保存條件對提取全血基因組DNA質量的影響

呂曉巖 楊志崗（中國醫學科學院北京協和醫學院整形外科醫院研究中心，北京 100144）

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保存條件對提取全血基因組DNA質量的影響

呂曉巖 楊志崗
（中國醫學科學院北京協和醫學院整形外科醫院研究中心，北京 100144）

【摘要】目的 比較從新鮮和凍存全血中提取基因組DNA的效果。方法 分別取300 μL抗凝新鮮和-75 ℃凍存3個月的血樣，用全血基因組DNA提取試劑盒抽提基因組DNA，通過紫外分光光度計、電泳、PCR進行檢測。結果 抗凝新鮮和凍存血樣提取的基因組DNA總量分為：（16.62±12.12）μg和（7.94±4.18）μg；純度分別為（1.85±0.01）和（1.84±0.02）。結論 新鮮血樣提取的基因組DNA總量要高于凍存血樣差異顯著，純度無顯著差別，低溫冷凍保存使提取全血基因組DNA的產量降低。

【關鍵詞】全血；基因組DNA；外周血

目前醫學上很多疾病的研究發展到了基因水平上。而對于基因水平的研究首先就是要從患者或對照的外周血中提取基因組DNA［1］。然而采集大量標本時往往很難在短時間內立即提取DNA，這種情況下就會涉及到標本的保存。本實驗將同一抗凝全血分成新鮮組和凍存組，并對兩組提取基因組DNA的總量和純度進行比較，探討低溫冷凍條件對全血DNA提取效率的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑：NanoDrop 2000c超微量紫外分光光度計（美國），UVP凝膠成像系統（美國），高速離心機（日本），PCR儀（德國），漩渦混合器（國產）；promega公司全血基因組DNA提取試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 樣品：人外周血10份，枸櫞酸鈉抗凝，2000 r/min離心10 min，分離血漿和血細胞。血細胞分成兩份每份300 μL/份，一份立即提取，一份-75 ℃凍存2個月后提取。

1.2.2 DNA提取：①將300 μL抗凝血置于1.5 mL離心管中，加900 μL Cell Lysis Solution，混合，上下顛倒數次，室溫靜置10分鐘，13000-16000 ×g/min離心20 s，棄上清。②沉淀中加300μL Nuclei lysis Solution充分震蕩裂解成懸液，再加入100μL Protein Precipitation Solution 漩渦震蕩20 s，（13000～16000）×g/min離心3 min，吸取上清轉移到一個干凈1.5 mL離心管中，加300 μL異丙醇沉淀DNA。③100 μL 70%乙醇洗滌沉淀，（13000～16000）×g/min離心1 min，兩次，棄上清，待干，TE溶解DNA。

1.2.3 DNA含量和純度檢測：各取2 μL兩組提取的基因組DNA樣本，紫外分光光度計測定基因組DNA的含量及A260/A280的比值［2］。

1.2.4 體外PCR擴增：用管家基因GAPDH進行擴增。上游引物：5’-GCACCGTCAAGGCTG

AGAAC-3’，下游引物：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，反應體系20 μL，DNA含量200 ng；反應條件：94 ℃預變性1 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環。

1.2.5 統計學分析：應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，組間比較t檢驗，結果以均值±標準差表示，P＜0.05有統計學意義。

2 結 果

2.1 基因組DNA總量和純度比較結果：見表1。

表1 兩組提取的基因組DNA各項指標比較（n=10）

對兩組血樣標本提取的DNA總量和純度進行比較，經統計學分析，新鮮組提取的DNA總量高于凍存組有統計學意義P＜0.05；兩組提取的DNA純度差異無統計學意義P＞0.05。

2.2 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳：兩組DNA擴增內參基因GAPDH，1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，40 min，用凝膠成像系統觀察結果，兩組均可見與預期大小一致的目的條帶，可以達到分子生物學試驗的要求。見圖1～2。

