外周血miR-21檢測(cè)在胰腺癌中的意義研究進(jìn)展

劉書(shū)中,李子全,李政垚,王以朋

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 骨科,北京100730)

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外周血miR-21檢測(cè)在胰腺癌中的意義研究進(jìn)展

劉書(shū)中,李子全,李政垚,王以朋*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 骨科,北京100730)

胰腺癌(pancreaticcarcinoma，PC)是消化系統(tǒng)中惡性程度最高、預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，95%的胰腺癌為胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreaticductuleadenocarcinoma，PDAC)，其發(fā)病率有不斷上升趨勢(shì)。PC在腫瘤致死原因中列第四位，是5年生存率最低的惡性腫瘤，而缺乏早期診斷手段、早期易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和發(fā)生化療耐藥是導(dǎo)致胰腺癌高死亡率的主要原因。胰腺癌早期診斷率低，致使95%以上的胰腺癌患者在明確診斷時(shí)己進(jìn)入進(jìn)展期，約60%患者獲診時(shí)已是IV期病例，病死率高達(dá)99%。手術(shù)是根治胰腺癌的唯一方法，但可施行根治性手術(shù)患者僅占15-20%，并且約70%患者在接受手術(shù)治療后的6-12個(gè)月復(fù)發(fā)。[1]。化療是胰腺癌主要的輔助治療手段，然而腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生的耐藥性嚴(yán)重地影響了胰腺癌化學(xué)治療療效。目前，CA19-9與CEA是最常用的胰腺癌分子診斷標(biāo)志物，但正常人胰腺、膽管、膽囊、胃、乳腺和子宮內(nèi)膜等組織發(fā)生病變時(shí)CA19-9及CEA分泌亦會(huì)增加，且易出現(xiàn)假陽(yáng)性及假陰性，早期診斷胰腺癌的效能則更低。近年來(lái)，提高PC高危人群早期篩查確診率、增強(qiáng)癌變組織藥敏性及改善PC患者生存質(zhì)量已成為PC研究中的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)在真核生物中發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)18-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA。研究表明miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、分級(jí)分期、耐藥性、預(yù)后等密切相關(guān)，參與了腫瘤細(xì)胞重要的細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控,間接地發(fā)揮“促癌和抑癌”等功能，miRNAs的深入研究為多種惡性腫瘤的診斷和治療提供了新思路。研究表明外周血miR-21水平與胰腺癌的病情進(jìn)展密切相關(guān)，有望成為胰腺癌診斷及預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)記物及治療靶標(biāo)[2]。鑒于miR-21與胰腺癌的相關(guān)性逐漸被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)，本文就近年外周血miR-21水平在胰腺癌診療及預(yù)后評(píng)估領(lǐng)域的研究進(jìn)展做一綜述。

1miRNA的分子生物學(xué)特征

miRNA生成過(guò)程中,編碼miRNA的基因首先在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄,在RNA聚合酶II的作用下轉(zhuǎn)錄為幾百至幾千堿基的初級(jí)產(chǎn)物(pri-miRNA),pri-miRNA在核內(nèi)核酸內(nèi)切酶Drosha酶作用下切割成只含60-70堿基的具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾樣前體(pre-miRNA),pre-miRNA被RNAGTP2依賴(lài)的轉(zhuǎn)運(yùn)體exportins5轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿,在IIIDicer酶(雙鏈RNA專(zhuān)一性?xún)?nèi)切酶)作用下形成具有雙鏈結(jié)構(gòu)的miRNA,在酶的作用下裂解成22個(gè)核苷酸的成熟miRNA與互補(bǔ)鏈miRNA*。而miRNA*立即被降解。

miRNA的主要分子生物學(xué)特征包括:(1)通常長(zhǎng)度為18-25nt,3’端可以有2-3個(gè)nt的變化,長(zhǎng)度不定。(2)廣泛存在于真核生物中,不具有開(kāi)放閱讀框架(ORF,openreadframe),不編碼蛋白質(zhì)。(3)成熟后的miRNA5’端為磷酸基團(tuán),3’端是羥基基團(tuán),這一特點(diǎn)可以使miRNA與功能性RNA降解生成片段相區(qū)分，miRNA通過(guò)與靶基因mRNA3’-UTR完全或不完全的互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合,致使靶mRNA降解或翻譯抑制進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá),從而影響細(xì)胞增殖、侵襲、分化和凋亡等多種生物學(xué)行為。(4)miRNA在多種種屬中的表達(dá)具有保守性。(5)miRNA的表達(dá)具有時(shí)序性和組織特異性。miRNA的保守性、時(shí)序表達(dá)特異性和組織表達(dá)特異性提示其在生命活動(dòng)的微觀層面發(fā)揮重要作用[3]。

