大鼠伏核注射甘丙肽對神經病理性痛的鎮痛作用及其對星形膠質細胞活化的影響*

張筱敏,李崇陽,趙 敏，李 君，徐世蓮△

(昆明醫科大學：1.基礎醫學院生理學系，昆明 650500；2.第四附屬醫院腫瘤科，昆明 650021；3.基礎醫學院解剖學與組織胚胎學系，昆明 650500)

·論 著·

大鼠伏核注射甘丙肽對神經病理性痛的鎮痛作用及其對星形膠質細胞活化的影響*

張筱敏1,李崇陽2#,趙 敏3，李 君1，徐世蓮1△

(昆明醫科大學：1.基礎醫學院生理學系，昆明 650500；2.第四附屬醫院腫瘤科，昆明 650021；3.基礎醫學院解剖學與組織胚胎學系，昆明 650500)

目的 探討神經病理性痛大鼠伏核注射甘丙肽的鎮痛作用及其對星形膠質細胞活化的影響。方法 左側坐骨神經結扎構建神經病理性痛大鼠模型，伏核注射甘丙肽，測定傷害性熱刺激和壓力刺激誘發的后爪縮爪潛伏期(HWL)，觀察甘丙肽的鎮痛作用；Western bolt法檢測星形膠質細胞的特異性標志物-膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)的表達，觀察伏核注射甘丙肽對星形膠質細胞活化的影響。結果 左側坐骨神經結扎引起大鼠雙側HWL縮短，且伏核GFAP的表達增加；神經病理性痛大鼠伏核注射甘丙肽引起雙側HWL延長，GFAP的表達減少。結論 伏核微量注射甘丙肽對神經病理性痛的鎮痛作用可能通過抑制星形膠質細胞的活化來完成。

甘丙肽；伏核；星形膠質細胞；神經病理性痛；鎮痛作用

在臨床，由疾病和損傷引起的慢性疼痛已經成為影響健康的一個主要問題，而神經病理性痛是慢性疼痛中最為常見的一種。以往對疼痛的形成機制及其鎮痛的研究多集中在神經元的作用上，但近幾年的研究發現，膠質細胞(glial cells)參與了許多神經系統的疾病，這其中就包括了疼痛[1]。在神經元和膠質細胞之間存在著相互協作的關系，致使疼痛發生，且愈演愈烈[2]。本實驗通過檢測伏核(nucleus accumbens,NAc)星形膠質細胞(astrocytes)的特異性標志物-膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表達，進一步探討星形膠質細胞在神經病理性痛的產生和調制中的作用。 甘丙肽(galanin)是一種29 aa(在人類中為30 aa)的多肽，它廣泛分布于中樞神經系統與外周組織中，是一種以抑制性作用為主的神經肽[3-4]。1994年瑞典Hokfelt等[5]提出甘丙肽可能具有鎮痛作用，是一種內源性鎮痛物質。本課題前期研究也表明在正常大鼠和炎癥大鼠的伏核注射甘丙肽具有鎮痛作用[6-7]。但甘丙肽的鎮痛作用機制不清，目前多認為甘丙肽通過激活其受體來完成作用[8]。伏核是一個重要的中樞鎮痛部位。近年來，越來越多的研究報道伏核在痛覺信息的產生和調制中具有重要作用[9-11]。因此，本實驗研究大鼠伏核注射甘丙肽對神經病理性痛的鎮痛作用及對星形膠質細胞活化的影響，探索甘丙肽的鎮痛作用是否通過抑制星形膠質細胞的活化來完成。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：實驗選用雄性Sprague-Dawky大鼠40只，體質量180～250 g，由昆明醫科大學實驗動物中心提供，實驗期間動物分籠飼養，自由取食和飲水，自然光照。實驗采取各種措施以減小對動物的傷害，所有操作均符合國際疼痛研究協會(international association for the study of pain,IASP)[12]和昆明醫科大學動物倫理委員會的規定。(2)實驗藥品：實驗所用微量注射溶液均用生理鹽水配制，0.5 nmol/L的甘丙肽(rat甘丙肽,Tocris,UK)。

