Th17細胞在乙型肝炎病毒相關性肝病中的表達及意義*

陳 梅，郭曉云，姜海行，王家旭，盧東紅，岑 瑜，陶 霖

(廣西醫科大學第一附屬醫院消化內科，廣西南寧 530021)

·論 著·

Th17細胞在乙型肝炎病毒相關性肝病中的表達及意義*

陳 梅，郭曉云△，姜海行，王家旭，盧東紅，岑 瑜，陶 霖

(廣西醫科大學第一附屬醫院消化內科，廣西南寧 530021)

目的 探討Th17細胞在乙型肝炎病毒(HBV)相關性肝病中的表達及相互關系。方法 收集慢性乙型肝炎(CHB)患者21例(CHB組)、HBV相關性肝硬化患者36例(LC組)及健康對照者20例(HC組)。應用流式細胞術檢測外周血Th17細胞頻率；酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測血漿白細胞介素17(IL-17)水平；實時熒光定量PCR法檢測肝組織中IL-17mRNA的表達；免疫組織化學染色檢測肝臟組織中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達和分布。結果 LC和CHB組外周血單個核細胞(PBMC)中Th17細胞頻率、血漿IL-17水平均明顯高于HC組(P<0.01)，且外周血中Th17頻率與對應血漿IL-17水平呈正相關(r=0.430、0.660，P=0.009、0.001)；LC組患者肝組織中IL-17 mRNA水平、α-SMA表達量均明顯高于HC組(P<0.01)，且α-SMA的表達與肝臟炎癥程度(r=0.602，P=0.014)和纖維化分期(r=0.506，P=0.045)呈正相關。結論 Th17細胞可能參與了HBV相關性肝硬化的發生和發展。

Th17細胞；白細胞介素17；肝硬化；肝炎，乙型，慢性

乙型肝炎為世界范圍內的病毒感染性疾病，約10%的感染者疾病呈慢性狀態，且可進展為肝硬化和肝細胞癌，嚴重危害人民健康。有研究表明，CD4+T細胞介導的獲得性免疫應答在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染所致的肝細胞損傷和肝組織炎癥的發病機制中起重要作用[1]。Th17細胞是近年來發現的一群獨立于Th1、Th2細胞的效應性T細胞亞群,以產生大量白細胞介素17(IL-17)為特征[2-3],在自身免疫性疾病、感染及腫瘤中起重要作用。最新研究顯示，Th17細胞參與肝臟疾病的發生、發展，包括酒精性肝病、急慢性乙型肝炎、慢加急性肝衰竭、肝癌等疾病[4-7]，然而對其在HBV相關性肝硬化患者中的表達和作用，目前的報道很少，其具體作用機制也未完全闡明。本研究收集了健康者、慢性乙型肝炎(CHB)和HBV相關性肝硬化患者外周血和肝組織標本，通過檢測外周血Th17細胞、血漿IL-17以及肝內α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、IL-17mRNA的表達情況，以探討Th17細胞及其細胞因子與HBV相關性肝硬化的關系及可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2012年10月至2014年5月住院的CHB患者21例(CHB組)，其中，男14例，女7例；年齡18～71歲，中位年齡34.00歲。HBV相關性肝硬化患者36例(LC組)，其中，男28例，女8例；年齡27～71歲，中位年齡48.50歲。診斷符合2010年版CHB防治指南[8]，所有患者入組前6個月內未接受抗病毒及免疫調節治療；并排除合并HIV感染，其他病毒性肝炎，酒精性肝病，自身免疫性疾病及其他系統嚴重疾病的患者。另收集健康對照者20例(HC組)，其中，男12名，女8名；年齡24～45歲，中位年齡35.50歲，均無肝炎病史，HBV血清學標志物均陰性，肝功能各項指標正常。研究經本院倫理委員會批準，所有入選對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 主要試劑：IFN-γ-AF488、IL-17-AF647、IL-22-PE、CD4-PerCP-Cy5.5抗體及同型對照抗體、固定破膜劑、莫能霉素、溶血素購自美國BD公司，佛波醇乙酯(PMA)、離子霉素購自美國Sigma公司，IL-17 ELISA試劑盒購自北京欣博盛生物科技有限公司。TRIZOL試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自美國Roche公司。主要儀器：流式細胞儀(美國BD公司)，ABI 7500實時熒光定量PCR反應儀，7600型全自動生化分析儀(日本日立公司)，SYM-Bio半自動免疫分析儀及DA-7600實時熒光定量擴增儀。

