殖活力，在25 μg/mL時對細胞活性有輕度的抑制作用，而在5、1 μg/mL時對細胞增殖活性無明顯抑制作用，見圖1。因此，為了排除GPs其他作用的干擾，本研究選擇了GPs 25、5、1 μg/mL對肝細胞TG代謝的影響。GPs與HepG2孵育24 h后，測定細胞內TG水平，發現GPs 25、5 μg/mL可顯著降低細胞內TG水平，而在GPs 1 μg/mL時無明顯作用。GPs在25 μg/mL時對肝細胞的降TG效應與陽性對照藥非諾貝特(Fenofibrate)在50 μmol/L時效應較為接近，顯示其較好的降脂效果，見圖2。

2.2 GPs對脂肪酸代謝相關基因表達的影響 采用熒光定量PCR的方法，檢測ACACA，ACACB、FASN、乙酰輔酶A乙酰轉移酶(ACAT1)、棕櫚酰輔酶A氧化酶(ACOX1)、CPT1及CPT2基因在GPs作用24 h后的表達改變。GPs對FASN有顯著的抑制作用，對CPT1在25 μg/mL時有一定的促進作用，而對其他一些基因的表達無明顯影響(圖3)。結果提示，GPs可能通過抑制脂肪酸的合成，及一定程度上激活脂肪酸氧化來降低TG水平，而促進脂肪酸氧化與陽性對照藥非諾貝特作用特點相似。

1：對照組；2：1 μg/mL GPs組；3：5 μg/mL GPs組；4：25 μg/mL GPs組；5：125 μg/mL GPs組；a：P<0.05，與對照組比較。

圖1 GPs與HepG2細胞孵育48 h對HepG2細胞

增殖活性的影響

1：對照組；2：1 μg/mL GPs組；3：5 μg/mL GPs組；4：25 μg/mL GPs組；5：陰性對照組；a：P<0.05，與對照組比較。

圖2 GPs與HepG2孵育24 h對細胞TG水平的影響

1:ACACA;2:ACACB;3:FASN;4:ACAT1;5:ACOX1;6:CPT1;7:CPT2。a：P<0.05，與對照組相比。

圖3 GPs對脂肪酸合成及代謝關鍵酶基因表達的影響

2.3 GPs可抑制FASN的蛋白表達 GPs可以顯著降低FASN的基因表達及促進CPT1的基因表達，由于蛋白水平是分子功能的執行體，因此本研究進一步檢測了這些分子在蛋白水平的改變情況。用GPs處理HepG2細胞24 h，并選用陽性對照藥非諾貝特作為對照。采用蛋白免疫印跡的方法，檢測藥物作用24 h的蛋白表達，GPs可顯著抑制FASN的蛋白表達，并與劑量濃度相關(圖4)。GPs在25 μg/mL時對CPT1的蛋白表達有一定的促進作用，而陽性對照藥非諾貝特可顯著促進CPT1表達。另外， ACACA也是脂肪酸合成的關鍵酶，結果顯示其在蛋白水平也無改變，與基因的檢測結果一致。以上結果提示，GPs降TG水平與其抑制脂肪酸合成有關，而與陽性對照藥非諾貝特主要促進脂肪酸氧化代謝有所不同。

2.4 干擾FASN的表達可顯著減少GPs的降脂效應 FASN的干擾效率采用蛋白免疫印跡方法進行驗證，在FASN未干擾組中，加入GPs后，FASN顯著減少，而在FASN干擾組中，加入GPs后，FASN下降幅度有所縮小(圖5A)。同時，檢測了細胞內TG水平(圖5B)，加入GPs后，細胞內的TG水平明顯下降，與上述結果一致；另外，HepG2在干擾FASN后，細胞內的TG水平也顯著下降，然而在干擾TG的情況下，GPs降TG的作用幅度顯著減少。

-：不添加化合物；+：添加化合物。

圖4 GPs對脂肪酸合成及代謝酶的蛋白表達影響

A：蛋白免疫印跡方法；B：細胞內TG水平；a：P<0.05，與對照組比較。-：不添加化合物，+：添加化合物。

圖5 干擾FASN對GPs降脂效應的影響

3 討 論

本研究中，對GPs在肝HepG2 TG代謝中的作用進行了深入的研究，發現GPs具有明顯降低肝HepG2 TG的作用，提示其在防治肝細胞脂肪沉積中的應用前景。肝細胞作為體內脂代謝的中心樞紐，是連接血脂平衡和肝臟脂代謝平衡的關鍵，本研究的結果也提示GPs能夠減少血中TG，其可能的原因是通過抑制肝臟的脂質合成來起作用。前期的研究中發現GPs可顯著降低高脂肪高膽固醇飲食大鼠的血脂[6]，如降低血中的TG、TC、游離脂肪酸及低密度脂蛋白，并且能夠顯著地減少大鼠肝臟的脂質沉積，這一現象與本研究結果一致，即GPs可能在改善脂肪肝方面有一定的潛在應用價值。