miRNA的功能由RNA所介導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)介導(dǎo),最終引起蛋白質(zhì)翻譯受抑或者同源mRNA降解等生物過(guò)程，進(jìn)而發(fā)揮抑癌基因或促癌基因的功能[4]。大量研究顯示miRNA可調(diào)節(jié)人類(lèi)近60%的蛋白編碼基因,miRNA與靶mRNA并非完全互補(bǔ)配對(duì),平均每個(gè)miRNA可以直接調(diào)節(jié)人類(lèi)200種不同的mRNA,多個(gè)miRNA可以協(xié)同調(diào)節(jié)某些特殊靶基因,多個(gè)miRNAs也可能共同調(diào)節(jié)同一基因靶點(diǎn),這種協(xié)同調(diào)節(jié)模式形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，因此每一個(gè)miRNA的異常表達(dá)都有可能導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)的表達(dá)異常[5,6]。

2miR-21與胰腺癌的關(guān)系

50%以上的miRNAs基因位于染色體脆性位點(diǎn)及染色體擴(kuò)增、缺失或轉(zhuǎn)位區(qū)域，因而miRNAs表達(dá)異常易導(dǎo)致腫瘤性疾病的發(fā)生。miR-21編碼基因位于第17號(hào)染色體,其成熟序列長(zhǎng)度為21bp。miR-21可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等多種生物學(xué)行為。研究證實(shí)miR-21在胰腺癌、食管癌、肺癌以及結(jié)腸癌等惡性腫瘤組織中均出現(xiàn)異常高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)miR-21在多種惡性腫瘤中通過(guò)抑制PTEN(phosphataseandtensinhomolog)、程序性細(xì)胞死亡因子4(programmedcelldeath4，PDCD4)、金屬蛋白酶3組織抑制因子(tissueinhibitorofmetalloproteinases-3，TIMP3)、TPM1 (tropomyosin1)和maspin等細(xì)胞凋亡相關(guān)基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)及發(fā)生化療耐藥[7]。Moriyama等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-21在胰腺癌組織和細(xì)胞株中均呈顯著高表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-21前體可以明顯增加胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，而抑制miR-21則明顯抑制其增殖與侵襲，同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-21與侵襲相關(guān)基因MMP-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)，進(jìn)而增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞侵襲能力，并證實(shí)miR-21與胰腺癌化療耐藥相關(guān)，提示miR-21有望成為耐化療胰腺癌患者新的治療靶點(diǎn)。miR-21通過(guò)抑制某些基因的表達(dá)、激活蛋白激酶B(proteinkinaseB，PKB)信號(hào)通路等方式激活核因子-κB(nuclearfactorkappaB，NF-κB)信號(hào)通路，NF-κB通路的激活能上調(diào)VEGF蛋白及IL-6等表達(dá)，最終增強(qiáng)PC細(xì)胞浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移能力。Park等[9]研究表明miR-21和miR-221的過(guò)度表達(dá)增強(qiáng)了胰腺癌細(xì)胞的惡性表型，在HS766T細(xì)胞系中應(yīng)用反義寡核苷酸敲除miR-21和miR-221的表達(dá)，可使腫瘤細(xì)胞在G1期生長(zhǎng)受阻，減少細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-21表達(dá)可使其靶基因Bcl-2表達(dá)過(guò)量，間接導(dǎo)致caspase-3蛋白活性下降而使細(xì)胞凋亡減少，下調(diào)miR-21表達(dá)則使caspase-3蛋白活性增加而導(dǎo)致離體PC細(xì)胞凋亡增多。有研究發(fā)現(xiàn)PDAC細(xì)胞株(MiaPaCa-2)中l(wèi)et-7和miR-143的缺失以及miR-21高表達(dá)會(huì)上調(diào)Ras及其GTP激酶，從而促進(jìn)腫瘤增生，而姜黃素類(lèi)似物CDF可以促進(jìn)let-7和miR-143重新表達(dá)以及miR-21表達(dá)下調(diào)，從而抑制腫瘤增生，因此，CDF可能成為新的胰腺癌治療藥物[10]。原位雜交顯示miR-21是由病理性導(dǎo)管細(xì)胞產(chǎn)生，在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中獲得的，胰腺癌細(xì)胞系中miR-21的產(chǎn)生受Kras(G21D)和表皮生長(zhǎng)因子受體調(diào)節(jié)，DuRieu等[11]應(yīng)用Kras(G12D)小鼠模型和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究miRNA在PanIN中的表達(dá)情況,研究發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-205及miR-200與PanIN的發(fā)展相關(guān)，其中miR-21的相關(guān)性最大，而且miR-205和miR-21的表達(dá)上調(diào)先于表型的改變。miR-21、miR-221、miR-222及l(fā)et-7a隨著PanIN分級(jí)增高而表達(dá)上調(diào)，其高峰在PanIN2/ 3，此研究提示miR-21具備成為檢測(cè)早期胰腺癌分子標(biāo)志物的潛能。Zhang等[12]利用古抑菌素A(TSA)處理胰腺癌細(xì)胞后，觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在G0/G1 期、細(xì)胞凋亡率增加、胰腺癌細(xì)胞中miR-21表達(dá)下調(diào)，該研究表明組蛋白去乙酰化酶抑制劑也可以通過(guò)調(diào)控miR-21發(fā)揮治療胰腺癌的作用。miR-21在胰腺癌中的差異性表達(dá)肯定了它在胰腺癌診斷、治療及預(yù)后中的重要作用，但是其具體作用機(jī)制尚不明確。miR-21可以作用于靶基因，而靶基因又可以調(diào)節(jié)miR-21的表達(dá)，所以miR-21不會(huì)是點(diǎn)對(duì)點(diǎn)式的在腫瘤的進(jìn)展中起作用，而是在腫瘤細(xì)胞中形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，進(jìn)一步闡明miR-21在胰腺癌中的作用及機(jī)制將為胰腺癌臨床診療提供更優(yōu)化的措施。

