低表達miRNA-21對人肺癌H358細胞增殖及凋亡作用的研究*

黃軍霞，李 穎，鈄建波，涂應鋒

(1.浙江省衢州市開化縣人民醫院內科，浙江衢州 324300；2.哈爾濱醫科大學附屬第四臨床醫院心內科，黑龍江哈爾濱 150001)

·論 著·

低表達miRNA-21對人肺癌H358細胞增殖及凋亡作用的研究*

黃軍霞1，李 穎1，鈄建波1，涂應鋒2△

(1.浙江省衢州市開化縣人民醫院內科，浙江衢州 324300；2.哈爾濱醫科大學附屬第四臨床醫院心內科，黑龍江哈爾濱 150001)

目的 探討微RNA(miRNA)-21對人肺癌H358細胞體外增殖及誘導凋亡方面的作用。方法 采用體外轉染法將miRNA-21抑制劑瞬時轉染H358細胞48 h后，應用定量real-time PCR特異探針法檢測H358細胞中miRNA-21的表達水平，應用MTT法檢測H358細胞的生長情況，熒光缺口末端標記法(TUNEL)法分析H358細胞凋亡情況，并用Western blot檢測H358細胞中抑癌基因PTEN表達的變化。結果 與對照組比較，miRNA-21 抑制劑轉染組H358細胞的miRNA-21表達水平顯著降低(P<0.05)，細胞生長明顯受到抑制(P<0.05)，且通過PTEN靶蛋白誘導細胞凋亡(P<0.05)。結論 低表達miRNA-21可以抑制人肺癌H358細胞的體外增殖，誘導細胞凋亡，為肺癌生物治療提供新的治療靶點。

肺腫瘤；微RNA；PTEN；細胞凋亡

微RNA(microRNAs，miRNA)是近年來發現的一類長度為19～25個核苷酸的非編碼小分子RNA。它主要通過與靶目標基因3′非翻譯區的完全或不完全配對，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，從而參與調控個體發育、細胞凋亡、增殖及分化等生命活動[1]。實驗證據表明，如同癌基因或抑癌基因的功能，miRNA可通過調控其靶基因參與的信號轉導通路，影響腫瘤的發生和發展[2-3]。已證明，miRNA能夠調控多種生理學和病理學的過程，如細胞分化，細胞增殖和腫瘤形成。某些miRNAs可直接參與人類腫瘤(如肺癌、乳腺癌、顱腦腫瘤、肝癌、結直腸癌及淋巴瘤等)的形成[4]。miRNA既可作為癌基因又可作為抑癌基因，參與人類腫瘤形成的多條信號通路。因此，miRNA可能作為腫瘤預防和治療的有效應用方法[5]。miRNA-21是新近報道的一種miRNA分子，可以有效抑制乳腺癌、肝癌和胃癌等多種腫瘤的生長和轉移[4,6]。然而，miRNA-21是否在肺癌生長中發揮作用研究報道極少，且其作用的分子機制目前尚不明確。因此，本研究旨在觀察miRNA-21對人肺癌H358細胞體外生長的影響，以了解miRNA-21在肺癌生長中的可能作用及其機制，為miRNA在肺癌臨床生物治療方面提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 材料 主要實驗試劑：miRNA-21抑制劑和抑制劑雜序由上海吉瑪生物工程公司合成；轉染試劑lipofectamine 2000和MTT試劑盒購自Roche公司；SYBR Green PCR Master Mix染料熒光定量real-time PCR試劑盒購自美國Applied Biosystems公司；細胞培養液RPMI 1640購自GibcoBRL公司；雙抗(氨卞青霉素鈉、硫酸鏈霉素)購自友康基業生物科技(北京)有限公司；胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)購自Gibco公司；抗PTEN抗體購自Cell Signaling Technology公司。實驗儀器：蛋白電泳儀、PVDF膜購于BIO-RAD公司；紫外分光光度儀(SmartSpecTM3000)購于美國BIO-RAD公司；Odyssey紅外熒光掃描成像系統購于美國LI-COR公司；6孔板和96孔板購自上海拜力生物科技有限公司公司；共聚焦顯微鏡FV300購自日本 Olympus公司。miRNA-21引物序列上游：5′-GGG GTA GCT TAT CAG ACT G-3′，下游：5′-TGG AGT CGG CAA TTG CAC TG-3′；內參U6引物序列上游：5′-GCT TCG GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，下游：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′，均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 H358細胞培養 人肺癌H358細胞，購于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。用含10%胎牛血清、1 000 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的RPMI1640細胞培養液，于37 ℃、5%CO2條件下培養人肺癌H358細胞，待單層細胞生長達到90%融合時，用胰蛋白酶消化細胞，收集細胞，PBS沖洗1次后備用。細胞實驗分組：轉染試劑對照組、miRNA-21 抑制劑轉染組和miRNA-21抑制劑雜序轉染組。分別轉染48 h后，用于后續的實驗。