回顧近幾年的文獻，許多研究關注GPs在抗腫瘤中的應用，如GPs可通過促進內質網應激及線粒體凋亡通路誘導口腔鱗癌細胞SCC-4的周期阻滯及凋亡[7]，還可通過下調NF-κB及基質金屬蛋白酶9(MMP-9)來抑制SCC-4細胞的轉移[8]；GPs誘導線粒體凋亡的作用在多種腫瘤細胞中已經證實，如結腸癌細胞[9]、肺癌細胞[10-11]及肝癌細胞[12-13]。這些研究提示，GPs在一定的濃度下對腫瘤細胞有殺傷作用，因此為了排除本模型中其對HepG2的細胞毒作用帶來的干擾，首先摸索了合適的劑量濃度。GPs在125 μg/mL的濃度下可顯著抑制HepG2細胞的增殖活性，而在25 μg/mL濃度下雖有一定的抑制，但相對不十分明顯，因此選擇了25 μg/mL以下的幾個劑量濃度用于研究。在這樣的濃度下，發現GPs抑制TG的作用是較為直接的作用。從另一方面來看，抑制TG合成可能對其抗腫瘤作用有一定的幫助，因為脂質合成是腫瘤細胞增殖分裂的物質基礎。

為了研究GPs降細胞內TG的機制，本研究對脂肪酸代謝中關鍵酶的基因進行了分析，如ACAC的兩個亞基ACACA和ACACB，ACAC催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A，是脂肪酸從頭合成的限速酶，也是降脂藥物開發的潛在靶點[14-15]，然而GPs對其無影響。FASN是促進脂肪酸長鏈合成的主要催化酶，對于脂肪酸的合成至關重要。本研究結果顯示，GPs可顯著抑制FASN的基因表達，提示其重要的降脂機制。本研究也考察了脂肪酸合成過程中的ACAT1，發現對其無明顯調節作用。另外，也對脂肪酸β氧化代謝的酶進行了分析，如ACOX1，它是脂肪酸β氧化的第一個催化酶，然而GPs亦對其表達無明顯作用；CPT1是脂肪酸β氧化代謝的關鍵限速酶，GPs在較高的濃度下可促進其表達，提示GPs可能也促進脂肪酸的氧化代謝。本研究在蛋白水平進行驗證，結果與基因的表達一致，即GPs顯著抑制FASN的表達及在較高濃度下促進CPT1的表達。以上結果提示GPs可能通過抑制脂肪酸合成及促進其氧化來降低TG水平。

為了進一步驗證FASN在GPs降TG的作用，本研究觀察在干擾FASN的情況下GPs降TG的效應。結果顯示，干擾FASN可顯著降低肝細胞TG水平；與非干擾FASN的條件下GPs降TG的效應相比，HepG2細胞在干擾FASN后GPs降TG的幅度顯著減少，結果表明FASN是GPs降TG的主要機制，即GPs通過抑制FASN表達而降低TG的效應。雖然GPs也可能存在促進脂肪酸β氧化代謝，本研究結果提示其可能的主要作用是通過抑制FASN來介導。但是GPs是如何來抑制FASN的表達，并不清楚，有待于今后進一步的深入研究。

綜上所述，本研究首次報道了GPs對培養肝HepG2細胞的降脂效應，其降TG效應主要是通過抑制FASN的表達來抑制脂肪酸的合成，另一方面可能在一定程度上具有促進脂肪酸β氧化代謝的作用。本研究結果為闡釋GPs降脂效應提供了理論基礎，并為其今后在臨床上的應用提供實驗依據，具有重要的科學意義。然而目前對于GPs在降脂中的作用及機制仍十分有限，需要進一步系統全面的深入研究，才能為其臨床應用提供良好的研究基礎。

[1]金亭亭，孫兆林，江蔚新.絞股藍化學成分及藥理作用研究進展[J].亞太傳統醫藥，2014，10(16)：30-32.

[2]沈楠，許文頻，李敏，等.絞股藍皂苷對高脂血癥大鼠脂代謝的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2011，9(9)：1081-1083.

[3]賀琴，譚華炳，趙琴.絞股藍總皂甙抗高脂血癥致動脈粥樣硬化的機制研究進展[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2009，7(4)：464-465.

[4]汪鋆植，胡格，翟文海.絞股藍總皂苷外用對高血脂小鼠的降血脂作用研究[J].中國民族民間醫藥雜志，2007，16(1)：41-43.

[5]王亞利，范春雷，竇曉兵.絞股藍總皂苷對肝細胞低密度脂蛋白受體表達的影響[J].中國藥理學通報，2010，26(1)：138-139.