3 討 論

一些疾病可以通過對DNA的分析進行診斷，從全血中提取基因組DNA是多種分子生物學實驗的第一步［3］。基因組DNA的產量取決于白細胞的數量。血液中只有白細胞含有DNA，是基因組DNA提取的常用實驗材料，而白細胞數成人正常值在（4～10）×109/L，相對一些小兒患者血液中的DNA量會比較少。因此如何快速、經濟的獲得高品質的基因組DNA具有十分重要的意義。影響DNA產量和純度的原因有很多，不同的提取方法提取的基因組DNA產量和純度有所不同，如酚氯仿法、異硫氰酸胍法、固相吸附法、鹽析法和碘化物法等［4-6］。

通過本實驗的研究，從冷凍保存的抗凝血中提取的DNA總量少于新鮮血樣，可能與從凍存標本中去除紅血素需要的清洗步驟較多有關［7］。凍存的血樣提取過程首先要化凍，反復凍融某種程度上會使提取基因組DNA的數量有所損失。獲得高質量DNA的關鍵之一是防止DNA降解，凍存時間越長DNA產量會越低，可見標本的保存條件對于保證DNA的提取質量至關重要。今后工作中，重要臨床標本盡量用新鮮的血樣提取基因組DNA，避免凍融減少標本DNA數量的損失。

圖1 新鮮血樣組PCR電泳圖

圖2 凍存血樣組PCR電泳圖

參考文獻

［1］ 白春英，周靜，瑞云，等.經濟、有效提取外周血基因組DNA的方法［J］.檢驗醫學與臨床，2010，9（7）:1795.

［2］ 田子強，劉俊峰，張少為，等.甲醛固定石蠟包埋組織中DNA的三種提取方法比較［J］.基礎醫學與臨床，2004，4（4）:335-338.

［3］ 胡盛平，樸英姬，陳玲，等.三種全血提取基因組DNA的方法的比較Genomix方法的改良［J］.汕頭大學醫學報，2001，14（4）:263-265.

［4］ 張帥，徐銳，張強，等.改良鹽析法提取全血基因組DNA的影響因素研究［J］.中國現代醫學雜志，2012，22（35）:42-46.

［5］ 楊澤民，羅少洪，陳耕夫.三種全血基因組DNA提取方法的比較［J］.中國實用醫藥，2009，4（12）:13-14.

［6］ 賈二娟，朱偉鋒，余樂涵.蛋白酶K對鹽析法提取全血DNA的影響［J］.實驗與檢驗醫學，2011，29（3）:263 -264.

［7］ 焦鵬，葉文靜，常起，等.人血細胞DNA無酚提取法［J］.基礎醫學與臨床，2007，27（8）:918.

中圖分類號：R34

文獻標識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）10-0028-02

Effect of Preservation Conditions on the Quality of Whole Blood Genomic DNA

LV Xiao-yan， YANG Zhi-gang
（Research Center of Plastic Surgery Hospital， Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College， Beijing 100144， China）

［Abstract］Objective To compare the quality of genomic DNA extracted from fresh and frozen whole blood. Methods 300 μL fresh whole blood samples were applied to extract the genomic DNA using whole blood genomic DNA Extraction Kit. The samples also were frozen at -75 ℃ for three months， and then the genomic DNA was extracted by the same method. UV spectrophotometer， electrophoresis and PCR were used to detect the purity and quantity. Results The total genomic DNA extracted from fresh and frozen blood samples were （16.2±12.12）μg and （7.94±4.18）μg， respectively， the A260/A280 purity was: （1.85±0.01） and （1.84±0.02）. Conclusion The total genomic DNA extracted from fresh blood samples was significantly more than that from frozen blood samples， while the purity was observed with no significant difference between the two groups. In this way， low temperature freezing could decrease the yield of genomic DNA from whole blood cells.

［Key words］Whole blood； Genomic DNA； Peripheral blood