牛病細菌分離鑒定及藥物敏感性試驗

2016-07-15 03:20:22胡東方程子龍肖一紅屈亞錦劉思當山東農業大學動物科技學院山東泰安271000

山東畜牧獸醫 2016年4期

胡東方程子龍劉朋肖一紅屈亞錦劉思當（山東農業大學動物科技學院山東泰安 271000）

試驗研究

牛病細菌分離鑒定及藥物敏感性試驗

胡東方程子龍劉朋肖一紅屈亞錦劉思當*
（山東農業大學動物科技學院山東泰安 271000）

摘要本文就接診的牛細菌性呼吸道病例采集的117份奶樣進行了實驗室分離鑒定和藥敏試驗，結果表明，牛病常見致病菌的多重耐藥現象較為普遍，僅有少數幾種藥物，如頭孢類及喹諾酮類藥物能夠發揮有效抗菌作用。

關鍵詞牛病細菌分離鑒定藥敏試驗

近年來，隨著經濟的發展及居民生活水平的提高，民眾對肉、奶的消費水平也越來越高，這在很大程度上促進了養牛業的發展。但是頻繁的犢牛貿易、流動以及越來越大的規模化牛場出現使得牛細菌性疾病呈現出一些新的流行特點，細菌性疾病成為影響養牛業發展的主要因素，如何高效防控牛病成為養牛業的一大難題。據調查，當前除牛布氏桿菌病、結核病、副結核病等需要檢測凈化的疾病外，由巴氏桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏菌等引起的運輸熱、乳房炎、腹瀉等也成為影響養牛業發展的重要疾病［1，2］。在當前細菌耐藥性普遍及食品安全問題頻出的背景下，要想準確、高效地對牛常發細菌病進行診斷和防控，必須依賴實驗室進行細菌分離鑒定和藥物敏感試驗。本文就接診的牛細菌病病例的實驗室診斷及藥敏試驗進行總結，希望能為牛場常見細菌性疾病的病原學研究及藥物防治提供理論依據和防控思路。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年4月至2015年10月間接診山東各地70余個牛場的呼吸道病及犢牛腹瀉病例，并采集奶樣117份。

1.2 方法

對疑似細菌病病例進行實驗室綜合診斷和藥敏試驗，并針對性地提出了防控方案。

2 結果

2.1 牛巴氏桿菌病

牛巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的一種敗血性傳染病，臨床上以高熱、肺炎或急性胃腸炎并發多器官廣泛性出血為主要特征［3］。巴氏桿菌為革蘭氏陰性菌，用堿性美蘭染色血涂片或組織觸片后可發現兩端深染的短桿菌。一般認為該菌為條件性致病菌，平時即大量寄生在牛的上呼吸道黏膜和消化道黏膜上，當機體受到各種應激因素刺激后而導致抵抗力下降時，該菌便可乘虛而入，經血液循環遍布全身多個組織器官而發生內源性感染和發病［4］。之前一般認為牛運輸熱的發生與多殺性巴氏桿菌的感染直接相關，但最近研究發現，牛運輸熱的發生是由多種病原微生物感染引起的以高熱、間質性及大葉性肺炎為主的一種應激性綜合征，當然，巴氏桿菌在該病的發生中起到重要作用。

2.1.1 臨床癥狀和病理變化病牛呈精神沉郁、目光呆滯、離群獨處、食欲廢絕、反芻減少或停止，體溫38.9～40.8℃，嚴重的患牛抽搐后死亡。剖檢可見病牛肺臟高度腫脹，呈暗紅色實變、質度較硬（圖1），肺切面小葉間隔水腫、增寬；氣管環充血、氣管內有泡沫樣液體（圖2）；肝臟暗紅色淤血腫脹、質脆；腸黏膜、腸漿膜均見有彌散性出血斑點，腸黏膜脫落；胃黏膜有彌漫性出血。