[6]Qin R,Zhang J,Li C,et al.Protective effects of gypenosides against fatty liver disease induced by high fat and cholesterol diet and alcohol in rats[J].Arch Pharm Res,2012,35(7):1241-1250.

[7]Chen JC,Lu KW,Tsai ML,et al.Gypenosides induced G0/G1arrest via CHk2 and apoptosis through endoplasmic reticulum stress and mitochondria-dependent pathways in human tongue cancer SCC-4 cells[J].Oral Oncol,2009,45(3):273-283.

[8]Lu KW,Tsai ML,Chen JC,et al.Gypenosides inhibited invasion and migration of human tongue cancer SCC4 cells through down-regulation of NFkappaB and matrix metalloproteinase-9[J].Anticancer Res,2008,28(2A):1093-1099.

[9]Yan H,Wang X,Wang Y,et al.Antiproliferation and anti-migration induced by gypenosides in human colon cancer SW620 and esophageal cancer Eca-109 cells[J].Hum Exp Toxicol,2014,33(5):522-533.

[10]Lu HF,Chen YS,Yang JS,et al.Gypenosides induced G0/G1arrest via inhibition of cyclin E and induction of apoptosis via activation of caspases-3 and -9 in human lung cancer A-549 cells[J].In Vivo,2008,22(2):215-221.

[11] Liu JS,Chiang TH,Wang JS,et al.Induction of p53-independent growth inhibition in lung carcinoma cell A549 by gypenosides[J].J Cell Mol Med,2015,19(7):1697-1709.

[12]Sun DP.Gypenosides induce apoptosis by Ca2+overload mediated by endoplasmic-reticulum and store-operated Ca2+channels in human hepatoma cells[J].Cancer Biother Radiopharm,2013,28(4):320-326.

[13]Shi L,Pi Y,Luo C,et al.In vitro inhibitory activities of six gypenosides on human liver cancer cell line HepG2 and possible role of HIF-1α pathway in them[J].Chem Biol Interact,2015,238(1):48-54.

[14]Tong L.Acetyl-coenzyme A carboxylase:crucial metabolic enzyme and attractive target for drug discovery[J].Cell Mol Life Sci,2005,62(16):1784-1803.

[15] Peng Y,Lei T,Yuan J,et al.Arachidonic acid induces acetyl-CoA carboxylase 1 expression via activation of CREB1[J].Endocrine,2009,36(3):491-497.

Effect of gypenosides on triglycerides metabolism of hepatic HepG2 cells and its mechanism*

ChenJianping1,RenXinsheng2,LiQing3,SunZhonghua4,GuoZaiyu5△

(1.DepartmentofEmergency,TianjinTedaHospital,Tianjin300457,China;2.ICU,TianjinTedaHospital,Tianjin300457,China;3.DepartmentofNephrology,TianjinTedaHospital,Tianjin300457,China;4.DepartmentofCardiology,TianjinTedaInternationalCardiovascularDiseasesHospital,Tianjin300457,China;5.DepartmentofNeurosurgery,TianjinTedaHospital,Tianjin300457,China)

Objective To explore the effect and mechanism of gypenosides (GPs) on triglycerides(TG) metabolism in cultured liver HepG2 cells.Methods The HepG2 cells were adopted as the model cells and incubated with GPs.Their effect on intracellular triglycerides was observed.The fluorescent quantitative RT-PCR was adopted to analyze the expression of key enzyme genes in lipid metabolism including acetyl-CoA carboxylase (ACACA,ACACB),fatty acid synthase (FASN),acetyl-CoA acetyltransferase 1 (ACAT1),acyl-CoA palmitoyl oxidase 1(ACOX1),carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) and carnitine palmitoyltransferase 2 (CPT2).Then the effect on TG metabolism was further verified by interfering the key enzyme gene at the cellular level.Results GPs could significantly decrease the level of intracellular triglycerides in HepG2 cells,and could significantly inhibit the expression of FASN gene and promote the expression of CPT1 gene in a higher concentration,and its protein level expression was consistent with the gene expression.Moreover,the expression of FASN was transiently interfered at the cellular level,after interfering FASN,the magnitude of GPs in decreasing TG was significantly decreased,suggesting that GPs played the effect mainly by inhibiting FASN.Conclusion GPs could decrease the intracellular TG level of liver HepG2,its effect in inhibition of the synthesis of fatty acid is mainly through the inhibition of FASN.

gypenosides;triglycerides;fatty acid synthetase complex;carnitine palmitoyltransferase

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.007

濱海新區衛生局聯合攻關項目(2012BWKL006)。 作者簡介：陳建萍(1972-)，主治醫師，大學本科，主要從事普通內科和急診內科的臨床與研究工作。△

，Tel：(022)25222586；E-mail：zaiyu_guo@126.com。

R575.5

A

1671-8348(2016)05-0598-04

2015-07-01

2015-11-10)