HPLC-UV法同時測定羌活酚酸和香豆素類成分含量*

楊　茜，宮美玲，李　晉，金　華，馬　琳，常艷旭

（天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室，天津　300193）

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HPLC-UV法同時測定羌活酚酸和香豆素類成分含量*

楊茜，宮美玲，李晉，金華，馬琳，常艷旭

（天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室，天津300193）

摘要：［目的］建立同時測定羌活酚酸（新綠原酸、綠原酸和阿魏酸）和香豆素（羌活醇和異歐前胡素）兩類成分的高效液相色譜-紫外分析法（HPLC-UV），為羌活藥材的質量評價提供技術支撐。［方法］Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.2%磷酸水，檢測波長330 nm，進樣量5 μL，流速1 mL/min。［結果］兩類成分具有良好的線性關系，方法學驗證均符合要求。［結論］該方法簡單易行，重復性好，專屬性強，可用于羌活藥材的質量控制。

關鍵詞：羌活；高效液相色譜-紫外分析法；含量測定

羌活，是傘形科植物羌活（裂葉羌活，Ntopterygium incisum Ting ex H.T.Chang）或寬葉羌活（Notopterygium forbesii Boiss.）的干燥根莖及根［1］。味辛、苦，性溫。有散寒、祛風、除濕和止痛功能。在臨床上有較廣泛的應用，常用于治療風寒感冒［2］、頭痛［3］、風濕痹痛［4］、肩背酸痛［5］等癥。羌活的化學成分主要為揮發油類、酚酸和香豆素類成分［6］?，F代研究表明羌活具有抗炎［7］、鎮痛解熱［7］、抗心律失常［8］、抗心肌缺血［9］和抗菌［10］等作用。研究發現綠原酸具有一定的抗內毒素作用［11］，新綠原酸對補體激活具有顯著的抑制作用［12］，阿魏酸具有抗輻射、抗氧化和抗炎等作用［13-15］，羌活醇和異歐前胡素具有抗腫瘤作用［16-17］、舒張血管作用［18-19］和抗病毒活性［20］。因此，選擇上述5種成分為指標，進行質量控制研究比選擇單一指標羌活醇進行質量控制研究更符合羌活多成分協同發揮藥效作用特點，更能全面地、合理地評價羌活藥材質量。

目前，盡管已有相關文獻報道測定羌活中阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素和苯乙基阿魏酸酯4種成分的含量測定的方法［21］，但未見羌活中新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇和異歐前胡素同時定量的分析方法。本研究擬建立測定羌活中兩類5種成分（新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇和異歐前胡素）同時定量的高效液相色譜-紫外分析法（HPLC-UV），并對不同產地裂葉羌活中含量進行測定，比較不同產地裂葉羌活5種指標性成分含量差異，為裂葉羌活羌活藥材的質量提供技術支撐。

1　儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2487雙波長UV檢測器，Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。乙腈和甲醇均為色譜級，水為超純水（Milli-Q超純水系統），其余試劑均為分析級。實驗所用其余儀器為超聲提取器，低溫離心機，十萬分之一天平，萬分之一天平，中藥粉碎機。新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素等標準品購于中國藥品食品檢定所，純度均大于98%。16批次不同產地（四川、青海、甘肅、內蒙古、安徽和山西）羌活樣品于秋季采收，經天津中醫藥大學馬琳教授鑒定為裂葉羌活（Ntopterygium incisum Ting ex H.T.Chang）干燥根莖及根。

2　實驗方法

2.1色譜條件色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A），0.2%磷酸水（B）；梯度洗脫程序：0～2 min，12%～17% A；2～10 min，17%～17.5%A；10～12 min，17.5%～17.5%A；12～20 min，17.5%～18%A；20～22 min，18%～21%A；22～26 min，21%～24%A；26～28 min，24%～28%A；28～30 min，28%～30%A；30～33 min，30%～38%A；33～80 min，38%～38%A；80～82 min，38%～60%A；82～100 min，60%～60%A；檢測波長：330 nm；流速1 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：30℃。

2.2標準品溶液的制備精密稱定5.00 mg新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素標準品，分別置于5 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得1.00 g/L的標準品母液。

2.3樣品溶液的制備精密稱取不同產地羌活粉末（60目）0.200 g，分別置于錐形瓶內，加10 mL 80%甲醇，稱質量，超聲提取30 min，放冷至室溫后補足損失的質量，搖勻，將樣品溶液置于離心管中在14 000 r/min下離心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣分析。

2.4方法學驗證

2.4.1線性范圍將5個標準品母液配成適宜濃度的混標溶液，然后將此混標溶液稀釋至一系列濃度，分別進樣5 μL分析，計算峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標建立標準曲線。

2.4.2精密度精密稱取同一羌活（青海）樣品0.200 g，用2.3項下的樣品制備方法制備樣品，在同一色譜條件下連續進樣6次，進樣體積均為5 μL，計算新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素的峰面積，分別計算5成分峰面積的RSD。

2.4.3重復性精密稱取6份同一羌活（青海）樣品0.200 g，用2.3項下的樣品制備方法制備6份樣品，在同一色譜條件下分別進樣，進樣體積為5 μL，計算新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素的峰面積，分別計算5成分峰面積的RSD。