圖1 病牛肺臟暗紅色實變、肺小葉間隔增寬

圖2 病牛氣管環充血、管腔內有大量泡沫性液體

2.1.2 實驗室診斷（1）細菌分離與純培養：無菌條件下從病牛肺臟、喉頭中分離病料劃線接種于綿羊血瓊脂平板，倒置放在37℃培養箱中24h后，可見在血平板上形成灰白色濕潤而黏稠菌落，無溶血現象。在45°折光下，呈現鮮明的藍綠色并帶金屬光澤，邊緣有狹窄的紅黃色帶。（2）菌落鑒定：挑取單個菌落、涂片，干燥后經瑞氏染色，鏡下可見兩極著色的短桿菌（圖3）；經革蘭氏染色可見呈革蘭氏陰性的短桿菌（圖4）。（3）細菌生化試驗：分離培養物在進行生化鑒定前需要先檢查培養物的純度。將菌株分別劃線接種血平板，37℃培養24h后觀察。如劃線平板上生長的菌落分布均勻，有可供觀察的一定數量的單個菌落，通過不同光角度觀察和比較菌落的一致性。如菌落形態特征一致，可作為鑒定用菌株；若菌落特征不一致，則需要繼續進行劃線培養，直至菌落形態一致或80%以上菌落一致即可。菌落形態特征一致的菌落，先進行涂片和革蘭氏染色，鏡檢特征為革蘭氏陰性短桿菌后方可進行生化鑒定。生化鑒定可進行如下項目的測定：葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、吲哚、VP等，按照說明進行試驗。巴氏桿菌能夠發酵葡萄糖、果糖及甘露醇；不發酵麥芽糖、乳糖；吲哚試驗陽性；VP試驗陰性。（4）巴氏桿菌PCR檢測：根據GenBank公布的序列設計特異性引物，上游：ATCCGCT ATTTACCCAGTGG；下游：GCTGTAAACGAACTCGC CAC，擴增片段長度457bp［5］。用接種環挑取單菌落，均勻混于含50μl無菌水的離心管中，置于100℃水浴中煮5～10min，然后迅速置于冰上冷卻5min，10000rpm離心2min，上清即為PCR模板。按照常規PCR體系和反應條件（退火溫度56℃）進行PCR擴增。（5）藥敏試驗：藥敏試驗可用紙片擴散法和梯度稀釋法進行，目前常用較為經濟、簡便的紙片法（K-B法）。挑取已鑒定好的巴氏桿菌單菌落，接種于肉湯培養基中增菌培養（37℃，16～24h）。比濁法計數后，用培養基稀釋至3×109個/ml［4］。用滅菌棉拭子蘸取稀釋后的菌液均勻涂抹于血平板（或吸取30μl菌液至平板上，用滅菌L棒均勻涂滿平板），待菌液吸收后，按照圖5所示貼藥敏紙片（每兩個紙片的中心間距應不低于24mm）。將貼完藥敏紙片的平皿置于37℃溫箱中倒置培養16～24h后觀察結果。根據抑菌圈直徑判斷細菌對藥物的敏感性。

圖3 瑞氏染色可見巴氏桿菌為兩極深染的短桿菌

圖4 革蘭氏染色　為陰性短桿菌

圖5 直徑9cm平板貼藥敏片示意圖

經分離培養及鑒定，共從28份疑似病料中分離得到16株巴氏桿菌，對這16株分離菌進行了以下藥物的藥敏試驗：強力霉素、四環素、慶大霉素、環丙沙星、卡那霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考。藥敏試驗結果如表1所示。

