不同純化方法對丹參水提取液中丹酚酸B的含量影響

王　萍　王宇鶴　賀新懷　辛愛潔　劉亞倩

(1 陜西國際商貿(mào)學(xué)院，咸陽，712046； 2 西藏民族大學(xué)，咸陽，712082)

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中藥研究

不同純化方法對丹參水提取液中丹酚酸B的含量影響

王萍1王宇鶴2賀新懷1辛愛潔1劉亞倩1

(1 陜西國際商貿(mào)學(xué)院，咸陽，712046； 2 西藏民族大學(xué)，咸陽，712082)

摘要目的：考察不同純化方法對丹參水提液中丹酚酸B含量的影響，以優(yōu)選出丹參水提取液的最佳純化方法。方法：以丹酚酸B含量和浸膏得率為考察指標(biāo)，對乙醇沉淀法、高速離心法和大孔樹脂吸附法3種純化方法進(jìn)行了比較。結(jié)果：大孔樹脂吸附法處理后所得到的丹酚酸B的含量最高，浸膏得率最低；乙醇沉淀法處理后丹酚酸B的含量最低，浸膏得率居中；高速離心法處理后丹酚酸B的含量居中，但浸膏得率最高。結(jié)論：大孔樹脂吸附法為丹參水提液的最佳純化方法。

關(guān)鍵詞丹參；丹酚酸B；乙醇沉淀法；高速離心法；大孔樹脂吸附法

丹參為唇形科植物鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖，味苦、性微寒，具有祛瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、清心除煩之效[1]，為臨床上治療“血瘀”癥的常用藥物。丹參水提液中有效成分主要是酚酸類物質(zhì)，包括丹酚酸A、B、C以及原兒茶醛等，其中丹酚酸B是丹參水溶性代表成分之一，且其含量最高[2-5]，故其含量的高低直接影響著丹參水提液質(zhì)量的好壞，從而影響著丹參制劑的質(zhì)量。本文以丹參水提液中丹酚酸B含量和浸膏得率為指標(biāo)，比較了乙醇沉淀法、高速離心法和大孔樹脂吸附法三種方法對水提液中丹酚酸B成分的純化效果，為丹參水提液的純化工藝提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器Alliance e2695型高效液相色譜儀(美國waters公司，Empower色譜工作站)；電子天平(MSA125P-1CE-DU,德國賽多利斯)；高速臺(tái)式離心機(jī)(TGL-10C，上海安亭)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠)；真空干燥箱(DZF-6050，常州市衡正電子儀器有限公司)。

1.2試劑丹參藥材(購自陜西康勝堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：094Q140301)；丹酚酸B對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111562-201212)；AB-8大孔吸附樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司)；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純(購自南京化學(xué)試劑股份有限公司)。

2方法

2.1提取與純化

2.1.1提取工藝取丹參700 g，加水浸泡30 min，煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，濾過，合并濾液，濃縮至每毫升含1 g原生藥的藥液，備用。

2.1.2純化工藝為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，每個(gè)試驗(yàn)方法平行制備4份樣品溶液。

2.1.2.1乙醇沉淀法取水提液200 mL，平均分成4份，每份50 mL，加乙醇至藥液醇濃度為65%，靜置，冷藏過夜，抽濾，回收乙醇并真空干燥成干浸膏，粉碎后備用。

2.1.2.2高速離心法取水提液200 mL，平均分成4份，每份50 mL，置高速離心機(jī)中，10000 r/min離心15 min，濾過，濾液濃縮并真空干燥成干浸膏，粉碎后備用。

2.1.2.3大孔樹脂吸附法取水提液200 mL，平均分成4份，每份50 mL，加1%鹽酸溶液調(diào)pH值至3，靜置，離心，取離心液上樹脂柱(生藥量∶樹脂量=2∶1)。待藥液流完后，加入1倍生藥量超純水沖洗樹脂柱，待超純水流凈后，用4倍量60%乙醇，以1BV/h流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，濃縮并真空干燥成干浸膏，粉碎后備用。