2.4.4穩定性精密稱取同一羌活（青海）樣品0.200 g，用2.3項下的樣品制備方法制備1份樣品，在同一色譜條件下，分別在0、2、4、8、16、24 h進樣，分別計算5成分峰面積的RSD。

2.4.5加樣回收率精密稱定0.100 g羌活（青海）藥材粉末于10 mL內，加入各成分含量與藥材中含量相近的已知量的標準品，連續稱取3份，分別加80%甲醇定容、稱質量，超聲30 min后取出放至室溫，補足質量，搖勻，將樣品溶液置于離心管中14 000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣分析，記錄各指標成分的峰面積，計算含量，求出各成分的加樣回收率。

3　結果

3.1羌活提取條件的優化為充分提取出羌活中5種成分，本研究采用正交實驗對羌活的提取條件進行了優化，以化合物含量為指標，選用L9（34）設計實驗，采用三因素三水平考察了物料比、溶劑的比例、超聲時間對提取率的影響，實驗設計的因素-水平表見表1。

表1　提取因素-水平表

以新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素的質量百分含量之和為指標，對實驗結果進行直觀分析。直觀分析結果見表2。

表2　羌活提取實驗直觀分析

通過直觀分析，發現影響羌活提取率的因素順序為：提取時間＞溶劑比例＞物料比；確定最佳的提取條件為提取時間45 min，溶劑比例80%甲醇，物料比1∶50。

3.2方法學驗證5個成分的標準曲線方程及相關系數見表3，結果表明5個化合物線性關系良好。

表3　5個成分的標準曲線

精密度實驗結果中各化合物峰面積的RSD均小于2%，表明儀器的精密度良好。重復性實驗結果中各化合物峰面積的RSD均小于5%，說明方法的重復性良好。穩定性實驗結果中各化合物峰面積的RSD均小于4%，表明羌活樣品在24 h內穩定，實驗結果見表4。加樣回收率實驗結果表明，各成分的平均回收率均在95%～105%范圍內，見表5。

表4　精密度、重復性、穩定性實驗結果（n=6）　%

表5　加樣回收率實驗結果（n=3）

3.3含量測定將2.2和2.3項制備的樣品溶液與混合對照品溶液進行高效液相色譜法（HPLC）分析，得到混合對照品溶液和羌活藥材（青海）的HPLC色譜圖，見圖1。

利用所建立分析方法對16批不同產地的羌活樣品溶液進行HPLC分析，記錄色譜圖，計算峰面積，按標準曲線計算出含量，結果見表6。

結果顯示，不同產地的羌活中，各指標化合物的含量變化范圍較大，新綠原酸的含量范圍是0.03～0.29mg/g，綠原酸的含量范圍是0.13～2.98mg/g，阿魏酸的含量范圍是0.10～2.14 mg/g，羌活醇的含量范圍是0～6.32 mg/g，異歐前胡素的大致含量范圍是0.55～16.8 mg/g。

圖1　羌活藥材（1號）及混合對照品溶液的HPLC色譜圖

表6　16批樣品中5個成分的含量測定結果　mg/g

4　結論

不同產地的羌活藥材中酚酸和黃酮兩類成分的含量有顯著差異。表明中藥市場中羌活藥材的質量差異較大，原因眾多，可能是由植物基源、生長環境、采收加工等，儲存運輸等因素造成的。因此，對羌活藥材中的指標成分的含量進行控制必不可少。本研究以新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素等成分為指標，建立對這兩類化合物同時定量的HPLC-UV分析方法，為羌活質量控制提供技術支撐。

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中圖分類號：R284

文獻標志碼：A

文章編號：1673-9043（2016）03-0192-04

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.03.11

收稿日期：（2016-02-05）

*基金項目：國家自然基金青年項目（81503213）；天津市高等學校創新團隊培養計劃資助（TD12-5033）。

作者簡介：楊茜（1990-）女，碩士研究生，研究方向為中藥藥效物質基礎研究。

通訊作者：常艷旭，E-mail:tcmcyx@126.com。

Simultaneous determination of phenolic acids and coumarins for quality control of Rhizoma et Radix Notopterygii.by HPLC-UV

YANG Xi，GONG Mei-ling，LI Jin，JIN Hua，MA Lin，CHANG Yan-xu
（Tianjin State Kay Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

Abstract:［Objective］An HPLC-UV method was established to simultaneously determine the content of phenolic acids（neochlorogenic acid，Chlorogenic acid，Ferulic acid）and coumarins（Notopterol，Isoimperatorin）for the quality control of Rhizoma et Radix Notopterygii.［Methods］An Agilent Zorbax SB-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）with a guard column was used as the analytical column to separate the multi-ingredients.The mobile phase was acetonitrile and 0.2%（V/V）phosphoric acid solution.The flow rate was set at 1 mL/min.The injection volume was 5 μL and the eluent was measured at 330 nm.［Results］This method exhibited a good linear relationship，and the results of the method validation up to the requirements.［Conclusion］The established HPLC-UV assay could be used to determinate the content of Rhizoma et Radix Notopterygii for the quality control.

Key words:Rhizomaet Radix Notopterygii.；HPLC-UV；content determination