3外周血miR-21檢測(cè)在胰腺癌診斷、治療及預(yù)后評(píng)估中的意義

3.1外周血miRNA的表達(dá)及檢測(cè)方法

外周血miRNA可能來(lái)源于凋亡壞死腫瘤細(xì)胞、血細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的裂解等。最新研究顯示血清miRNA可能來(lái)自組織細(xì)胞的主動(dòng)分泌過(guò)程，成熟的miRNA在細(xì)胞內(nèi)被脂蛋白包被成外切酶體分泌至細(xì)胞外，最終到達(dá)血液。由于大多數(shù)miRNA是由細(xì)胞分泌的，組織細(xì)胞中miRNA與循環(huán)miRNA必然有一定的聯(lián)系。研究結(jié)果表明miRNA在組織和體液中具有相同的改變趨勢(shì)[13]。但胰腺腫瘤組織檢測(cè)技術(shù)難度高，對(duì)機(jī)體創(chuàng)傷大，在獲取組織或者細(xì)胞的過(guò)程中也容易受到周?chē)M織或細(xì)胞的污染，從而降低有效診斷率。實(shí)驗(yàn)表明外周血中RNA在室溫下過(guò)夜、反復(fù)凍存、解凍、煮沸、過(guò)酸或過(guò)堿等惡劣情況下可以維持穩(wěn)定，進(jìn)一步證實(shí)了循環(huán)miRNA替代組織活檢而成為新型生化指標(biāo)的可能。

目前檢測(cè)miRNA的方法有克隆測(cè)序、Northern印記雜交、原位雜交、基因芯片、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)等[14]。其中應(yīng)用最廣泛的是qRT-PCR技術(shù)，能區(qū)分miRNA前體和成熟體，只定量具有生物活性的成熟miRNA，可精確區(qū)分同一家族中序列高度同源的miRNA，能檢測(cè)只有一個(gè)堿基差別的不同miRNAs表達(dá)水平，靈敏度和特異度高，樣品消耗量少，只需要l-l0ngRNA即能檢測(cè)出低豐度靶miRNA，定量線(xiàn)性范圍寬，有著在臨床檢測(cè)領(lǐng)域大規(guī)模推廣的潛力。