2.2丹酚酸B的含量測定

2.2.1色譜條件根據(jù)2010版《中華人民共和國藥典》及有關(guān)文獻(xiàn)[6-9]確定丹酚酸B含量測定的色譜條件：色譜柱為SinoChrom ODS-BP色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為286 nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2對照品溶液的制備精密稱取丹酚酸B對照品4.0 mg，加適量75%甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，搖勻，作為對照品溶液(0.16 mg/mL)。

2.2.3供試品溶液的制備本品粉末(過三號(hào)篩)約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人75%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，微孔濾膜(0.2 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。各色譜圖見圖1。

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取對照品溶液2 μL、6 μL、10 μL、14 μL、18 μL、20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，測定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積的積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。結(jié)果丹酚酸B在0.32～3.2(μg)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=844519X-28250，R2=0.9999(n=6)。

2.2.5精密度試驗(yàn)精密吸取丹酚酸B對照品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測定丹酚酸B的峰面積值，結(jié)果RSD為0.34%，說明儀器的精密性良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取對照品溶液于0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h各進(jìn)樣10 μL，對照品溶液中丹酚酸B的峰面積值的RSD為0.65%，表明在10 h內(nèi)對照品溶液穩(wěn)定。

圖1　丹參對照品、樣品HPLC色譜圖

注：A.對照品溶液，B.樣品。

2.2.7加樣回收率試驗(yàn)稱取浸膏細(xì)粉(過三號(hào)篩)共6份，每份約0.1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入一定量已知濃度的丹酚酸B對照品溶液，按照2.3.3方法制備供試品溶液，照上述高效液相色譜條件測定。見表1。

表1　丹酚酸B加樣回收率

2.2.8樣品的測定精密吸取各供試品溶液5 mL，置25 mL量瓶中，加75%甲醇溶液至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.2 μm)濾過，取續(xù)濾液10 μL進(jìn)樣，測定丹酚酸B含量。

2.3浸膏得率的測定精密吸取提取液20 mL，置干燥值恒重的蒸發(fā)皿中，蒸干，于105 ℃干燥3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱定重量，計(jì)算浸膏得率。結(jié)果見表2。計(jì)算公式如下：(W1為浸膏重量，V為樣品溶液的體積，W2為藥材重量)。

3結(jié)果

對丹參水提液不同純化方法處理所得丹酚酸B含量和浸膏得率進(jìn)行了測定。見表2。

表2　不同純化方法的丹酚酸B含量和浸膏得率±s)

由表2可知大孔樹脂吸附法處理后所得到的丹酚酸B的含量最高，浸膏得率最低；乙醇沉淀法處理后丹酚酸B的含量最低，浸膏得率居中；高速離心法處理后丹酚酸B的含量居中，但浸膏得率最高。對以上3組丹酚酸B含量數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用以說明各組之間是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3　方差分析表

注：F(3,8)0.05=4.07，F(xiàn)(3,8)0.01=7.59。

從方差分析的結(jié)果可知，3種純化方法丹酚酸B含量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但表3尚未表明3種純化方法兩兩方法之間的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，我們采取兩兩間多重比較(q檢驗(yàn)法)對丹酚酸B含量測定結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。見表4。

表4　三種純化方法兩兩比較表

由表4可知，水提醇沉法與高速離心法的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高速離心法與大孔樹脂吸附法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，水提醇沉法與大孔樹脂吸附法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中以大孔樹脂吸附法純化丹參水提液所得到的丹酚酸B含量最高，與其他方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4討論

中藥水提液中往往所含的化學(xué)成分較多，采用單一指標(biāo)對中藥制劑的制備工藝與質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)具有較大的局限，故本次實(shí)驗(yàn)中采用雙指標(biāo)進(jìn)行考察，確保優(yōu)選的純化工藝條件的合理性。

