氯代烴存在下覆蓋層微生物甲烷氧化動力學

刑志林，張云茹， 張麗杰

(1.重慶理工大學　a.化學化工學院;b.藥學與生物工程學院，重慶　400054； 2.重慶大學 城市建設與環境工程學院, 重慶　400045)

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氯代烴存在下覆蓋層微生物甲烷氧化動力學

刑志林1a，2，張云茹1b， 張麗杰1b

(1.重慶理工大學a.化學化工學院;b.藥學與生物工程學院，重慶400054； 2.重慶大學 城市建設與環境工程學院, 重慶400045)

摘要：填埋氣中揮發性氯代烴等非甲烷有機物對覆蓋土中甲烷氧化有抑制效應。通過擬合不同抑制動力學方程考察了多種氯代烴對覆蓋土微生物甲烷氧化的抑制形式，結果表明：氯代烴與甲烷之間主要為競爭性抑制(R2范圍為0.937～0.999)。計算了不同氯代烴存在時的米氏常數KmI和氯代烴的解離常數KI，結果顯示：1,1,2-三氯乙烷(KI=-30.111mg/L)和1-氯丙烷(KI=-24.323mg/L)對甲烷氧化有促進作用；氯代烯烴的競爭性抑制(KI為0.013～14.111mg/L)強于氯代烷烴(KI=0.215-278.515mg/L)；四氯乙烯的競爭性抑制效應最強，KI為0.013mg/L。該研究為強化覆蓋層甲烷氧化和氯代烴共代謝生物降解提供了理論指導。

關鍵詞：覆蓋層；甲烷氧化菌；甲烷氧化；氯代烴；抑制動力學

在生活垃圾填埋場穩定化過程中，有機物的厭氧分解產生的填埋氣(LFG)包括50%～60%的甲烷和5%～50%的二氧化碳[1-2]。據估計，填埋場每年約產生900～7 000萬噸的甲烷，全球每年約有6億噸的甲烷排放到大氣中。此外填埋氣中還包含大約1%的超過100種揮發性非甲烷有機物(NMOCs)，包括具有生物毒性的鹵代脂肪烴和產生臭味的硫氧化物等[3-5]。LFG的排放對生態環境產生了嚴重影響，因此有效去除LFG對于填埋場實現真正的衛生填埋有重要意義。

分析覆蓋土中甲烷與非甲烷有機物間的抑制關系，對于調控甲烷減排與氯代烴的共代謝降解有重要意義。然而，在前期研究中較少關注覆蓋土中甲烷與多種氯代烴的抑制關系，或只關注有限幾種氯代烴[12-13]，限制了甲烷氧化和氯代烴共代謝降解研究。基于此，本研究以覆蓋土富集甲烷氧化菌為生物介質，以競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制3種抑制方程為基礎，考察多種氯代烷烴、氯代烯烴的抑制形式，并基于不同氯代烴抑制方程，計算氯代烴解離常數，比較多種典型氯代烴的抑制能力。

1材料與方法

1.1實驗材料

NMS液體培養基的配制參考文獻[14]，所涉及氯代烴有二氯甲烷(DCM)、三氯甲烷(CF)、四氯化碳(CTC)、1,2-二氯乙烷(1,2-DCA)、1,1,2-三氯乙烷(1,1,2-TCA)、1,1,2,2-四氯乙烷(1,1,2,2-TeCA)、1-氯丙烷、1,3-二氯丙烷、1,2,3-三氯丙烷、順-1,2-二氯乙烯(s-1,2-DCE)、反-1,2-二氯乙烯(t-1,2-DCE)、三氯乙烯(TCE)和四氯乙烯(PCE)，以上氯代烴均為分析純，由重慶川東化工(集團)有限公司化學試劑廠生產。

所用微生物及培養方法參見文獻[15]。

1.2實驗方法

將富含甲烷氧化菌的覆蓋土微生物培養至穩定期中，根據菌液濃度與菌液吸光度(OD600)的關系曲線y=3.8390x得到富集菌液的濃度。配置不同濃度的氯代烴水溶液。以一種氯代烴一種濃度為例，將培養好的菌液分裝于5個100mL血清瓶中，添加0.5mL配置好的氯代烴水溶液，用丁基橡膠膠塞和鋁蓋密封。甲烷置換瓶中甲烷體積分別為2，3，5，7，10mL。監測初始甲烷濃度，每隔一段時間監測甲烷消耗量，計算甲烷氧化速率。設立批次實驗，改變氯代烴種類和濃度，重復以上步驟。