1.2.2 H358細胞轉染 收集處于對數生長期的人肺癌H358細胞，PBS沖洗1次，將5×104個細胞重懸于1 mL RPMI1640培養液中，轉移至6孔板，在37 ℃、5%CO2條件下培養。細胞培養12 h后，將2 μL轉染試劑lipofectamine 2000與5 nmol miRNA-21抑制劑和miRNA-21抑制劑雜序以體積比1∶50混合，室溫放置10 min后，緩慢加入培養上清液中，搖晃混勻后繼續培養。

1.2.3 MTT實驗 收集各組H358細胞，以3×103個細胞/孔接種于96孔培養板，每孔培養液總量200 μL，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養48 h，加入2 μg/mL的MTT液(50 μL/孔)，繼續培養3 h。吸出孔內培養液后，加入DMSO液(150 μL/孔)，將培養板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結晶物溶解。使用酶標儀檢測各孔吸光度(D)值(波長570 nm)。

1.2.4 缺口末端標記法(TUNEL)法檢測細胞凋亡 首先將H358細胞爬片，爬滿細胞的載玻片用PBS洗滌1次，沖洗時動作需輕柔。室溫下晾干載玻片，使細胞貼得更牢。4%多聚甲醛固定細胞30 min。PBS沖洗2次，每次5 min。4 mL 3%H2O2加36 mL甲醇配制的封閉液封閉細胞10 min。PBS洗2次，每次5 min。加入含0.1% Triton X-100和0.1%檸檬酸三鈉的穿透液，冰上孵育2 min。使用Roche原位細胞死亡檢測試劑盒(In situ cell death detection kit)進行TUNEL染色，檢測細胞凋亡。根據Roche說明書制備TUNEL反應混合液，每張載玻片加50 μL TUNEL反應混合液于玻片上，放入避光濕盒中，于37 ℃孵箱中反應1 h。PBS洗2次，每次5 min。37 ℃培養箱DAPI孵育10 min，細胞核呈現藍染。

1.2.5 細胞中RNA的提取、逆轉錄以及實時定量PCR分析miRNA-21的表達 首先是用1 mL Trizol吹打溶解貼壁的細胞，并將含有細胞的Trizol液收集在進口的1.5 mL EP中。每支EP管中再加入0.2 mL氯仿進行萃取，劇烈搖蕩EP管15 s，經4 ℃ 13 500 r/min離心15 min。取少量上層水相液體置于新的進口離心管中，每支管中加入0.5 mL異丙醇，混勻后室溫放置10 min，再經4 ℃ 13 500 r/min離心10 min，此時形成RNA沉淀。將混合液體輕輕倒出，再用1 mL的75%乙醇溶液洗滌沉淀，靜置后在4 ℃ 10 600 r/min離心5 min。棄去上清液，EP管于室溫條件干燥5 min，再用適量的DEPC水充分溶解干燥的RNA。按照0.5 μg RNA的加樣量，充分混合樣品、dNTP、逆轉錄酶、RT buffer和ddH2O配制成20 μL反應體系，最后經AJ000程序經行逆轉錄，所得cDNA樣品于-20 ℃冰箱中保存。經SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒進行PCR反應，反應體系為：SYBR Green Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 1 μL，補充去離子水7 μL。選擇U6作為內參。