1.2 方法

1.2.1 測量后爪縮爪潛伏期(hindpaw withdrawal latency,HWL) 實驗使用熱板智能儀(YLS-6B，濟南益延科技有限公司) 測試熱刺激誘發的HWL，溫度維持在(52.0±0.2)℃[13-14]。將大鼠一側后爪足底平放于熱板，并保證大鼠整個足底充分接觸熱板，大鼠縮爪時間即為熱刺激誘發的HWL。使用Randall Selitto(UGO Basile 37215，意大利)測試壓力刺激誘發的HWL。 Randall Selitto的楔形壓力閥壓在鼠爪的爪背靠近腳趾處，踩住開關，步進馬達推動砝碼向前移動，此時施加在大鼠后爪上的壓力以30 g/s的速度增加，讀出大鼠后爪回縮時砝碼所指的刻度，即為壓力刺激誘發的HWL。實驗前大鼠需進行5 d熱板和Randall Selitto測試的訓練,以使動物對傷害性刺激的HWL較為平穩,維持在3～6 s。

1.2.2 Western blot檢測伏核GFAP的表達 將大鼠用4%異氟醚麻醉后斷頭取腦，提取伏核部位蛋白質，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參，Western blot法檢測GFAP的表達。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜后將膜以5%脫脂奶粉封閉1 h，加入洗膜緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)稀釋的多克隆GFAP抗體 (小鼠抗GFAP，1∶5 000，Millipore) 或者單克隆GAPDH抗體(小鼠抗GAPDH，1∶5 000,Millipore)，4 ℃過夜 。 棄一抗，以 TBST洗滌3次，每次10 min。 加入TBST稀釋的辣根過氧化物酶(horse reddish peroxidase,HRP)標記的相應二抗(1∶4 000，Pierce)中，室溫孵育1 h。棄二抗，以TBST洗滌3次，每次10 min。顯影和定影，用image J 軟件分析條帶。

1.2.3 神經病理性痛動物模型建立 將14只大鼠分為假手術組和坐骨神經結扎組，每組7只。兩組大鼠均采用腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，在其左側大腿中部暴露約8～10 mm長的坐骨神經；坐骨神經結扎組使用4號羊腸線輕度結扎神經，共結扎4圈，最后用4號絲線縫合皮膚[15]；假手術組暴露坐骨神經后即縫合皮膚，不做神經結扎。術后14 d測定大鼠對傷害性熱刺激和壓力刺激誘發的HWL，并檢測伏核GFAP的表達。

1.2.4 伏核埋管和微量注射方法 用45 mg/kg的戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，進行伏核內埋管[16]。將外徑為0.8 mm的不銹鋼套管垂直插入，使用牙科水泥將套管牢固固定。實驗時用外徑為0.4 mm的不銹鋼管作注射管，注射時其尖端伸出套管1 mm，以1 μL/min的速度均勻推進1 μL的藥物。

1.2.5 檢測左側坐骨神經結扎大鼠伏核注射甘丙肽對HWL和GFAP表達的影響 將26只大鼠坐骨神經結扎14 d后，分為生理鹽水注射組(對照組)和0.5 nmol 甘丙肽注射組(甘丙肽組)，每組13只，測定對照組或甘丙肽組第1、3、5天大鼠雙側HWL的變化，每次測定都在注射后15 min開始。行為學測定后迅速取伏核組織，檢測GFAP的表達。

