HDAC6和Ac-α-Tub在肺腺癌中表達的臨床病理意義

張暈生 宋旭東

HDAC6和Ac-α-Tub在肺腺癌中表達的臨床病理意義

張暈生 宋旭東

目的 研究組蛋白去乙酰化酶(HDAC)6和乙酰化微管蛋白α(Ac-α-Tub)在非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達及其臨床病理學意義。方法 收集2013-06—2015-06期間在秦皇島市腫瘤醫院手術切除并經臨床病理證實的NSCLC標本52例，以同例患者癌旁肺組織作為對照組。免疫組織化學染色法和免疫印跡法檢測HDAC6和Ac-α-Tub在NSCLC及對照組中的表達，分析其與臨床病理參數(性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、組織學類型、分化程度、淋巴結轉移和臨床病理分期)的關系。結果 在癌旁組中HDAC6陽性表達率為5.77%，顯著低于NSCLC組的76.92%，且NSCLC組HDAC6蛋白表達水平為對照組的6倍，而Ac-α-Tub在NSCLC組織中和陽性表達率顯著低于癌旁組，其在NSCLC組織中的表達水平為癌旁的31.03%，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。NSCLC組中HDAC6的陽性表達與分化程度、臨床分期和淋巴結轉移關系密切；Ac-α-Tub的陽性表達與分化程度和淋巴結轉移關系密切。且HDAC6在NSCLC組中的表達與Ac-α-Tub的表達呈負相關。結論HDAC6在NSCLC中高表達，而α-Ac-Tub蛋白表達下調，與腫瘤的侵襲和轉移關系密切，二者可能在NSCLC的發生、發展中起到了關鍵的調節作用。

肺癌；組蛋白去乙酰化酶；乙酰化微管蛋白

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常見的惡性腫瘤，其發病率和死亡率居惡性腫瘤的第一位，然而70%以上患者確診時已經失去了手術機會，即使輔以放、化療等多種綜合治療手段，仍然不能顯著提高肺癌的生存率[1]。因此，尋找NSCLC早期診斷標志物及靶向治療位點一直是腫瘤研究領域的難點和熱點問題。

作為Ⅱb類組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDAC)的代表，HDAC6與腫瘤發生、發展關系密切。有研究顯示，HDAC6的缺失表達能夠促進順鉑誘導的NSCLC細胞DNA損傷和凋亡，減少裸鼠體內移植瘤的體積，而高表達HDAC6則增加了瘤體對順鉑的耐藥性[2]。在其他腫瘤中也發現，HDAC6與微管蛋白 (tubulin，Tub)的去乙酰化(acetylation，Ac)、泛素化失衡和氧化應激關系密切，在卵巢癌、乳腺癌和食管癌、胃癌的發生發展中起到了重要的調控作用[3-4]。因此，本研究擬通過分析HDAC6和Ac-α-Tub在NSCLC中的表達及其臨床病理學意義，探討HDAC6對NSCLC的影響，為NSCLC基因治療中靶點的選擇提供一定的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2013-06—2015-06期間在秦皇島市第四醫院(腫瘤醫院)手術切除并經臨床病理證實的NSCLC標本52例。所有患者臨床資料完整，均為肺癌原發病灶，無其他腫瘤病史；術前均未接受放、化療治療；無肝炎、肝硬化、自身免疫性疾病或其他嚴重的基礎疾病。以腫瘤組織石蠟標本作為實驗組，并挑選同例患者的癌旁肺組織石蠟標本作為對照組(距離腫瘤＞5 cm，鏡下無癌細胞浸潤及轉移)，所有標本采用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm切片，由病理科診斷、存檔并提供。

1.2 實驗試劑 HDAC6(ab1440)購置于美國abcam公司；Ac-α-Tub(sc-23950)購置于美國santa cruz公司；免疫組化試劑盒(PV-6000)、DAB顯色液(ZLI-9018)購置于北京中杉金橋生物技術有限公司；免疫印跡二抗(074-1506/074-1806)購置于英國KPL公司。

1.3 免疫組化法檢測HDAC6和Ac-α-Tub在肺癌和癌旁組織中的定位和表達 按照北京中杉PV6000免疫組化試劑盒說明書進行，石蠟切片常規脫蠟至水，高壓修復及H2O2去除內源性過氧化物酶后，加一抗(1∶200稀釋)4℃過夜，次日滴加二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明中性樹膠封片。高倍視野下隨機選取5個視野，每個視野計數100個腫瘤細胞，計算陽性細胞百分比，按照以下4級進行計分，0分：陽性細胞數＜10%；1分：10%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：>75%。染色強度評分標準：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕色或棕褐色3分。以兩者乘積作為陽性評判標準，其中4分以上定義為陽性。采用PBS替代一抗作為陰性對照。