1.2.2 流式細胞術檢測外周血Th17細胞頻率 用肝素抗凝真空采血管采集靜脈血3 mL，取300 μL全血，加入十四烷酸PMA 50 ng/mL、離子霉素1 μg/mL、莫能霉素0.7 μg/mL，放入含5%CO2培養箱孵育5 h。然后加入CD4-PerCP-Cy5.5抗體5 μL，室溫避光孵育20 min。加入1×溶血素，混勻，室溫避光孵育10 min。300×g離心5 min，棄上清液，加入250 μL固定破膜劑充分混勻，室溫避光孵育25 min，500×g離心5 min，棄上清液，將其分兩管，實驗管加入IL-17-AF647抗體、IFN-γ-AF488抗體、IL-22-PE抗體，對照管加入同型對照抗體，室溫避光孵育30 min后，用1%多聚甲醛300 μL固定，24 h內上機檢測。所有制備好的樣本均應用流式細胞儀進行檢測，采用FlowJo7.6.1軟件進行分析。CD4+IFNγ-IL17+IL-22-定義為Th17細胞。

1.2.3 ELISA檢測血漿IL-17水平 將前述剩余的血離心取血漿，并保存于-80 ℃冰箱。血漿IL-17的表達水平通過ELISA來檢測，嚴格按照說明書進行。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測肝組織中IL-17mRNA的表達 肝組織取自20例LC組患者，為臨床診斷肝硬化并同意行肝活檢者；12例正常對照(HC組)，為肝血管瘤、肝囊腫等良性病變患者外科手術中切除的正常肝組織。新鮮肝組織取材后立即放入液氮中轉移，保存于-80 ℃冰箱備用。以TRIZOL試劑提取肝組織總RNA，應用逆轉錄試劑盒合成cDNA,產物迅速冰浴后-20 ℃冰箱保存備用。實時熒光定量PCR擴增IL-17 mRNA。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內參照基因。IL-17引物序列：F-CTC TGT GAT CTG GGA GGC AAA，R-CTC TTG CTG GAT GGG GAC A；GAPDH引物序列：F-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC，R-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A。用2-△△Ct值表示mRNA的相對表達量。

1.2.5 肝組織HE和Masson染色 新鮮肝組織(來源同1.2.4)取材后立即固定于4%甲醛溶液中，24 h內制作成蠟塊。蠟塊連續切片，常規HE和Masson染色，光學顯微鏡下觀察并行Scheuer評分[9]。炎癥活動度分為G0～G4，纖維化程度分為S0～S4。

1.2.6 免疫組織化學染色檢測肝臟組織中α-SMA的表達 肝組織(來源同1.2.4)石蠟包埋標本3 μm厚連續切片，采用SP法，切片、脫蠟、水化、抗原修復、第一抗體溫育、第二抗體溫育、二氨基聯苯胺顯色、蘇木精復染、脫水、透明、封片后于顯微鏡下觀察。以PBS代替第一抗體作為空白對照。胞漿呈棕黃色為陽性細胞。每個標本由兩名獨立觀察員計算5個不同高倍視野(×400)，使用Image proplus6.0圖像分析系統半定量測定α-SMA的表達，計算平均光密度(average optical density，AOD)值。

1.2.7 血清學指標的檢測 全自動生化儀檢測ALT、TBIL等肝功能指標，SYM-Bio半自動免疫分析儀檢測HBV血清學標志物及DA-7600實時熒光定量擴增儀檢測HBV DNA載量。

2 結 果

2.1 3組對象外周血Th17細胞頻率比較 采用流式細胞術多色熒光分析法檢測外周血Th17細胞頻率，LC組、CHB組和HC組外周血Th17細胞頻率分別為(2.48±0.34)%、(2.17±0.39)%和(1.11±0.24)%，LC組、CHB組患者外周血Th17細胞頻率均高于HC組(P<0.01)，且LC組又高于CHB組患者(P<0.01)，見圖1。