表1 巴氏桿菌藥物敏感情況（%）

2.2 奶牛乳房炎

奶牛乳房炎是由物理、化學或微生物等因素刺激奶牛乳腺而引發的一種炎癥反應，其中多種病原微生物如葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌等細菌的感染是引起該病的主要原因。該病已經成為危害世界奶牛養殖業的主要疾病之一［6］。據世界奶牛協會統計，該病在多個國家和地區普遍發生，世界范圍內的發病率高達50%，中國奶牛隱性乳房炎的陽性率介于46.4%～85.7%之間［7，8］。當前，主要采取抗生素療法對該病進行防治，由于臨床治療過程中存在盲目使用、大劑量或長時間使用抗生素等諸多問題，致使療效較差及耐藥菌株不斷增加，非但提高養殖成本、不利于奶牛產業的發展，還會通過殘留在乳中的抗菌藥物威脅人類健康［9］。因此，及時準確地掌握奶牛乳房炎相關病原的種類及藥物敏感性，將有助于指導臨床合理用藥及提高該病的防治效果，對乳房炎相關致病菌的耐藥性研究也大有裨益。

2.2.1 奶樣采集從山東地區共采集奶樣117份，樣品為臨床型或亞臨床型乳房炎（根據SMT檢測結果而篩選的）患牛奶樣。人工擠奶，采樣前對奶牛乳房及擠奶工雙手進行消毒，手工擠去前3把奶，而后將奶擠至滅菌的10ml離心管中，標記后冰浴中運送至實驗室待檢。送檢的奶樣短時間保存于4℃冰箱中，并在12h內開展細菌分離工作。

2.2.2 細菌分離與純培養將無菌采集的奶樣搖勻后，分別取0.1ml接種于綿羊血瓊脂平板及伊紅美藍瓊脂平板中，用滅菌L棒涂布均勻。將涂布后的平板倒置放于37℃溫箱中培養24h后進行菌落形態觀察，并對可疑菌落進行涂片、革蘭氏染色及鏡檢。金黃色葡萄球菌在血平板上的菌落形態為黃色或白色大菌落，周圍有完全透明溶血圈（圖6）；挑取疑似菌落革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陽性、排列成葡萄串樣或短鏈簇狀的球菌；將疑似金黃色葡萄球菌菌落接種于營養肉湯中，置于37℃搖床中進行純培養。鏈球菌在血平板上的菌落形態為有溶血環或無溶血環的圓形突起的細小菌落；挑取疑似鏈球菌菌落革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陽性、排列成長鏈狀的球菌；將疑似鏈球菌菌落接種于營養肉湯中，置于37℃搖床中進行純培養。大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂平板中的菌落形態為紫黑色并帶有綠色金屬光澤的菌落；挑取疑似菌落革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陰性的棒狀桿菌；將疑似大腸桿菌菌落接種于營養肉湯中，置于37℃搖床中進行純培養。

圖6 葡萄球菌在血平板上形成黃色或白色大菌落，周圍有透明溶血環

2.2.3 細菌生化鑒定（1）疑似葡萄球菌用觸酶試驗、血漿凝固酶試驗及甘露醇發酵試驗等葡萄球菌屬細菌生化鑒定管進行鑒定。疑似鏈球菌的用CAMP試驗、6.5%NaCl肉湯生長試驗、七葉苷及馬尿酸鈉發酵試驗等進行鑒定。疑似大腸桿菌的用乳糖發酵試驗、三糖鐵、吲哚、甲基紅及VP試驗進行鑒定。（2）從117份奶樣中共分離到致病菌107株，其中金黃色葡萄球菌70株，占分離菌株的65.4%；無乳鏈球菌27株，占分離株的25.2%；大腸桿菌10株，占分離株的9.3%。在采集的117份奶樣中，未分離出細菌的奶樣有11份，可能為非特異性乳房炎或是由其他病原微生物引起。106份有菌奶樣中，多數樣本（79/106）只分離到一種優勢菌，其余27份奶樣（25.5%）中分離得到兩種或兩種以上細菌。乳房炎奶樣分離到的細菌感染情況見表2。

表2 乳房炎樣本的細菌感染情況

2.2.4 藥敏試驗經分離培養及鑒定，將分離到的107株致病菌進行了以下藥物的藥敏試驗：青霉素、阿莫西林、頭孢噻呋、氧氟沙星、紅霉素、慶大霉素、環丙沙星、氟苯尼考。藥敏試驗結果如表3所示。