在實(shí)驗(yàn)過程中，我們查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在近5年的文獻(xiàn)資料中采用高速離心法對丹酚酸B進(jìn)行純化工藝的文獻(xiàn)報(bào)道較少，選擇大孔樹脂吸附法對丹酚酸B進(jìn)行純化工藝的文獻(xiàn)報(bào)道較多，故而在純化方法選擇時(shí)，將傳統(tǒng)的乙醇沉淀法、高速離心法和大孔樹脂吸附法作為本次實(shí)驗(yàn)純化方法，并對結(jié)合參考文獻(xiàn)[10-14]，對乙醇沉淀法和高速離心法采用正交試驗(yàn)確定了各自工藝的最佳參數(shù)，同時(shí)次對大孔樹脂吸附法進(jìn)行考察，篩選了純化丹酚酸B的大孔吸附樹脂，優(yōu)選了大孔吸附樹脂純化丹酚酸B的工藝條件，確定該法的工藝參數(shù)。

乙醇沉淀法雖為水提液中常用的純化方法之一，醇沉后有效成分含量最低，可能是醇沉?xí)r選用的醇沉濃度較高，造成溶液的極性變小，有效成分的溶解度變小而沉淀，影響丹參的藥效；高速離心法對丹參水提液的處理操作方法較為簡單，有效成分的損失也不大，但浸膏得率最高，可能是因?yàn)殡x心機(jī)的轉(zhuǎn)速不夠，沒有將水提取液中的大分子雜質(zhì)去除完全；大孔樹脂吸附法雖操作過于麻煩，工藝復(fù)雜，但有效成分保留率較高，且出膏率大幅度降低，為降低服用量的較好方法。

丹參是常用活血化瘀中藥之一，水溶性成分主要為酚酸類成分，本次實(shí)驗(yàn)僅僅是通過對比實(shí)驗(yàn)，考察了純化方法對丹酚酸B含量的影響，而對丹參水溶性其余成分含量變化的影響還需進(jìn)一步研究。

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(2015-10-11收稿責(zé)任編輯：張文婷)

Effects of Different Purification Methods on Content of Salvianolic Acid B in Water Extract from Salvia Miltiorrhiza Bge

Wang Ping1, Wang Yuhe2, He Xinhuai1, Xin Aijie1, Liu Yaqian1

(1ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce,Xianyang712046,China;2TibetUniversityforNationalities,Xianyang712082,China)

AbstractObjective: To explore the best purification method by observing effects of different purification ways on the extractive rate of salvianolic acid B in Salvia Miltiorrhiza Bge water-extraction. Methods: Salvianolic acid B content and dry extract yield rate were used as indexes for assessing the best purification method among ethanol precipitation, high speed centrifugation and macroporous resin absorption. Results: Among all three methods, salvianolic acid B content by macroporous absorption resin was the highest, with dry extract yield rate being the lowest; salvianolic acid B content by ethanol precipitation was the lowest, with dry extract yield rate being the medium level; and salvianolic acid B content by high speed centrifugation was at the medium level, with dry extract yield rate being the highest. Conclusion: Water extraction of Salvia miltiorrhiza Bge by macroporous absorption resin is considered as the best purification method.

Key WordsSalvia Miltiorrhiza Bge; Salvianolic Acid B; Ethanol precipitation; High speed centrifugation; Macroporous absorption resin

基金項(xiàng)目：陜西省中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目(編號(hào)：13-zy024)；陜西省教育廳科研項(xiàng)目(編號(hào)：14JK2017)

作者簡介：王萍(1977.12—)，女，碩士研究生，講師，主要研究方向：中藥藥物制劑研究，E-mail:964908494@qq.com 通信作者：劉亞倩(1984.12—)，女，碩士研究生，實(shí)驗(yàn)師，主要研究方向：藥劑學(xué)，E-mail：492860562@qq.com

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.039