2.2 3組對象血漿IL-17水平比較 LC組、CHB組患者血漿IL-17分別為(32.51±9.57)、(21.75±4.68)pg/mL，與HC組的(11.73±3.20)pg/mL比較，差異均有統計學意義(P<0.01)，且LC組與CHB組比較，亦差異有統計學意義(P<0.01)。同時分析病例組患者中血漿IL-17和外周血Th17細胞頻率的相關性，發現LC組和CHB組患者血漿IL-17和外周血Th17細胞頻率均呈正相關，差異均有統計學意義(r=0.430、0.660，P=0.009、0.001)。

2.3 肝組織中IL-17mRNA的表達變化 IL-17 mRNA在對照組相對表達量設定為1.00，與對照組比較，LC組明顯升高(3.32±2.80)，差異有統計學意義(P<0.01)。

A:CD4+T細胞的設門；B：HC組、CHB組、LC組外周血Th17細胞頻率的流式圖。

圖1 3組對象外周血Th17細胞的頻率分布

2.4 肝組織中α-SMA的表達 對照組肝組織中α-SMA表達較少，主要分布于血管壁。LC組患者肝組織中α-SMA表達明顯增多，主要集中在門靜脈、匯管區及纖維間隔區域內，與肝臟炎癥程度(r=0.602，P=0.014)和纖維化分期(r=0.506，P=0.045)呈正相關，且α-SMA表達與外周血Th17細胞頻率呈正相關(r=0.789，P=0.000)，見圖2。

2.5 外周血Th17細胞頻率與血清學指標的相關性 LC組患者外周血Th17細胞頻率與血清ALT、TBIL水平及HBV DNA載量間均無明顯相關性(r=-0.040、-0.153、0.177，P>0.05)；CHB組患者外周血Th17細胞頻率與血清ALT、TBIL水平及HBV DNA載量間也未發現明顯相關性(r=0.264、0.195、-0.056，P>0.05)。

A：肝組織α-SMA免疫組化情況；B：對照組和LC組肝組織α-SMA表達的比較；C：LC組肝組織α-SMA的AOD與肝臟炎癥程度和纖維化分期的相關性；D：LC組肝組織α-SMA的AOD與外周血Th17細胞頻率的相關性；a：P<0.01，與HC組比較。

圖2 LC組患者肝組織中α-SMA的表達情況

3 討 論

HBV是一種嗜肝DNA病毒，感染人體后可轉變為慢性感染，在中國，10%～20%的CHB患者在5年內發展為肝硬化[10]。肝硬化是臨床常見的慢性進行性肝病，由一種或多種病因長期或反復作用形成的彌漫性肝損害，以細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的形成和積聚及肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活為特征[11-12]。目前大多數學者認為HBV造成的肝臟損傷及轉歸與機體細胞免疫功能及免疫耐受密切相關[1]。CD4+T淋巴細胞是機體免疫應答中的重要部分，在機體免疫調節中發揮關鍵作用，Th17細胞是近來發現的一個新的CD4+T細胞亞群，以分泌大量IL-17為特征[3]。已有研究表明Th17細胞參與多種肝臟疾病的發生發展，但是對于其在HBV相關性肝硬化患者中的作用機制還未完全闡明。

Thl7細胞能分泌IL-17A(即IL-17)、IL-17F、IL-21、TNF-α等，這些細胞因子誘導其他炎癥介質和白細胞(尤其是中性粒細胞)聚集在炎癥部位，從而加重炎癥[13-14]，IL-17是其中最重要的效應因子，其受體在體內有廣泛表達。IL-17不僅是一種重要的促炎細胞因子，它還可誘導其他促炎細胞因子(如IL-6、TNF)、趨化因子和金屬蛋白酶表達，加重炎癥細胞浸潤和組織損傷[15]。本研究結果顯示，LC組和CHB組患者外周血Th17細胞頻率和血清IL-17水平高于HC組，LC組又明顯高于CHB組，提示Th17細胞可能通過IL-17對HBV相關性肝病的發生、發展起到了一定的促進作用。

在肝組織中，本研究應用PCR的方法檢測肝組織IL-17mRNA的表達情況，結果顯示，LC組患者肝組織IL-17mRNA的相對表達量明顯高于對照組，與上述外周血的結果一致。由于IL-17是由Th17細胞特異性分泌的細胞因子，因此肝內IL-17表達水平可反映Th17細胞的數量。故研究結果提示，LC組患者肝內Th17細胞數量高于對照組。

