支氣管哮喘患者Th17和Th9細(xì)胞及其細(xì)胞因子的表達(dá)及臨床意義

李　志，楊婷婷，李文哲，王　波，薛邦祿

(1.大連市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 大連116033；2.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連116044)

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支氣管哮喘患者Th17和Th9細(xì)胞及其細(xì)胞因子的表達(dá)及臨床意義

李志1，楊婷婷1，李文哲2，王波1，薛邦祿1

(1.大連市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 大連116033；2.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連116044)

摘要：目的測定支氣管哮喘(Bronchial asthma)患者體內(nèi)輔助性T細(xì)胞(Th )17和Th9細(xì)胞及其細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)17和IL-9的水平，探討兩種細(xì)胞的表達(dá)與哮喘的發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系。方法采用流式細(xì)胞術(shù)(Flow CytoMetry，F(xiàn)CM)檢測患病組和對照組外周血中Th17和Th9細(xì)胞的比例；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中IL-17和IL-9的的含量。測得數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果與對照組相比，哮喘組患者外周血中Th17 和Th9細(xì)胞表達(dá)比例及IL-17和IL-9的濃度顯著升高(P<0.05)。結(jié)論Th17和Th9細(xì)胞的變化可能在哮喘發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用

關(guān)鍵詞：支氣管哮喘；輔助性T細(xì)胞17；輔助性T細(xì)胞9；IL-17；IL-9

(Chin J Lab Diagn,2016,20:0949)

支氣管哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴T細(xì)胞和肥大細(xì)胞等多種細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥，而CD4+T淋巴細(xì)胞在哮喘氣道炎癥中扮演重要的角色。目前研究顯示T淋巴細(xì)胞亞型Th17和Th9細(xì)胞均被證實(shí)與哮喘的發(fā)病有一定的關(guān)系，本研究通過檢測哮喘患者外周血Th17、Th9細(xì)胞與其相關(guān)細(xì)胞因子IL-17和IL-9等的表達(dá)水平，探討Th17與Th9細(xì)胞在哮喘發(fā)病中的意義。

1材料與方法

1.1標(biāo)本采集

選取患者組為2013年11月至2014年5月本院門診和入院就醫(yī)的哮喘患者32例，哮喘的診斷符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組制訂的《 支氣管哮喘防治指南》 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，其中男18例，女14例，年齡21-55歲，平均(33.2±10.4)且一個(gè)月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑。另選15例健康體檢者作為對照組，兩組在年齡、性別等一般臨床資料方面無顯著性差異(P>0.05)。

1.2主要試劑

異硫氰酸熒光素標(biāo)記-抗人CD4單克隆抗體(FITC-CD4)、固定破膜劑IntraPrepTM購自美國Beckman公司；藻紅蛋白標(biāo)記-抗人IL-17單克隆抗體(PE-IL-17)、PE-IL-9及同型對照購自美國eBioscience公司；刺激劑PMA、離子霉素Ionomycin、莫能霉素monensin購自美國Sigma公司；IL-17 、IL-9的ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

1.3標(biāo)本采集和處理

受檢者清晨空腹采血于肝素抗凝管中，其中一份密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs)；另一份離心保留血清用于ELISA試驗(yàn)檢測細(xì)胞因子。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1Th17細(xì)胞和Th9細(xì)胞的流式檢測

用PBS溶液重懸分離好的外周血單核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1-2×106cells/ml，加入熒光素標(biāo)記-CD4單抗，避光孵育20min，PBS洗滌后加入RPM1640培養(yǎng)體系(含刺激劑PMA50ng/ml、離子霉素1μg/ml、牛血清等)，放入37°溫箱孵育18-20小時(shí)。孵育后的細(xì)胞進(jìn)行固定破膜(按照說明書進(jìn)行操作)，PBS洗滌后將細(xì)胞平均分成四份，分別加入PE-IL-17單抗、PE-IL-9單抗及同型對照，避光孵育30min，洗滌后應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.4.2ELISA檢測血清中IL-17和IL-9的含量

對于IL-17和IL-9的測定要嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.5數(shù)據(jù)處理

用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間數(shù)據(jù)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1支氣管哮喘患者外周血Th17和Th9細(xì)胞的表達(dá)

與對照組相比，哮喘組患者外周血中Th17 和Th9細(xì)胞表達(dá)比例顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　　　　哮喘組與對照組患者外周血中Th17、Th9細(xì)胞