2 結 果

2.1 假手術組和坐骨神經結扎組大鼠HWL和伏核GFAP表達的比較 與假手術組比較，坐骨神經結扎組大鼠雙側HWL 縮短(熱板測試:t左側=10.91,P=0.000 1;t右側=4.37,P=0.000 9。Randall Selitto測試:t左側=5.87,P=0.000 1;t右側=4.72,P=0.000 5)，見圖1。兩組大鼠行為學測定后取伏核組織蛋白質，Western blot法測定GFAP的表達，與假手術組比較，坐骨神經結扎組GFAP的表達上調 (t=3.47,P=0.013),見圖2。

a：P<0.01，與假手術組比較。

圖1 假手術組和坐骨神經結扎組大鼠HWL的比較

a：P<0.05，與假手術組比較。

圖2 假手術組和神經結扎組大鼠伏核GFAP的表達

表1 對照組與甘丙肽組大鼠對熱刺激引起的 HWL比較

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較。

2.2 對照組與甘丙肽組大鼠HWL和GFAP表達的比較 與對照組比較，甘丙肽組注射第1天(熱板測試:t左側=2.27、P=0.032 1,t右側=3.45、P=0.002 1；Randall Selitto測試:t左側=2.74、P=0.011 3，t右側=4.43、P=0.000 2)、第3天(熱板測試:t左側=4.31、P=0.000 4，t右側=7.08、P=0.000 1；Randall Selitto測試:t左側=2.81、P=0.012 0，t右側=4.17、P=0.000 6)、第5天(熱板測試:t左側=4.84、P=0.000 4，t右側=3.23、P=0.007 2；Randall Selitto測試:t左側=4.61、P=0.000 6，t右側=4.52、P=0.000 7)HWL都延長(表1、2)。各組行為學測定結束后，取伏核組織蛋白質，Western blot檢測注射甘丙肽第1、3、5天伏核GFAP的表達。與對照組比較，甘丙肽組第1天GFAP的表達(t=2.36,P=0.142 5)差異無統計學意義(P>0.05)，但甘丙肽組第3天(t=2.93,P=0.042 9)和第5天(t=5.84,P=0.004 3)GFAP的表達下調，見圖3。

表2 對照組與甘丙肽組大鼠對壓力刺激引起的 HWL比較

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較。

圖3 對照組與甘丙肽組大鼠GFAP表達比較(n=3)

3 討 論

雖然病理性神經痛是臨床最常見的慢性疼痛之一，但因其產生機制不完全清楚，故仍缺乏有效的治療措施。Bennett等[15]在1988年描述了結扎一側坐骨神經干的動物模型，是目前公認的一種造成外周神經損傷、導致神經痛的一種常用方法。坐骨神經干結扎后，神經水腫引起血液供應障礙和外周軸突損傷，包括有髓神經纖維和無髓神經纖維，尤其是有髓神經纖維。結扎7～10 d后出現疼痛綜合征，其特點是對熱刺激和壓力刺激的痛敏或觸摸痛，痛敏高峰在14～28 d[15]。本實驗研究觀察到大鼠左側坐骨神經結扎后14 d引起雙側HWL縮短，大鼠痛閾降低，產生神經痛。

近年來，有關膠質細胞在痛覺信息的調制中的作用的研究日漸增多。先前的研究報道脊髓星形膠質細胞的激活在炎癥痛[17-18]和神經痛[19-20]的產生和維持中都具有重要作用。星形膠質細胞一旦被激活，便可釋放多種神經活性物質，包括白細胞介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子α、一氧化氮、前列腺素、興奮性氨基酸、神經生長因子等，這些物質通過提高初級傳入神經釋放P物質、興奮性氨基酸和增加產生疼痛物質的神經元的興奮性來調節疼痛[21]。GFAP是星形膠質細胞的特異性標志蛋白[22]，本實驗研究顯示左側坐骨神經結扎引起大鼠伏核GFAP的表達上調，也提示伏核星形膠質細胞的活化在神經痛的產生和維持中具有重要作用。