3.2外周血中miR-21檢測(cè)在胰腺癌診斷、治療及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值

Kong[15]和Que等[16]研究證實(shí)外周血miR-21可以將胰腺癌患者與健康對(duì)照者相鑒別。krha等[17]在對(duì)胰腺癌合并糖尿病患者血清腫瘤標(biāo)志物的研究中發(fā)現(xiàn)miR-21可作為胰腺癌診斷的新型生化指標(biāo)，但對(duì)于新發(fā)無(wú)癥狀的胰腺癌合并糖尿病患者中miR-21對(duì)疾病的預(yù)后價(jià)值尚需進(jìn)行深入研究。Ali等[18]選取50例胰腺癌患者血漿行miRNA分析，發(fā)現(xiàn)miR-21的表達(dá)顯著升高，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)化療耐藥的胰腺癌細(xì)胞株中，miR-21明顯高表達(dá)，與血漿中miR-21結(jié)果一致，提示血漿miR-21表達(dá)水平可作為腫瘤侵襲的潛在生物指標(biāo)，有望用于高危患者的篩查以及胰腺癌化學(xué)治療新的靶點(diǎn)。

Hwang[19]和Frampton等[20]研究證實(shí)miR-21高表達(dá)的胰腺癌患者預(yù)后更差，可能與吉西他濱的耐藥性有關(guān)，高表達(dá)miR-21的患者術(shù)后生存率明顯降低。Bhatti[21]和Liu等[22]發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者血清中miR-21為高表達(dá)，并且其水平與疾病分期有關(guān)，可有效區(qū)分胰腺癌的不同階段，并且具有較高的靈敏性和特異性。Abue等[23]應(yīng)用定量RT-PCR方法檢測(cè)32例PDAC患者、12例胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液瘤(intraductalpapillarymucinousneoplasm,IPMN)患者及30位健康對(duì)照者血漿樣本中miR-21和miR-483-3p表達(dá)水平。結(jié)果顯示PDAC患者血漿中miR-21和miR-483-3p水平相對(duì)健康對(duì)照組顯著升高(P<0.01)。血漿miR-21水平與PDAC患者疾病分期(P<0.05)、肝臟及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)和短生存期(P<0.01)密切相關(guān)，因而血漿miR-21水平具有預(yù)測(cè)PDAC預(yù)后的潛能。Ren等[24]在對(duì)1例胰腺癌肝臟及胸腔轉(zhuǎn)移合并胸腔積液的診治中，檢測(cè)患者血漿miR-21水平為正常人群的8.3倍，并認(rèn)為胰腺癌患者血漿miR-21水平升高是提示肝臟轉(zhuǎn)移的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)血漿miR-21水平和CA19-9對(duì)診斷胰腺癌具有重要臨床價(jià)值。

3.3外周血中miR-21與胰腺癌化學(xué)治療藥物敏感性/耐藥性評(píng)估

目前，已研發(fā)的腫瘤化療藥物在肺癌、乳腺癌、胃癌等實(shí)體腫瘤的臨床研究中顯示出明確的療效，而對(duì)胰腺癌患者療效卻受到限制，這與胰腺癌細(xì)胞對(duì)相關(guān)化學(xué)治療藥物耐藥性增強(qiáng)密不可分。因此，明確胰腺癌化療耐藥機(jī)制、尋找耐藥相關(guān)基因作為指導(dǎo)個(gè)體化治療的標(biāo)記物和潛在治療靶點(diǎn)是扭轉(zhuǎn)化療耐藥、提高治療效果并改善胰腺癌預(yù)后的關(guān)鍵，多項(xiàng)研究顯示外周血miR-21水平與胰腺癌化學(xué)治療藥物敏感性/耐藥性密切相關(guān)。