1.2.6 Western blot分析PTEN蛋白的表達 將各組細胞培養瓶置于冰上，PBS洗滌細胞3次，每個培養瓶中加入適量細胞裂解液 (Ripa∶蛋白酶抑制劑=100∶1)，收集培養瓶壁上的細胞，放置冰上裂解30 min，13 500 r/min離心15 min，吸取上清液置于-80 ℃冰箱中保存。取1 μL樣品應用BCA試劑盒測定細胞中蛋白質濃度。依次配制10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠，5%SDS-PAGE積層膠，每個孔道中加入等質量(80～100 μg)的樣品，電泳60～90 min，溴酚藍快遷移出分離膠時停止電泳。恒定300 mA電流，轉膜時間為80 min。取出NC膜置于5%的脫脂奶粉中，在4 ℃的環境中封閉2 h。分別用一抗PTEN抗體 (1∶200)、GAPDH (1∶1 000)在4 ℃冰箱中孵育過夜。取出孵育過抗體的NC膜，用PBS-T洗滌3 次。然后用(1∶4 000)稀釋的紅外熒光標記二抗均勻鋪展在NC膜上，避光孵育1 h后用PBS-T洗滌3次。最后將各條NC膜用Odyssey紅外熒光掃描成像系統進行檢測，并且計算相應條帶的灰度值。

2 結 果

2.1 各組細胞miRNA-21表達水平及H358細胞增殖比較 結果顯示，miRNA-21抑制劑轉染組miRNA-21的表達水平較轉染試劑對照組和miRNA-21抑制劑雜序轉染組明顯降低(P<0.05)；miRNA-21對人肺癌H358細胞增殖的影響，與轉染試劑對照組比較，轉染miRNA-21抑制劑后人肺癌H358細胞的增殖明顯下調(P<0.05)；而轉染miRNA-21抑制劑雜序對人肺癌H358細胞的增殖無明顯的影響，見表1。

表1 各組細胞miRNA-21表達水平及H358 細胞增殖比較

a：P<0.05，與轉染試劑對照組比較。

2.2 低表達miRNA-21對人肺癌H358細胞凋亡的影響 TUNEL染色法結果顯示，與轉染試劑對照組細胞凋亡率(10.35±0.22)%比較，H358細胞轉染miRNA-21抑制劑后，被TUNEL染色染成綠色的凋亡細胞明顯增多，為(38.65±0.73)%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)；而miRNA-21抑制劑雜序轉染組，未引起細胞凋亡數量的增加，見圖1、2。

圖1 各組H358細胞TUNEL染色顯示圖像(×200)

1：轉染試劑對照組；2：miRNA-21抑制劑轉染組；3：miRNA-21抑制劑雜序轉染組；a：P<0.05，與對照組比較。

圖2 各組H358細胞凋亡結果比較

1：轉染試劑對照組；2：miRNA-21抑制劑轉染組；3：miRNA-21抑制劑雜序轉染組；a：P<0.05，與轉染試劑對照組比較。

圖3 Western blot檢測人肺癌H358細胞中PTEN的表達

2.3 低表達miRNA-21對人肺癌H358細胞中PTEN表達的影響 與miRNA-21 抑制劑雜序轉染組和轉染試劑對照組比較，miRNA-21 抑制劑轉染組可以顯著促進H358細胞中PTEN的表達(P<0.05)，見圖3。

3 討 論

miRNA最早是用在腫瘤疾病的鑒別診斷中，對10種腫瘤進行了miRNA微陣列表達譜的研究，結果表明腫瘤的類型不同，其組織中的miRNA表達譜也會存在很大差異[7]。通過病毒或脂質體技術將miRNA分子包裹后轉入細胞中，導致腫瘤細胞死亡，此方法常用于治療肺癌等特殊腫瘤。這些技術是通過調控側序列和pre-miRNA發夾的表達，激發合成內源性的miRNA，從而達到抑制靶基因的目的[8]。Cheng等[9]通過合成抗miRNA的反義寡核苷酸序列，使其高效地轉染到細胞中，達到干預miRNA抑制細胞生長和促進凋亡等生理作用。

近年來的研究顯示，miRNA-21在不同腫瘤中呈差異性表達，其作用類似于癌基因，在腫瘤發生、發展過程中起關鍵的調控作用[10-11]。研究證明miRNA-2l通過抑制前凋亡基因，而起到致癌基因的作用。有學者推測，抑制miRNA-21的表達是否能夠抑制腫瘤的生長。Li等[12]發現，過表達的miRNA-21使腫瘤細胞對某些抗腫瘤藥物的敏感性降低，有促進腫瘤生長的作用。此外，臨床相關的研究還表明，腫瘤組織中如果miRNA-21高表達則提示腫瘤預后較差，并且化療的效果也不佳[13]。

