一種改良的薄層等電聚焦電泳新方法

張 旭陳振江（ 遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 6600；2 湖北中醫藥大學藥學院，湖北 武漢 430065）

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一種改良的薄層等電聚焦電泳新方法

張 旭1陳振江2*
（1 遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600；2 湖北中醫藥大學藥學院，湖北 武漢 430065）

【摘要】目的 介紹一種高效新穎的IFE方法。方法 采用簿層等電聚焦電泳。結果 該方法簡便實用，并可節省昂貴試劑的用量。結論 此方法可用于藥物蛋白質成分的研究。

【關鍵詞】凝膠；聚丙烯酰胺凝膠電泳；十二烷基硫酸鈉-PAGE；等電聚焦電泳

等電聚焦電泳（IFE）是將兩性電解質加入盛有pH梯度緩沖液的電泳槽中，當其處在低于其本身等電點的環境中則帶正電荷，向負極移動；若其處在高于其本身等電點的環境中，則帶負電向正極移動。當泳動到其自身特有的等電點時，其凈電荷為零，泳動速度下降到零，具有不同等電點的物質最后聚焦在各自等電點位置，形成一個個清晰的區帶，分辨率極高。此外，由于分離所需時間短，分子擴散作用較小，分離結束后能回收被分離的樣品物質，故在中藥成分分析及中藥材真偽鑒別上有著廣泛而良好的應用前途。在進行IFE過程中，雖然分辨率會隨電泳時間的延長和工作電壓的升高而提高，但工作電壓的升高也會使pH梯度衰變加快，需采用相應的技術措施來解決。

為降低pH梯度緩沖液在較高工作電壓下的“衰變”，可采用如下措施：①選用適宜的兩性電解質。理想的兩性電解質載體應在pI處有足夠的緩沖能力及電導，以保證其穩定的pH梯度和允許一定的電流通過。兩性電解質的分子量要盡可能小，以保證被分離的高分子物質通過分子篩或透析方法得以分開，同時所選用的電解質不應與被分離物質發生反應或使之變性。目前，普遍應用的兩性電解質有3種規格，分別適用于pH 3～10、pH 4～10、pH 5～7。②調節陽極電解液的pH值以改變pH梯度。如在控制電解質本身的濃度時，通過加入離子型表面活性劑來增加電解液的導電性，以促進適宜的較“平坦”的pH梯度的形成。③用緩沖劑聚焦電泳可制備包含待分離樣品中狹窄的等電點在內的水平pH梯度。如陳振江應用PAGE、SDS-PAGE及IFE系列電泳技術研究鑒別了青箱子、阿膠、菊花、射干、土鱉蟲、山藥、白術、半夏等中藥[1-8]。此外，為了產生相應的pH梯度，將已聚合的膠放在由0.1 mol/L H3PO4和0.1 mol/L NaOH組成的電極液中預泳1 h，然后取紫蘇子及其偽品薺荸子的樣品液各10 μL，點于膠上電泳2 h。結果顯示在靠近堿性、中性或酸性的各個區域，紫蘇子與薺荸子的電泳譜帶完全不同，實現了二者的鑒別[9]。實驗中使用的兩性電解質Ampholyte是一種脂肪族多胺基多羧基的混合物，一般為40%的水溶液，電聚焦的用量通常為1%～2%。試驗表明，兩性電解質用量小時，電聚焦后形成的pH梯度寬于其本身的pH梯度；相反，用量大時，電聚焦后形成的pH梯度近似其本身的pH梯度。因此，要提高分辨率，兩性電解質的用量應仔細斟酌。此外，電聚焦的時間直接影響pH梯度的變化。時間過長或過短都不會產生平滑的曲線。所以，電聚焦的時間應嚴格控制，才能得到分辨率高的電泳圖譜。一般電泳時間以6～7 h為宜。

為節省試劑用量，簡化操作，同時有利于電泳圖譜的保存，本文介紹由實驗課題組自行設計的薄層等電聚焦電泳裝置及其操作技術。

1 實驗儀器與試劑

自行組裝薄層等電聚焦電泳模板一套；230型精密pH計（美國奧立龍）；離心機；丙烯酰胺、磷酸、N-N亞甲基雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、過硫酸銨、乙二胺、pH 4～10兩性電解質均為AR級試劑；水為三蒸水。

