大黃聯(lián)合烏司他丁對(duì)百草枯中毒大鼠肺損傷保護(hù)作用

張永成　姜銀松　王占青

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·論著·

大黃聯(lián)合烏司他丁對(duì)百草枯中毒大鼠肺損傷保護(hù)作用

張永成姜銀松王占青

264100濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院急診科

【摘要】目的觀察大黃聯(lián)合烏司他丁對(duì)急性百草枯中毒大鼠肺組織病理變化以及血漿中TNF- α、TGF-β1含量的干預(yù)作用。 方法將72只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組8只、染毒組32只、干預(yù)組32只。染毒組、干預(yù)組分別于第1天、3天、5天、7天分批處死存活大鼠，光鏡下觀察肺組織變化，并測(cè)定血漿TNF- α、TGF-β1的含量。 結(jié)果染毒組大鼠肺組織出現(xiàn)明顯的出血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺實(shí)變等變化；干預(yù)組較染毒組病理?yè)p傷減輕；染毒組、干預(yù)組TNF-α、TGF-β1水平在染毒后1天開始升高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在相同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)組血漿TGF-β1、TNF- α表達(dá)低于染毒組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論大黃聯(lián)合烏司他丁可通過(guò)降低百草枯中毒大鼠血漿TNF-α、TGF-β1水平，發(fā)揮對(duì)百草枯中毒大鼠肺組織的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】百草枯；大黃；烏司他丁；腫瘤壞死因子-α；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

百草枯(paraquat，PQ)中毒具有低致死量、進(jìn)展快、無(wú)特效藥等特點(diǎn)，死亡率極高。肺組織是百草枯中毒最重要的靶器官，國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等細(xì)胞因子參與并推動(dòng)全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是百草枯中毒引發(fā)肺損傷的發(fā)病機(jī)制之一[1]，采用有效途徑抑制炎癥反應(yīng)是減輕中毒癥狀，改善患者生存率的重要舉措。中藥大黃對(duì)多種中毒導(dǎo)致的臟器損傷具有保護(hù)作用，已在臨床得到廣泛的應(yīng)用，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其還有抗炎、排毒、胃腸道修復(fù)等作用[2-4]，同時(shí)資料報(bào)道烏司他丁(ulinastatin，UTI)能夠顯著降低百草枯中毒患者體內(nèi)的炎癥介質(zhì)[5]，本文通過(guò)觀察大黃聯(lián)合烏司他丁對(duì)百草枯灌胃大鼠細(xì)胞因子的干預(yù)作用，初步探討二者對(duì)百草枯中毒大鼠保護(hù)作用的機(jī)制，為臨床應(yīng)用大黃及烏司他丁治療百草枯中毒提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠72只，體質(zhì)量(200±20) g，濱州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，動(dòng)物批號(hào)：SCXK(魯)20140007。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

20%百草枯水劑，購(gòu)自江蘇南通先正達(dá)農(nóng)藥公司；TNF-α試劑盒，批號(hào)：SXR063；TGF-β1試劑盒，批號(hào)：SXR015，美國(guó)R&D公司產(chǎn)品進(jìn)口分裝；生大黃粉(免煎劑型)，購(gòu)自三九醫(yī)藥股份有限公司；烏司他丁，購(gòu)自廣東天普洛安。

1.3儀器

LG16-W型臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自北京醫(yī)用離心機(jī)廠；梅特勒·托利多AX-205DeLta Range電子天平、820Rotary切片機(jī)(美國(guó))均購(gòu)自湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司；Olympus顯微鏡(日本)購(gòu)自上海奧電電子科技有限公司。

1.4造模與分組

實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[6-7]進(jìn)行。72只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組8只、染毒組32只、干預(yù)組32只。染毒組、干預(yù)組分別給予20%百草枯水劑(60 mg/kg，用0.9%生理鹽水稀釋至1 mL)灌胃染毒，對(duì)照組同時(shí)給予1 mL生理鹽水灌胃。干預(yù)組染毒后60分鐘給予生大黃粉300 mg/kg(用溫水浸泡)灌胃，同時(shí)腹腔注射UTI 75 kU/kg。對(duì)照組和染毒組同時(shí)以等量生理鹽水灌胃。

1.5觀測(cè)指標(biāo)

染毒組、對(duì)照組分別于中毒后1天、3天、5天、7天處理存活的大鼠各8只，取下腔靜脈血5 mL，5000 rpm離心5分鐘取上清，-70℃凍存待測(cè)。取大鼠肺組織置于10%的甲醛溶液中固定，HE染色后光學(xué)顯微鏡觀察。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 檢測(cè)血漿TNF-α和TGF-β1水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1各組大鼠肺組織光鏡下的觀察

染毒大鼠中毒后逐漸出現(xiàn)肺毛細(xì)血管擴(kuò)張、水腫，可見大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，部分肺泡塌陷，出現(xiàn)肺不張；中毒后3天部分肺泡融合，明顯肺不張，肺間質(zhì)出血和肺泡出血并存，間質(zhì)增厚；干預(yù)組大鼠肺出血、炎癥細(xì)胞、肺實(shí)變等明顯減輕；對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)及形態(tài)無(wú)明顯變化。見圖1。

2.2各組大鼠血漿TNF-α水平的表達(dá)

同時(shí)間點(diǎn)相比，染毒組、干預(yù)組大鼠TNF-α水平較對(duì)照組升高(P<0.01)，干預(yù)組大鼠TNF-α水平較染毒組明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。見表1。

2.3各組大鼠血漿TGF-β1水平的表達(dá)

中毒組大鼠TGF-β1水平隨著中毒時(shí)間的延長(zhǎng)，在中毒后7天含量最高;同時(shí)間點(diǎn)，染毒組、干預(yù)組大鼠TGF-β1水平較對(duì)照組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同時(shí)間點(diǎn)，干預(yù)組大鼠TGF-β1水平較染毒組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