目前針對miRNA-21靶分子的研究證明，miRNA-21的明確靶點有 PTEN、PDCD4、Maspin、TPM1等[14]。在本研究中，采用體外轉染后MTT法檢測發現，敲除H358肺癌細胞中miRNA-21的表達，可以抑制H358肺癌細胞的體外生長；TUNEL實驗進一步證實，通過敲除H358肺癌細胞miRNA-21的表達可以誘導其凋亡。此外，Yan等[15]通過檢測113例乳腺癌標本后發現miRNA-21在乳腺癌中表達上調，通過進一步研究還發現miRNA-21在乳腺癌中的高表達與這些患者的預后密切相關，并且miRNA-21對預后的影響與疾病階段相對獨立；該學者還發現，在乳腺癌中抑制miRNA-21可以誘導凋亡，并且下調抗凋亡基因Bcl-2的表達，提示miRNA-21可以作為乳腺癌的一個治療靶點。

腫瘤抑制因子PTEN是miRNA-21的一個重要靶點，并且增加miRNA-21的表達會導致腫瘤細胞中PTEN的表達下調，會促進腫瘤的生長。Zhu等[16]證明miRNA-21可以通過下調腫瘤抑制基因TPM1以及促凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時還可以調控PTEN和PDCD4的表達，促進細胞增殖，促進乳腺癌細胞的侵襲和轉移。本研究同樣證實通過敲除H358肺癌細胞中miRNA-21的表達，腫瘤抑制因子PTEN表達明顯的升高，誘導細胞凋亡。然而，miRNA-21參與調控肺癌發生發展的調控機制還有待進一步的研究。

總而言之，通過本研究證實，低表達miRNA-21可以抑制人肺癌H358細胞的體外生長，這可能與其促進肺癌細胞PTEN的表達及誘導細胞凋亡有關。在后續研究中，本課題組將進一步探討miRNA-21在肺癌細胞增殖作用中的分子機制，為肺癌發生發展機制的研究以及臨床肺癌分子生物治療提供一種全新的分子靶點。

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Study on effects of low expression of miRNA-21 on proliferation and apoptosis of human lung cancer H358 cell*

HuangJunxia1,LiYing1,DouJianbo1,TuYingfeng2△

(1.DepartmentofInternalMedicine,KaihuaCountyPeople′sHospital,Quzhou,Zhejiang324300,China;2.DepartmentofCardiology,FourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin,Heilongjiang150001,China)

Objective To study the effects of microRNA-21 on the proliferation and apoptosis of human lung cancer cell line H358.Methods MiRNA-21 inhibitor was transiently transferred into human lung cancer cell line H358 by using transfection in vitro.The expression level of miRNA-21 in H358 cells was detected by real-time PCR before or after transfection.The MTT assay was used to assess the proliferation of H358 cells.And the cell apoptosis was analyzed by TUNEL Apoptosis Assay Kit.Furthermore,the expression of phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN) was determined by the Western-blot assay.Results The expression of miRNA-21 was markedly decreased compared with the control group (P<0.05).The proliferation of miRNA-21 inhibitor-tranfected H358 cells was obviously inhibited (P<0.01).And expression level of miRNA-21 in H358 cells was significantly decreased,the cell growth was significantly inhibited,moreover apoptosis was induced by PTEN target protein (P<0.05).Conclusion Low expression of miRNA-21 could inhibit the in vitro proliferation of H358 cells and induces apoptosis,which could provide a novel therapeutic target for anti-cancer biotherapy.

lung neoplasms;microRNAs;PTEN;apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.004

國家自然科學基金青年科學基金資助項目(81401457)；中國國家博士后基金面上項目(2014M561376)；黑龍江省博士后資助經費(LBH-Z14143)；黑龍江省自然科學基金留學基金(LC2015038)；黑龍江省衛生計生委面上項目(2014-385)。 作者簡介：黃軍霞(1978-)，主治醫師，大學本科，主要從事肺癌及肺血管疾病分子機制研究。△

，Tel：13624606369；E-mail:tyfdoctor@163.com。

R563.9

A

1671-8348(2016)05-0588-04

2015-06-27

2015-09-22)