肝纖維化是肝臟對慢性損傷的修復反應，以ECM異常增生和過度沉積為特征，肝硬化是肝纖維化發展的晚期階段。在肝纖維化進展過程中發揮中心作用的是HSC，其活化和增殖是肝纖維化形成的中心環節[16]，而表達α-SMA是HSC活化的標志。本研究對LC組患者肝組織進行α-SMA的免疫組化染色，結果顯示α-SMA的平均光密度在LC組明顯升高，且與肝臟炎癥和纖維化程度呈正相關，說明患者體內炎癥反應較明顯，肝損傷嚴重，提示在肝纖維化進展過程中，慢性炎癥刺激使HSC處于激活狀態，而激活的HSC不斷分泌ECM，最終形成肝硬化。本研究進一步分析α-SMA與外周血Th17細胞頻率之間有無關聯，結果發現呈正相關關系，由此推測Th17細胞可能參與HSC的激活。

由于Th17細胞與肝損傷相關，本研究分析其與血清學指標的相關性，研究結果表明，患者外周血Th17細胞頻率與肝損傷血清學指標ALT、TBIL及HBV DNA載量間均無明顯相關性，與Liang等[6]對CHB相關參數的分析結果一致。但是Zhang等[5]的研究結果提示，在CHB患者中，外周血Th17細胞頻率與血清ALT及HBV DNA載量均呈明顯的正相關。對比后發現，其樣本例數比較大，而本研究納入的病例數與Liang等[6]的研究相近，增大樣本量或許可以得出更加符合實際的結果。

綜上所述，本研究認為Th17細胞在HBV相關性肝硬化中起到了重要作用，可能發揮了促進炎癥、引起病理損傷的效應，導致肝臟炎癥和免疫損傷，參與肝纖維化的發生、發展，但具體作用機制和途徑尚未明了。Th17細胞的研究將來有可能為調節機體免疫、控制疾病進展提供新的治療靶點。深入研究Th17細胞在HBV相關性肝硬化中的作用，可能為肝硬化患者的臨床治療提供新的策略。

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Expression of Th17 cells in patients with hepatitis B virus-associated liver disease and its significance*

ChenMei,GuoXiaoyun△,JiangHaixing,WangJiaxu,LuDonghong,CenYu,TaoLin

(DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China)

Objective To explore the expression of Th17 cells in the patients with hepatitis B virus(HBV)-associated liver disease and its mutual relation.Methods 21 patients with chronic hepatitis B(CHB),36 patients with HBV-associated liver cirrhosis(LC) and 20 healthy controls(HC) were collected.The flow cytometry was employed to determine the Th17 frequency in peripheral blood;the plasma interleukin-17(IL-17) level was measured by the enzyme linked immunosorbent assay(ELISA);the real-time fluorescence quantitative PCR was used to determine the expression of IL-17 mRNA in liver tissue;the immunohistochemical method was used to measure the expression and distribution of α-smooth muscle actin(α-SMA) in liver tissue.Results The peripheral blood mononuclear cell Th17 frequencies and plasma levels of IL-17 in the LC and CHB groups were significantly higher than those in the HC group(P<0.01),moreover the peripheral blood Th17 cells frequency was positively correlated with corresponding plasma IL-17 level in the LC group(r=0.430,P=0.009) and the CHB group(r=0.660,P=0.001);the liver tissue IL-17mRNA and α-SMA expression levels in the LC group were significantly higher than those in the HC group(P<0.01),moreover the expression of α-SMA was positively correlated with the degree of hepatic inflammation(r=0.602,P=0.014) and the stage of hepatic fibrosis(r=0.506,P=0.045).Conclusion Th17 cells could be involved in the occurrence and development of HBV-associated liver disease.

Th17 cells;interleukin-17;liver cirrhosis;hepatitis,B type,chronic

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.005

國家自然科學基金資助項目(81260083)；廣西自然科學基金資助項目(2014GXNSFAA118203)；廣西高校科學研究項目(KY2015YB069)；廣西衛生廳重點學科普通外科學實驗室及中央財政支持地方高校發展專項資金(肝病外科重點學科)資助項目。 作者簡介：陳梅(1988-)，在讀碩士研究生，主要從事免疫細胞對肝纖維化影響的研究。△

，Tel：13977121496；E-mail:withoutgloom@sohu.com。

R392.3；R575.1

A

1671-8348(2016)05-0592-03

2015-07-13

2015-10-25)