自從1983年Tatemoto 等[23]從豬的小腸中分離提取了甘丙肽，越來越多的研究表明甘丙肽在痛覺信息的傳遞和調制中具有重要作用。有研究報道坐骨神經結扎大鼠中腦導水管周圍灰質注射甘丙肽有鎮痛作用[24]。Gu等[25]報道坐骨神經結扎大鼠下丘腦弓狀核注射甘丙肽有鎮痛作用。本實驗研究表明左側坐骨神經結扎大鼠伏核注射甘丙肽15 min后引起雙側HWL延長，提示甘丙肽在伏核對神經痛具有鎮痛作用。

盡管研究表明甘丙肽具有鎮痛作用，但其作用機制并不十分清楚，先前的研究表明甘丙肽受體的非選擇性拮抗劑galantide能阻斷甘丙肽的作用，提示甘丙肽受體的激活在甘丙肽的鎮痛作用中具有重要作用[6,24,26]。有研究報道體外培養的大鼠星形膠質細胞有甘丙肽受體的表達[27]，在體外星形膠質細胞的培養中甘丙肽具有轉錄激活因子的作用[28]，這些結果提示甘丙肽和星形膠質細胞之間具有密切的聯系。因此，本實驗研究甘丙肽是否通過影響星形膠質細胞的活化來完成鎮痛作用。結果顯示坐骨神經結扎大鼠伏核注射甘丙肽第1天GFAP的表達差異無統計學意義(P>0.05)，但注射甘丙肽第3、5天GFAP的表達下調，提示甘丙肽可能通過抑制星形膠質細胞的活化來發揮鎮痛作用，但星形膠質細胞參與痛覺調制的作用可能是延遲性的[29]。

總之，本實驗研究顯示坐骨神經結扎致神經痛大鼠伏核星形膠質細胞被激活；甘丙肽在伏核對神經痛具有鎮痛作用，且這一作用的產生可能涉及星形膠質細胞的活化被抑制。這些結果提示星形膠質細胞的活化在病理性神經痛的產生和維持中有重要作用，抑制星形膠質細胞的活化可能是治療神經痛的有效措施。但對于這些變化的生理意義以及星形膠質細胞如何參與疼痛的調制等都需要進一步深入的研究。

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Analgesic effects of nucleus accumbens injection of galanin in rats with neuropathic pain and its influence on astrocyte activation*

ZhangXiaomin1,LiChongyang2#,ZhaoMin3,LiJun1,XuShilian1△

(1.DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicine,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650500,China;2.DepartmentofOncology,FourthAffiliatedHospital,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650021,China;3.DepartmentofAnatomyandHistoembryology,SchoolofBasicMedicine,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650500,China)

Objective To research the analgesic effect of nucleus accumbens (NAc) injection of galanin in rats with neuropathic pain and its influence on astrocyte activation.Methods The rat left sciatic nerve was ligated for constructing the neuropathic pain rat model.Galanin was injected by intra-NAc.The rat hindpaw withdrawal latency (HWL) induced by the damaging thermal and pressure stimuli was determined for researching the analgesic effect of galanin;the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) as the astrocyte specific marker was detected by Western blot.The influence of NAc injection on the astrocyte activation was investigated.Results The bilateral HWL induced by the left sciatic nerve ligation was shortened,moreover the GFAP expression in NAc was upregulated;the intra-NAc injection of galanin induced an increase in bilateral HWL and a downregulation of GFAP expression.Conclusion The NAc microinjection of galanin may play the analgesic role on neuropathic pain via inhibiting the astrocyte activation.

galanin;nucleus accumbens;astrocytes;neuropathic pain;analgesic role

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.003

國家自然科學基金資助項目(31360245，31460258)；云南省應用基礎研究計劃項目基金(2011FZ111)；云南省科技廳-昆明醫科大學應用基礎研究聯合資金項目(2015FB012)。 作者簡介：張筱敏(1984-)，講師，博士研究生，主要從事生理學科研與教學工作。 # 共同第一作者：李崇陽(1968-)，主治醫師，大學本科，主要從事腫瘤學的研究。△

，Tel:15887826597；E-mail:shilianxu@126.com。

R338.3

A

1671-8348(2016)05-0584-04

2015-08-13

2015-10-24)