1.3分析檢測條件和方法

甲烷、氧氣和二氧化碳采用氣相色譜(川儀SC-6000A)測定，色譜條件:不銹鋼色譜柱TDX8-12-25 2m，進樣口溫度、柱溫和檢測器(TCD) 溫度分別為120 ℃,90 ℃,120 ℃，氮氣為載氣，載氣流速為25mL/min，進樣量為0.5mL。

1.4抑制動力學

甲烷氧化菌在甲烷單加氧酶作用下將甲烷氧化，反應過程符合Michaelis-Menten動力學：

(1)

式中：rs為底物消耗速率(mol/(gcell·h))；rmax為底物最大消耗速率(mol/(gcell·h))；Cs為底物濃度(mol/L)；Km為米氏常數(mol/L)。

當有抑制劑存在時，抑制劑的酶抑制分為以下幾種情況：

1) 競爭性抑制。在反應過程中抑制劑I在酶的活性部位上結合，阻礙了酶與底物的結合，使酶催化底物的反應速率下降，底物最大消耗速率不受抑制劑影響。競爭性抑制方程如下：

(2)

式中:rSI為有抑制時底物消耗速率(mol/(gcell·h))；KmI為有競爭抑制時的米氏常數(mol/L)。KmI與抑制劑的關系：

(3)

式中：KI為抑制劑的解離常數(mol/L)；CI為抑制劑濃度(mol/L)。將式(3)帶入式(2)，轉化為：

(4)

式(4)即為競爭性抑制動力學方程。

2) 非競爭性抑制。抑制劑與酶分子的結合點不在酶催化反應的活性部位，底物與酶的結合并不影響抑制劑與酶的結合，而抑制劑與酶的結合卻阻止底物與酶的結合，米氏常數保持不變，因此方程如下：

(5)

式中rI,max為存在非競爭性抑制時的底物最大消耗速率，與抑制劑的關系：

(6)

式中rI,max為非競爭抑制時的最大消耗速率。將式(6)帶入式(5)轉化為：

(7)

3) 反競爭性抑制：抑制劑不能直接與游離酶相結合，而只能與復合物(酶和底物)相結合生成三元復合物(酶底物抑制劑)。反競爭性抑制方程為：

(8)

rI,max和KmI與抑制劑關系為：

(9)

(10)

將式(9)和(10)帶入式(8)，轉化為：

(11)

2結果與討論

2.1抑制動力學擬合

以抑制劑二氯甲烷、1,2-二氯乙烷和四氯乙烯為例，3種抑制形式的線性擬合如圖1所示。

表1　不同抑制形式擬合的可決系數

表1(續)

2.2不同氯代烴的抑制動力學參數

由式(3)可知：KI> 0，KI減小，則KmI增大，表明底物與酶的結合能力降低。根據競爭性抑制動力學原理，通過擬合直線的截距和斜率可以得到KmI，再根據式(3)以KmI對CI作圖即可得到不同氯代烴的解離常數KI，擬合結果如表2所示。由表2可以看出：1,1,2-三氯乙烷和1-氯丙烷的解離系數分別為-30.111 mg/L和-24.323 mg/L，KmI的變化范圍分別為0.042～0.066和0.076～0.093，明顯小于無氯代烴的Km(空白組1為0.103)，說明該兩種氯代烴在濃度為0.1～10mg/L和0.14～3.4mg/L的范圍內不僅沒有抑制甲烷氧化菌活性，在一定程度上強化了甲烷氧化。Zhao等[18]發現氯仿濃度小于80mg/L時可促進兼性甲烷氧化菌MethylocystisstrainJTA1的活性。

除1,1,2-三氯乙烷和1-氯丙烷外，實驗條件下其他氯代烴對覆蓋土微生物均表現為競爭性抑制。競爭性抑制時的米氏常數KmI變化范圍為0.115～1.06和0.209～1.276，高于對應的空白組0.103和0.200。隨著氯代烴濃度的增大，KmI增大，抑制效應增大。氯代烴的解離常數KI變化范圍為由四氯乙烯的0.013 mg/L到1,2-二氯乙烷的278.515 mg/L，說明四氯乙烯在較低的濃度時(0.003 75～0.188 mg/L)對該覆蓋土微生物就有很強的抑制效應，而1,2-二氯乙烷(0.216～21.75 mg/L)只有微弱的影響。就氯代烴的結構而言，氯代烯烴的解離常數變化范圍為0.013～14.111 mg/L，氯代烷烴的解離系數變化范圍為0.215～278.515 mg/L，說明氯代烯烴有更強的抑制效應；而氯原子數與解離系數并無明顯關系，說明氯代烴的飽和程度影響抑制程度。Albanna等[18]以三氯乙烷、三氯乙烯和二氯乙烯的混合物為抑制劑研究不同溫度對覆蓋土的抑制效應，結果顯示：混合抑制劑的解離常數的變化范圍為0.088～0.462 mg/L，且隨溫度的增加(5 ℃～35 ℃)抑制效應也隨之增加。