1.4 Western blot法檢測HDAC6和Ac-α-Tub在肺癌和癌旁組織中的表達 常規提取組織蛋白，經考馬斯亮藍法測定蛋白濃度后上樣(20 μg/泳道)，常規電泳和電轉。孵育一抗(1∶500)4℃過夜，二抗(1∶5 000)37℃ 1 h后，ECL發光顯色，采用Image-Lab 5.1軟件定量分析條帶。

1.5 統計學處理 用Excel建庫，SPSS 13.0進行統計分析。定性資料比較采用χ2檢驗，定量資料采用方差分析，相關性分析采用Spearman相關系數法，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HDAC6和Ac-α-Tub在NSCLC中的表達 免疫組化結果顯示，在肺癌組織中HDAC6陽性表達于腫瘤細胞，主要定位于細胞漿，偶見孤立的單個腫瘤細胞核內陽性表達。其在腫瘤組織中的陽性表達率為76.92%(40/52)，而在癌旁組織中陽性表達率為5.77%(3/52)，兩者相比差異具有統計學意義(表1，圖1)。而無論在癌旁組還是在腫瘤樣本中，部分支氣管上皮細胞可見陽性表達，不計為陽性結果。Ac-α-Tub在腺癌和癌旁組織均強表達于支氣管上皮細胞。且在癌旁肺組織中，還可表達于多種細胞類型，包括肺泡上皮細胞、內皮細胞和間質成纖維細胞，在癌旁組織其陽性表達率為80.77%；而在癌組織中其陽性表達率為26.92%，兩者相比差異具有統計學意義(χ2＝30.333，P＝0.000，表2，圖2)。免疫印跡法檢測結果顯示，在52例NSCLC臨床樣本中，HDAC6的表達量為對照組的6倍，而Ac-α-Tub表達為對照組的31.03%(表3，圖3)。

表1 HDAC6在對照組及NSCLC組中的表達

圖1 HDAC6在NSCLC中的陽性表達

表2 Ac-α-Tub在對照組及NSCLC組中的表達

圖2 Ac-α-Tub在NSCLC中的弱陽性表達

表3 HDAC6和Ac-α-Tub在對照組和NSCLC組蛋白表達量(免疫印跡法，±s)

表3 HDAC6和Ac-α-Tub在對照組和NSCLC組蛋白表達量(免疫印跡法，±s)

組別 HDAC6 Ac-α-Tub對照組 0.02±0.02 0.29±0.07 NSCLC組 0.12±0.01 0.09±0.08t8.004 4.634P0.000 0.001

圖3 HDAC6和Ac-α-Tub在對照組和肺癌組蛋白水平的表達(免疫印跡法)

2.2 HDAC6和Ac-α-Tub在NSCLC中表達與臨床病理特征的關系 χ2檢驗結果顯示，HDAC6在NSCLC中陽性表達情況與性別、年齡、吸煙史、瘤體大小、腫瘤類型無關，而在分化程度、淋巴結轉移和病理分期方面有統計學意義，兩組相比差異有統計學意義(P＜0.05)。而Ac-α-Tub在NSCLC中的陽性表達與分化程度和淋巴結轉移有關(P＜0.05)，而在性別、年齡、吸煙史、瘤體大小、腫瘤類型和病理分期方面差異無統計學意義(表4)。在52例NSCLC臨床樣本中，HDAC6與Ac-α-Tub陽性共表達4例，二者在NSCLC中呈負相關(r＝－0.697，P＝0.000)。