2 實驗方法

2.1 制膠方法：凝膠母液及電極緩沖液的配制見表1。將凝膠以簿層（其厚度相當投影膠片的厚度）的形式，附著在玻璃片上，玻璃片的背面距長邊1 cm處，用標記筆畫一橫線，作為上樣基準線。

表1 聚丙烯酰胺凝膠的配方

2.2 上樣方法：將定量濾紙剪成芝麻粒大小，裝入干燥潔凈是培養皿中。上樣時用尖頭鑷子夾上一粒浸入樣品液中，取出后放在凝膠的基準線上即可。在10 cm×5 cm的玻璃片上可上樣12～25個樣品。

2.3 加電極緩沖液的方法：由于簿層等電聚焦電泳需用的試劑量很小，所以電極緩沖液只需50～100 mL，裝在滴瓶中，電泳過程中只需間斷的將電極液滴到緊靠凝膠的濾紙條頭即可。

2.4 電泳使用的電泳槽為兩片厚1 cm的有機玻璃塊（10 cm×5 cm），中間鉆兩個孔，用以裝正負電極柱；在長的一邊距邊1 cm處開槽（10 cm× 0.2 cm），其邊沿上鋪設鉑金絲。

2.5 實驗裝置見圖1，最下方是一個30 cm×20 cm的搪瓷盤，內裝冰塊以消除電泳過程中產生的熱；搪瓷盤上面是一塊35 cm×25 cm的普通玻璃，玻璃上是一個硅膠墊片（中間是一個恰好與玻璃片大小相同的空格） 。

圖1 簿層等電聚焦電泳裝置

3 結果討論

3.1 該方法簡便實用，即可節省昂貴試劑的用量，又可在一塊凝膠上作多品種藥物的研究。所得電泳圖譜即可長久保存，又可由電泳圖譜鑒別藥物真偽，同時可以測定藥物所含主要蛋白質成分等電點。

3.2 在測定未知樣品的等電點時，可先采用pH=3～10的兩性電解質，在初步測出等電點之后，改用包括樣品pI值的、窄pH范圍的兩性電解質。為形成平滑的pH梯度并節省兩性電解質的用量，可將占載體總量10%的pH=5～8的兩性電解質加入pH=3～10的兩性電解質中，由此可提高分辨率。

3.3 電泳使用的玻璃片必須潔凈，并用6 μL /100 mL硅酮溶液浸泡，晾干后制膠。這樣做的目的在于防止電泳后凝膠片的變形和開裂。

參考文獻

[1] 陳振江,殷丹.姜黃素膠原微球的質量標準研究[J].湖北中醫學院學報,2007,9(3):43.

[2] 陳振江,沈瑜琪,劉炎文.貴重動物類中藥材蛋白質SDS-PAGE的圖譜研究[J].中藥材,2007,30(7):769.

[3] 陳振江,殷丹,曹艷.厚樸種子蛋白質成分分子量測定[J].中成藥, 2005,27(6):711.

[4] 徐康森,楊仲元,詹華強,等.酒石酸銻及其中間體的純度檢查[J].藥物分析雜志,1982,2(4):193.

[5] 陳振江,張香梅.中藥青葙子、土鱉蟲的等電聚焦電泳研究[J].中草藥,1996,27(10):593.

[6] 陳振江,張桂枝,劉靜芬,等.阿膠及其偽品的IFE研究[J].中成藥, 1998,20(12):31.

[7] 陳振江,陳科力,王曦,等.金錢白花蛇可溶性蛋白凝膠電泳圖譜的研究[J].中草藥,2000,31(5):374.

[8] 陳振江,殷丹,干偉.姜黃素膠原微球的制備工藝研究[J].湖北中醫學院學報,2008,10(1):38.

[9] 黃哲熙.中藥材經驗鑒別方法和應注意的問題[J].中草藥,1993, 24(5):263.

中圖分類號：R-33

文獻標識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）09-0026-02

基金項目：高等學校博士學科點專項科研基金項目（20122133120006），遼寧省自然基金項目（201202153），遼寧省教育廳一般項目（L2012350）

*通訊作者