表2　競爭性抑制擬合結果

表2(續)

3結束語

覆蓋土微生物在填埋氣去除，包括甲烷氧化和揮發性氯代烴等非甲烷有機物生物降解中起重要作用。本研究表明：對于甲烷單加氧酶而言，甲烷和多種氯代烴之間存在競爭性抑制，這對于強化不同氯代烴的共代謝生物降解有重要意義。作為復雜的次生環境，覆蓋土中微生物種類和功能還未得到全部認清，已有研究表明[15]：覆蓋土中存在有其他可直接降解氯代烴的微生物和苯酚羥化酶等共代謝降解酶，也說明氯代烴對于覆蓋土微生物不只有一種存在形式。充分認識氯代烴在微生物中與酶的結合形式及多種抑制形式的主導機制，對于從分子水平調控覆蓋層中氯代烴的生物降解有指導作用。

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(責任編輯何杰玲)

Kinetics of Methane Oxidation by Microorganism in LandfillCoverSoilinthePresenceofChlorinatedHydrocarbons

XING Zhi-lin1a, 2, ZHANG Yun-ru1b, ZHANG Li-jie1b

(1.a.College of Chemistry and Chemical Engineering;b.CollgeofPharmacyandBiologicalEngineering,ChongqingUniversityofTechnology,Chongqing400054,China;2.UrbanConstructionandEnvironmentalEngineering,ChongqingUniversity,Chongqing400045,China)

Abstract:Non-methaneorganiccompoundsinlandfillgassuchasvolatilechlorinatedhydrocarbonshadinhibitingeffecttomethaneoxidation.Inhibitionformofcoversoilmicrobemethaneoxidationforvariouschlorinatedhydrocarbonwasinvestigatedbymatchingseveralkineticsequations.Theresultsshowthatthemaininhibitionformbetweenchlorinatedhydrocarbonsandmethaneiscompetitiveinhibition(R2:rangingfrom0.937～0.999).BycalculatingKmIandchlorinatedhydrocarbondissociationconstantsKIundertheconditionofdifferentchlorinatedhydrocarbons,theresultshowsthat1, 1, 2-trichloroethane(KI= 30.111mg/L)and1-chloropropane(KI=24.323mg/L)couldpromotethemethaneoxidation.Competitiveinhibitionofchlorinatedrubber(KI:rangingfrom0.013～14.111mg/L)isbetterthanchlorinatedparaffin(rangingfrom0.215～278.515mg/LofKI).Amongthem,competitiveinhibitioneffectoftetrachloroethyleneisthestrongest(KI= 0.013mg/L).Thestudyprovidesatheoreticalguidanceforstrengtheningofmethaneoxidationandchlorinatedhydrocarbonmetabolicbiodegradationofcoveringlayer.Keywords:coveringlayer;methanotroph;methaneoxidation;chlorohydrocarbon;inhibitionkinetics

收稿日期：2016-01-24

基金項目：重慶市基礎與前沿研究資助項目(cstc2013jcyjA20009)

作者簡介：刑志林(1988—)，男，博士研究生，主要從事環境微生物和固廢處理研究； 通信作者 張云茹(1977—)，女，副教授，主要從事環境微生物、生化工程等方面的研究。

doi:10.3969/j.issn.1674-8425(z).2016.06.014

中圖分類號：X172

文獻標識碼：A

文章編號：1674-8425(2016)06-0083-08

引用格式：刑志林，張云茹， 張麗杰.氯代烴存在下覆蓋層微生物甲烷氧化動力學[J].重慶理工大學學報(自然科學)，2016(6):83-90.

Citationformat：XINGZhi-lin,ZHANGYun-ru,ZHANGLi-jie.KineticsofMethaneOxidationbyMicroorganisminLandfillCoverSoilinthePresenceofChlorinatedHydrocarbons[J].JournalofChongqingUniversityofTechnology(NaturalScience)，2016(6):83-90.