表3 藥物對三種病原菌的平均抑菌圈直徑（mm）

2.3 犢牛腹瀉

犢牛腹瀉是指斷奶前的犢牛所發生的一種以消化不良及腹瀉為主要特征的消化道疾病。該病是由腸道內的細菌、病毒或寄生蟲等病原微生物或是營養性因素、環境因素致使機體抵抗力下降及發病后所表現出來的一種多因素綜合征，是造成犢牛死亡、生長發育不良且危害犢牛養殖最為嚴重的疾病之一，給牛場造成巨大的經濟損失，嚴重阻礙了養牛業的發展［10］。引起犢牛腹瀉的細菌主要有大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌及魏氏梭菌等，單一細菌的感染往往不會引起嚴重的腹瀉，往往是伴隨著飼養管理因素或應激因素一起導致犢牛抵抗力下降、腸道菌群失調，加之細菌感染而誘發嚴重的腹瀉［11，12］。因此，如何預防和治療犢牛腹瀉就成了急需解決的難題。目前，對犢牛腹瀉病的治療主要采用抗生素治療并結合支持療法，由于致病因素眾多，針對性不強，臨床治療效果往往不夠理想，加之長期而廣泛地使用抗生素，細菌耐藥性和藥物殘留引起的社會問題也日益凸顯。為明確犢牛腹瀉病例中細菌性致病因素所占的比重及致病細菌的耐藥情況，特對接診的犢牛腹瀉病例進行了細菌的分離鑒定及藥敏試驗。

2.3.1 樣品采集應用滅菌棉拭子采取病牛肛門處新鮮糞便或肛門拭子共計50份，標記后冰浴中運送至實驗室待檢。送檢的樣品短時間保存于4℃冰箱中，并在12h內開展細菌分離工作。

2.3.2 細菌分離及純培養將無菌采集的棉拭子樣品置于0.5ml滅菌生理鹽水中，混勻后，分別取0.1ml接種于普通營養瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板及SS平板中，用滅菌L棒涂布均勻。將涂布后的平板倒置放于37℃溫箱中培養24h后進行菌落形態觀察，并對可疑菌落進行涂片、革蘭氏染色及鏡檢。大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂平板中的菌落形態為紫黑色并帶有綠色金屬光澤的菌落；挑取疑似菌落革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陰性的棒狀桿菌（圖7）；將疑似大腸桿菌菌落接種于營養肉湯中，置于37℃搖床中進行純培養。沙門氏菌在SS平板中的菌落形態為中心黑色的圓形菌落；挑取疑似菌落革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陰性的小桿菌；將疑似沙門氏菌菌落接種于營養肉湯中，置于37℃搖床中進行純培養。

圖7 大腸桿菌鏡下為革蘭氏陰性短桿菌

2.3.3 細菌生化鑒定將分離自選擇性培養基上的、經染色鏡檢為疑似大腸桿菌及沙門氏菌的菌落增菌培養后調整濃度為0.5麥氏比濁單位的菌液。根據E40/12腸桿菌科細菌生化反應鑒定系統說明對疑似大腸桿菌進行生化試驗鑒定，先進行葡萄糖發酵試驗，糖發酵試驗陽性菌株繼續進行16種生化反應試驗。與大腸桿菌生化特性100%符合的菌株判為大腸桿菌。對疑似沙門氏菌進行鑒定時，先進行葡萄糖發酵試驗，陽性菌株繼續進行E40/12腸桿菌科細菌生化反應鑒定系統規定的16種生化試驗，試驗結果與沙門氏菌符合率為100%的確定為沙門氏菌。經過細菌分離、染色及生化鑒定，最終從50份腹瀉糞便樣品中分離得到39株大腸桿菌和17株沙門氏菌（表4）。