注：與對照組相比，*P<0.05

2.2支氣管哮喘患者外周血IL-17、IL-9的表達(dá)水平

與對照組相比，哮喘組患者血清中IL-17和IL-9的濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2　哮喘組與對照組血清中IL-17和IL-9的濃度

注：與對照組相比，*P<0.05

3討論

支氣管哮喘是一種病因尚未明確的氣道慢性炎癥，由多種致炎細(xì)胞參與如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等，而CD4+T淋巴細(xì)胞在哮喘氣道炎癥中發(fā)揮重要的作用。

傳統(tǒng)認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞及細(xì)胞因子(IL-9)在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著重要的致病作用，Douwes[2]等發(fā)現(xiàn)約有一半的哮喘患者并未表現(xiàn)出Th2途徑的應(yīng)答特征，而且嗜酸粒細(xì)胞也沒有明顯升高，而另一半的哮喘患者的肺組織則以中性粒細(xì)胞浸潤為主，因此認(rèn)為IL-17具有強(qiáng)大的募集中性粒細(xì)胞的功能，其在哮喘發(fā)病中的作用也被廣泛研究。然而，有學(xué)者提出Th17細(xì)胞本身并不能引起嗜酸性粒細(xì)胞性氣道炎癥，但卻能增強(qiáng)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的嗜酸性氣道炎癥[3]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)哮喘患者體內(nèi)的Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-17的分泌顯著升高，與劉[4]等的研究結(jié)果相一致。Zhao等研究證實(shí)重癥哮喘患者體內(nèi)Th17細(xì)胞的表達(dá)及細(xì)胞因子IL-17、IL-22的水平顯著的高于輕度和中度患者，說明Th17的水平和功能與哮喘的嚴(yán)重程度成正相關(guān)[5]，尤其是急性或重度哮喘患者的急性發(fā)作期和嚴(yán)重的氣喘患者。

有學(xué)者指出Th17細(xì)胞分泌的IL-17可通過直接誘導(dǎo)IL-8的產(chǎn)生或者間接誘導(dǎo)粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和CXC趨化因子配體8(CXCL-8)來募集和活化中性粒細(xì)胞[6]。也有學(xué)者認(rèn)為IL-17與受體結(jié)合后,主要通過活化MAP激酶,激活NF-κB的活性從而發(fā)揮IL-17的生物學(xué)活性，IL-17能作用于氣道上皮、肺成纖維細(xì)胞和其他的炎癥細(xì)胞從而引起促炎細(xì)胞因子、化學(xué)介質(zhì)和金屬基質(zhì)蛋白酶的產(chǎn)生進(jìn)而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)組織炎癥[7]。

過去人們一直認(rèn)為IL-9屬于Th2類細(xì)胞因子,可作用于多種炎癥細(xì)胞和組織細(xì)胞,在哮喘中發(fā)揮著重要的作用[8]，直到以IL-9為主要分泌因子的Th9細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)，Th9細(xì)胞及IL-9在哮喘發(fā)病中的作用才被廣泛研究。哮喘患者支氣管活檢發(fā)現(xiàn)IL-9mRNA明顯增高[9],在哮喘患者接觸過敏原后，其肺泡灌洗液BAL中IL-9及IL-9mRNA的水平較正常對照組明顯增加[10]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)將Th9和Th2細(xì)胞分別過繼到Rag2-/-小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)兩者均可導(dǎo)致小鼠的哮喘癥狀的發(fā)生，但是Th9引發(fā)的哮喘比Th2的癥狀更嚴(yán)重，說明Th9細(xì)胞能夠引發(fā)氣道高反應(yīng)性，嗜酸粒細(xì)胞增多，粘液分泌增多等[8,11]。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IL-4能介導(dǎo)B細(xì)胞分化產(chǎn)生IgE，而IL-9能夠促進(jìn)此過程，且IL-9能夠促發(fā)T細(xì)胞和肥大細(xì)胞的增殖，進(jìn)而加重過敏炎癥反應(yīng)[12]；不僅如此，IL-9可以促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的成熟、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的表達(dá)及支氣管上皮細(xì)胞T細(xì)胞的分化成熟。此外，IL-9還可以作用于平滑肌細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞等組織細(xì)胞,促進(jìn)分泌促炎因子并出現(xiàn)大量的杯狀細(xì)胞,分泌大量的黏液,在氣道高反應(yīng)性的發(fā)生發(fā)展中起了一定的作用[13]。

各種免疫細(xì)胞在微環(huán)境中能發(fā)揮著各自的功能維持免疫穩(wěn)態(tài)，Th17與Th9細(xì)胞既相互共生又相互抑制，并且與其分泌的細(xì)胞因子在哮喘疾病病程中發(fā)揮重要作用。但是兩種細(xì)胞之間存在怎么樣的聯(lián)系與哮喘的發(fā)生究竟有怎樣的關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組.支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義，診斷，治療管理方案)[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2008,31(3):177.