表4 HDAC6和Ac-α-Tub在NSCLC中表達的臨床病理意義

3 討論

中國三次惡性腫瘤抽樣回顧性調查數據顯示，肺癌死亡率逐年攀升，由20世紀70年代的第4位上升至現在的第1位[5]。

近些年研究發現，HDAC6在多種實體瘤中高表達，且對腫瘤的發生、發展發揮雙向調控作用，其差異取決于HDAC6在細胞中的定位。在乳腺癌臨床樣本中發現，HDAC6在一些較為正常的上皮細胞呈胞核表達，而在大部分腫瘤細胞中呈胞漿表達[6]。本研究也發現52例NSCLC患者樣本中，76.92%患者腫瘤細胞胞漿陽性表達HDAC6，偶見細胞核表達。HDAC6在核內能夠去乙酰化NF-κB的p65亞基，減少其與基質金屬蛋白酶(matrix metallo preteinases，MMP)2啟動子的結合，導致MMP2表達下調，因此影響腫瘤細胞的侵襲能力。體外研究也發現，胞漿內過表達HDAC6能夠顯著促進A549和H661細胞的侵襲和遷移，然而在核內表達的HDAC6則反過來能夠抑制細胞侵襲(對遷移無明顯的抑制作用)[7]。這說明，HDAC6在多數研究認為，其在核中表達多提示預后良好，而在胞漿中陽性表達則能夠促進腫瘤的發生、發展。由于胞核內HDAC6陽性表達較少，且在同一樣本中多以胞漿陽性表達為主，因此本研究并未進一步探討HDAC6在細胞漿/核中的差異表達與臨床病理之間的關系。發現HDAC6陽性表達率與NSCLC分化程度、臨床分期和淋巴結轉移關系密切。

微管蛋白α(α-Tub)是細胞骨架蛋白之一，廣泛參與維持細胞結構和功能的穩定。有研究報道了α-Tub與乳腺癌、胃癌、直腸癌和前列腺癌中高表達與腫瘤的侵襲、轉移關系密切，且微管動力學的破壞和異常有絲分裂能夠導致紫杉醇耐藥，同時微管的異常也能導致細胞間信息傳遞異常，引起黏附能力下降，而侵襲性偽足與微管的伸長有關[3-4]。諸多研究顯示，HDAC6能夠通過對α-Tub乙酰化的調節，影響腫瘤細胞的增殖和遷移。在轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1誘導的肺泡Ⅱ型上皮A549細胞[8]和人肺成纖維細胞中均發現HDAC6表達上調和Ac-α-Tub表達下調，并伴隨上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)能夠誘導促進Ac-α-Tub去乙酰化，從而誘導EMT的形成[9-10]。從α-Tub的乙酰化修飾來講，HDAC6抑制劑已經被證明是治療腫瘤的一個新的靶點。本研究結果顯示，Ac-α-Tub主要陽性表達于癌旁組織，而在癌組織中多缺失表達，Ac-α-Tub與HDAC6的表達呈負相關，其缺失表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移相關(P＜0.05)。提示α-Ac-Tub在NSCLC中的缺失表達可能在肺癌的發生、發展具有一定的調節作用，其表達缺失可能與HDAC6的負調控有關，具體機制仍待進一步研究和探討。

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Objective To study the expression of HDAC6 and Ac-α-Tub and the clinic pathological significance in non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods 52 cases confirmed with NSCLC with clinic pathology after surgical resection at Qinhuangdao Tumor Hospital from June 2013 to June 2016 were collected for samples，and adjacent cancer lung tissues of the same sufferers were taken as control group.Immunohistochemical staining and immunoblotting were adopted to detect HDAC6 and Ac-α-Tub expression in NSCLC group and control group and its relationship with clinicopathological parameters(sex，age，smoking history，tumor size，histological type，differentiated degree，lymphatic metastasis and clinicopathological stage)was analyzed.Results The positive expression rate of HDAC6 in adjacent cancer group was 5.77%，lower than 76.92%in NSCLC group，and HDAC6 protein expression level in NSCLC group was six times of that in adjacent cancer group，while Ac-α-Tub and its positive expression rate in NSCLC group were clearly lower than those in adjacent cancer group，among which the positive expression rate in NSCLC group was 31.03%of that in adjacent cancer group，with differences of statistical significance(P＜0.05).The HDAC6 positive expression in NSCLC group was closely related to differentiated degree，clinical stages，and lymphatic metastasis.The Ac-α-Tub positive expression was closely related to differentiated degree and lymphatic metastasis.The HDAC6 expression in NSCLC group was negatively related to Ac-α-Tub expression.Conclusion The high HDAC6 expression in NSCLC group and down-regulated expression of α-Ac-Tub protein were closely related to tumor invasion and metastasis，both can have critical regulating effects in the occurrence and development of NSCLC.

Lung cancer；HDAC；Acetylated tubulin

2016-05-20)

1005-619X(2016)09-0903-04

10.13517/j.cnki.ccm.2016.09.003

063000 華北理工大學基礎醫學院