Park等[9]應(yīng)用反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotides,ASO)治療胰腺癌并觀察miR-21和miR-221的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)miR-21及miR-221的ASO干預(yù)能增加腫瘤細(xì)胞化療敏感性。Hwang[19]和Song等[25]在臨床中發(fā)現(xiàn)低表達(dá)miR-21的患者對(duì)吉西他濱化療更加敏感，而進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染抗miR-21可以增加腫瘤組織對(duì)化療藥物的敏感度。Wang等[26]選擇177例以吉西他濱為主的胰腺癌化療患者的血清miR-21進(jìn)行研究，證明血清miR-21高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展快、腫瘤進(jìn)展時(shí)間短和總生存期短相關(guān)，血清miR-21水平是預(yù)測(cè)胰腺癌進(jìn)程和總生存期的獨(dú)立因素。功能分析提示吉西他濱化療降低了miR-21的表達(dá)水平，上調(diào)了Fas配體(FasLigand，F(xiàn)asL) 的表達(dá)，吉西他濱化療后FasL的表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)了胰腺癌細(xì)胞凋亡，而miR-21可保護(hù)胰腺癌細(xì)胞免受吉西他濱化療誘導(dǎo)的凋亡，且FasL是miR-21的直接靶標(biāo)，研究表明血清miR-21水平可以預(yù)測(cè)進(jìn)展期胰腺癌的化療療效并發(fā)現(xiàn)了miR-21作用于FasL/Fas途徑介導(dǎo)的化療耐藥新機(jī)制。Passadouro等[27]研究證實(shí)小劑量化療藥物舒尼替尼聯(lián)合miR-21沉默可以大幅增加抗腫瘤療效，對(duì)于PDAC的治療具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

3.4外周血miR-21與其他生化指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)

將一種或多種外周血miRNA與其他類(lèi)型腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，可有望顯著提高診斷的準(zhǔn)確性。Kong等[15]檢測(cè)49例PDAC患者和36例正常人外周血標(biāo)本中miR-21、miR-210、miR-155和miR-196a作為PDAC血清標(biāo)志物的可能性，發(fā)現(xiàn)此4種miRNA在PDAC患者血漿中含量明顯增多，單獨(dú)作為診斷標(biāo)志物的診斷效能分別為0.62、0.65、0.67和0.69，并且4種miRNA聯(lián)合診斷的效能為0.82，敏感性和特異性分別為64%和89%，提示多個(gè)miRNA聯(lián)合診斷比單個(gè)miRNA的診斷效能明顯提高。最新研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)血清中7種miRNAs(miR-20a、miR-21、miR-24、miR-25、miR-99a、miR-185及miR-191)鑒別胰腺癌患者和健康對(duì)照者的準(zhǔn)確率為86.8 %，明顯高于CA19-9(76.0 %)和CEA(55.8 %)；對(duì)懷疑為胰腺癌的55例患者的血清中的7種miRNA進(jìn)行檢測(cè)與病理診斷后的準(zhǔn)確性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合這7種miRNA作為標(biāo)志物檢測(cè)準(zhǔn)確率可達(dá)83.6 %(26例I期胰腺癌患者聯(lián)合診斷率為96.2%，48例II期胰腺癌患者聯(lián)合診斷率91.7%)，而CA19-9和CEA的準(zhǔn)確性分別為56.4%和36.4%[28]。

4結(jié)語(yǔ)及展望

外周血與組織中多種miRNAs在胰腺癌中均有異常表達(dá)，并且其水平隨著胰腺癌病情進(jìn)展而相應(yīng)改變。研究表明外周血與組織中miR-21水平可作為胰腺癌診斷、病情進(jìn)展、化療藥物敏感性/耐藥性預(yù)測(cè)及預(yù)后評(píng)估的新型生化指標(biāo)，并有望為胰腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

近年來(lái)，針對(duì)miRNA的研究已成為國(guó)際上熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容之一，對(duì)外周血與組織中miRNA的研究也逐漸開(kāi)展，但目前miRNA的臨床相關(guān)研究還缺乏大樣本、多中心的數(shù)據(jù)論證，缺乏統(tǒng)一的檢測(cè)方法及嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。由于miRNA作用的多重性，使有關(guān)外周血與組織中miRNA的研究方向得以不斷擴(kuò)展。但其特異性作用機(jī)制等尚需進(jìn)一步探討，以期早日應(yīng)用于臨床。隨著研究?jī)?nèi)容不斷深入，外周血miRNAs檢測(cè)將在胰腺癌的早期診斷、鑒別診斷、化學(xué)治療效果及預(yù)后判斷等諸多方面展現(xiàn)出更為廣泛的應(yīng)用價(jià)值，并且對(duì)胰腺癌的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估起到推動(dòng)作用。

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*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)06-1038-05

(收稿日期：2015-11-24)