[2]DouwesJ,GibsonP,PekkanenJ,etal.Non-eosinophilicasthma:importanceandpossiblemechanisms[J].Thorax,2002,57(7):643-648.

[3]HiroshiN,KoichiH.RoleofIL-23andTh17CellsinAirwayInflammationinAsthma[J].ImmuneNetwork,2010,10(1):1.

[4]劉澤宇,夏書月,王冉.哮喘患者外周血Th17細(xì)胞水平及功能的研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2013，42(31):3766.

[5]YangZhao,JiongYang,Ya-dongGao,etal.Th17ImmunityinPatientswithAllergicAsthma[J].IntArchAllergyImmunol,2010,151(4):297.

[6]CosmiL,LiottaF,MaggiE,etal.Th17cells:newplayersinasthmapathogenesis[J].Allergy,2011,66(8):989.

[7]VanHamburgJP,AsmawidjajaPS,DavelaarN,etal.Th17cells,butnotTh1cells,frompatientswithearlyrheumatoidarthritisarepotentinducersofmatrixmetalloproteinasesandproinflammatorycytokinesuponsynovialfibroblastinteraction,includingautocrineinterleukin-17Aproduction[J].ArthritisRheum,2011,63(1):73.

[8]李志,楊婷婷,徐維家.Th17和Th9細(xì)胞與支氣管哮喘病理機(jī)制研究的新進(jìn)展[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2013,34(12):1553.

[9]VockC,HauberHP,WegmannM.TheotherThelpercellsinasthmapathogenesis[J].Allergy,2010,doi:10.1155/2010/519298.

[10]YingS,MengQ,KayAB,etal.Elevatedexpressionofinterleukin- 9mRNAinthebronchialmucosaofatopicasthmaticsandallergen-inducedcutaneouslate-phasereaction:relationshipstoeosinophils,mastcellsandTlymphocytes[J].ClinExpAllergy,2002,32(6):866.

[11]StaudtV,BothurE,KleinM,etal.Interferonregulatoryfactor4isessentialforthedevelopmentalprogramofThelper9cells[J].Immunity,2010,33(2):192-202.

[12]XingJC,WuYZ,NiB.Th9:ANewPlayerinAsthmaPathogenesis[J].JournalofAsthma,2011,48(2):115.

[13]田潔,王勝軍,許化溪.Th9細(xì)胞:一種新型效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2009,25(9):853.

基金項(xiàng)目：大連市醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究項(xiàng)目(2012)

文章編號：1007-4287(2016)06-0949-03

中圖分類號：R562.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

作者簡介：李志(1971-)，男，碩士，主任技師，主要從事自身免疫及分子生物學(xué)研究。

(收稿日期：2014-11-28)

ResearchonthepopulationofTh17andTh9cellsandtheexpressionofthecytokinesinbronchialasthmapatients

LI Zhi1,YANG Ting-ting1,LI Wen-zhe2,et al.

(1.Department 0f Clinical Laboratory,Dalian Municipal Central Hospital,Dalian 116033,China;2.School of Basic Medical Sciences,Dalian Medical University,Dalian 116044,China)

Abstract:ObjectiveTo examine the proportion of peripheral of T helper cell 17(Thl7) and Th9 cells and the levels of interleukin 17(IL-17),IL-9 in bronchial asthma patients,and to discuss the role of Th17 and Th9 cells in the pathogenesis of asthma.MethodsFlow cytometric assay was used to analyse the percentages of Th17 and Th9 cells in patients and normal controls.The levels of IL-17 and IL-9 in plasma were measured by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Measured data were analyzed by using the statistical software SPSS19.0.ResultsThe percentages of Th17,Th9 cells and levels of IL-17,IL-9 in patients with asthma were significantly higher than that of normal controls(P<0.05).ConclusionTh17 and Th9 cells may play an important role in the pathogenesis of asthma.

Key words:Bronchial asthma;T helper 17;T helper 9;Interleukin 17;Interleukin 9