3討論

由于肺內(nèi)聚胺類的物質(zhì)攝取系統(tǒng)對(duì)百草枯的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)作用，中毒后百草枯大量蓄積在肺組織中，隨著中毒的程度加深，中毒機(jī)體的肺組織出現(xiàn)上皮細(xì)胞增生、肺水腫甚至出血、纖維化等病理?yè)p傷[8]，有研究表明，TNF-α和TGF-β1在肺損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用， TNF-α在百草枯導(dǎo)致的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)中起著啟動(dòng)和放大的作用，并且能夠激活不同的炎癥細(xì)胞，加劇炎癥反應(yīng)對(duì)中毒機(jī)體的打擊；TGF-β1則可通過(guò)與靶細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，開啟細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)[9]，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)肺纖維化的形成，最終引發(fā)呼吸衰竭。此外，隋宏等[10]觀察發(fā)現(xiàn)中毒大鼠血漿內(nèi)的TGF-β1、PDGF、IGF-1等細(xì)胞因子的的含量與染毒劑量相關(guān)。大黃是重要的導(dǎo)瀉劑，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)大黃具有減少毒物的吸收、抑制炎癥因子釋放以及促進(jìn)中毒機(jī)體胃腸功能恢復(fù)等作用，在救治急性農(nóng)藥中毒中有著重要價(jià)值[4]。近年發(fā)現(xiàn)，烏司他丁能有效降低百草枯中毒機(jī)體的多種炎癥因子的水平[11]，并在救治農(nóng)藥中毒的過(guò)程中逐漸得到應(yīng)用。王剛等[12]給予大鼠灌胃百草枯(120 mg/kg)制備急性百草枯中毒模型，2小時(shí)后腹腔注射UTI 75 KU/kg，結(jié)果顯示UTI組給藥后6 小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)等時(shí)間點(diǎn)血清中TNF-α含量均較中毒對(duì)照組明顯降低。

圖1　各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察

組別n第1天第3天第5天第7天對(duì)照組822.28±3.7816.87±4.0221.18±4.9917.58±1.90染毒組32231.21±7.89a435.94±7.52a689.39±8.08a985.29±2.47a干預(yù)組3297.04±3.20ab278.27±3.68ab323.00±3.08ab699.55±4.80ab

注： 與對(duì)照組比較，aP<0.01；與染毒組比較，bP<0.01。

表2　大鼠血漿TGF-β1水平的表達(dá)

注： 與對(duì)照組比較，aP<0.01；與染毒組比較，bP<0.01。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，染毒組大鼠的血漿TGF-β、TNF-α水平較對(duì)照組明顯升高，而且隨著時(shí)間延長(zhǎng)有增加的趨勢(shì)，與以往研究結(jié)果相一致。大黃聯(lián)合烏司他丁干預(yù)后的大鼠血漿內(nèi)TGF-β、TNF-α含量在中毒后1周內(nèi)明顯降低，并且干預(yù)組大鼠肺病理?yè)p傷亦有明顯減輕，說(shuō)明大黃聯(lián)合烏司他丁能夠有效地減輕百草枯中毒導(dǎo)致的肺損傷，其機(jī)制可能與大黃促進(jìn)毒物排泄、減少毒物吸收以及烏司他丁抑制炎癥細(xì)胞反應(yīng)、降低血漿中細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)。

總之，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了大黃聯(lián)合烏司他丁治療方案對(duì)急性期百草枯中毒大鼠的細(xì)胞因子具有干預(yù)作用，但本研究存在樣本較小、時(shí)間較短、未涉及死亡率等不足，后期將對(duì)百草枯中毒機(jī)體死亡率、血漿濃度、基因表達(dá)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面進(jìn)行大樣本深入探討，以期為臨床應(yīng)用大黃、烏司他丁治療百草枯中毒提供更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(本文編輯： 韓虹娟)

The protection effect of Rhubarb combine with Ulinastatin on paraquat poisoning induced lung injury in rats

ZhangYong-cheng，JiangYin-song,WangZhan-qing.

DepartmentofEmergency，theAffiliatedHospitalofBinZhouMedicalCollege，Yantai264100，China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the intervention effect of Rhubarb combine with Ulinastatin on pathological changes of lung tissue and the plasma levels of TNF -α and TGF β1content on paraquat poisoning induced lung injury in rats. Methods72 SD rats were randomly divided into control group(n=8), phosgene group(n=32), intervention group (n=32). The rats in phosgene group and the intervention group were sacrificed at first days, 3 days, 5 days and 7 days. The changes of lung tissue were observed under light microscope, and the determination of the content of plasma TNF-α, TGF-β1. ResultsLung tissue of phosgene group showed significant hemorrhage, inflammatory cell infiltration, pulmonary consolidation and other changes; The lung tissue of intervention group was better than the phosgene group; The level of TNF-α, TGF-β1 was increased on the first day after paraquat intoxication in phosgene group and intervention group, compared with control group, the result had statistical difference(P<0.01); The plasma TGF-β1and TNF-α of intervention group was lower than that of phosgene groups at the same time point, the differences were statistically significant(P<0.01).ConclusionsRhubarb and Ulinastatin can reduce lung injury by decreasing the expression of TNF-α and TGF-β1 on paraquat poisoning induced lung injury in rats.

【Key words】Paraquat；Rhubarb；Ulinastatin；TNF-α；TGF-β1

作者簡(jiǎn)介：張永成(1976- )，本科，主治醫(yī)師。研究方向：急性中毒。E-mail15666056239@163.com

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.07.005

(收稿日期：2015-11-08)