3種β-興奮劑化學發光酶免疫試劑盒分析檢測方法的評價

寧 霄，張偉清，梁瑞強，曹 進*，張慶生（中國食品藥品檢定研究院，北京　100050）

NING Xiao, ZHANG Weiqing, LIANG Ruiqiang, CAO Jin*, ZHANG Qingsheng(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing　100050, China)

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3種β-興奮劑化學發光酶免疫試劑盒分析檢測方法的評價

寧 霄，張偉清，梁瑞強，曹 進*，張慶生
（中國食品藥品檢定研究院，北京100050）

摘 要：選取3種市售β-興奮劑化學發光酶免疫分析檢測試劑盒，從線性關系、靈敏度、選擇性、檢出限、準確度、重復性及變異性等方面進行實驗，并經農業部1025號公告—18—2008中高效液相色譜-串聯質譜法驗證比較，初步建立了一套化學發光酶免疫分析檢測試劑盒質量評價方法。結果表明：沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺3種試劑盒在測定范圍內線性關系良好，靈敏度分別為0.7、1.8、1.0 ng/mL，檢出限分別為0.2、0.1、0.2 ng/mL，豬肝、豬肉和牛肉的回收率在81.9%～115.2%之間，重復性變異系數為3.3%～9.7%，批間變異系數為9.9%～16.5%，交叉反應率均符合產品說明書要求，可以用于豬肝、豬肉、牛肉樣品中沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺的殘留檢測。

關鍵詞：沙丁胺醇；鹽酸克倫特羅；萊克多巴胺；化學發光酶免疫分析；試劑盒；評價方法

NING Xiao, ZHANG Weiqing, LIANG Ruiqiang, CAO Jin*, ZHANG Qingsheng
(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing100050, China)

引文格式：

寧霄, 張偉清, 梁瑞強, 等. 3種β-興奮劑化學發光酶免疫試劑盒分析檢測方法的評價[J]. 食品科學, 2016, 37(12): 238-242. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612043. http://www.spkx.net.cn

NING Xiao, ZHANG Weiqing, LIANG Ruiqiang, et al. Evaluation of three β-adrenergic agonist chemiluminescence enzyme immunoassay detection kits[J]. Food Science, 2016, 37(12): 238-242. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201612043. http://www.spkx.net.cn

β-興奮劑是一類合成化學興奮劑。此類物質有較強的蛋白質同化作用，可提高蛋白質沉積，如果將其加入動物飼料中，能有效地促進肌肉的生長，降低脂肪比率[1-2]。然而，現在醫學實驗已證明其殘留會嚴重影響到人類的健康，如出現心慌、頭痛、惡心等癥狀，甚至還會增加致癌、致畸的風險[3-4]。鑒于此，人們開始越來越關注動物源性食品中存在的β-興奮劑給人們身體健康所帶來的影響，全世界所有國家均已禁止畜牧生產中應用此類藥物[5-7]，但目前非法使用并造成嚴重食物中毒事件的報道仍然屢見不鮮[8-11]，對人體健康構成巨大威脅。所以選擇一種快速、靈敏的檢測方法具有很強的現實意義。

目前商品化的β-興奮劑檢測試劑盒以其方便快捷的特點得到了廣泛的應用，尤其是化學發光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）試劑盒，因其靈敏度、選擇性、準確率高、無污染、操作簡便等優點而在近年來備受推崇[12]。但產品質量尚沒有相應的行業及國家標準，存在評價體系混亂的情況。鑒于我國試劑盒使用者、生產者和監管者的迫切需求，本研究選擇沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺3種市場上常見的β-興奮劑CLEIA試劑盒，開展評價技術研究[13-15]，依托美國分析化學家協會方法驗證指南，參考食品法典委員會關于殘留分析法評價指標，從線性關系、靈敏度、選擇性、檢出限、準確度、重復性及變異性等方面進行實驗[16-22]，初步建立評價方法，為規范試劑盒質量提供解決思路。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豬肝、豬肉、牛肉樣品市售。

沙丁胺醇（純度為99.5%）、鹽酸克倫特羅（純度為98.5%）、萊克多巴胺（純度為98.0%）對照品德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；β-鹽酸葡萄糖醛苷酶德國Merck公司；甲醇、乙腈為色譜純；甲酸、乙酸、異丙醇、乙酸銨、高氯酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、叔丁基甲醚均為分析純。

試劑盒組成：預包被抗體96 孔板、酶結合物、抗體、提取液、樣品稀釋液、底物液A、底物液B、濃縮洗滌液（1∶20稀釋后使用）、6種質量濃度的系列標準溶液。

1.2儀器與設備

SPY-D-Ⅱ型單光子檢測儀沙屏研公司；高速離心機日本Hitachi公司；渦旋振蕩器中科公司；恒溫水浴振蕩箱上海森信科技有限公司；1290-6460型高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/ MS）儀美國Agilent公司；氮吹儀北京合眾日盛科技公司；pH計瑞士Mettler Toledo公司；Oasis MCX固相萃取柱（60 mg）美國Waters公司。

1.3方法

1.3.1樣品前處理

取新鮮或冷凍的陰性或供試樣品，絞碎并使均質，稱取樣品0.5 g于10 mL離心管中，加入5 mL提取液，超聲時間10 min。80 ℃水浴加熱10 min，6 000 r/min離心10 min。移取上清液1 mL，至培養皿中，晾干。再加入1 mL樣品稀釋液復溶，混勻待測。

1.3.2檢測步驟

分別加標準溶液和樣品溶液50 mL到對應的微孔中，加入酶結合物及抗體各50 mL/孔，混勻，于室溫條件下反應30 min，加250 mL/孔洗滌液洗滌4 次，加入底物液A、B各50 mL/孔，混勻，反應10 min后，用單光子檢測儀測定各孔發光值。

1.3.3陰性樣品制備

對市售豬肝、豬肉和牛肉樣品根據農業部1025號公告—18—2008規定用HPLC-MS/MS方法驗證樣品為陰性。

1.3.4標準曲線和靈敏度的測定

取試劑盒中質量濃度分別為0.1、0.5、1、5、10、20 ng/mL的6種系列標準溶液，按步驟1.3.2節進行測定，每種質量濃度做2 個平行，重復3 次，分3 d進行，對照組為不加任何藥物的樣品稀釋液。

1.3.5選擇性的測定

1.3.5.1同類藥物的選擇性

分別在0.5 ng/mL的待測物溶液中加入1 000 ng/mL的同類藥物以及同類藥物混合物，按1.3.2節方法做3 個平行，測定質量濃度。計算各個交叉反應因子的交叉反應率。

1.3.5.2基體的選擇性

分別取豬肝、豬肉和牛肉的陰性樣品按前處理方法進行操作，用所得溶液配制0.5 ng/mL的待測物試液，按1.3.2節方法測定其質量濃度，并與用樣品稀釋液配制的相同質量濃度試液實測質量濃度進行比較，計算不同基體的交叉反應率，每種基體做3 個平行。

1.3.6檢出限和定量限的測定

取豬肝、豬肉和牛肉3種陰性樣品，分別重復測定20 次，分別得出樣品溶液發光值（B）與對照組溶液發光值（B0）的比值，根據其平均值（M）和標準差（s）計算出M－2s的值，帶入標準曲線方程中，求出對應的質量濃度，即為相應基體的檢出限。

取豬肝、豬肉和牛肉3種陰性樣品，分別重復測定20 次，得出測定結果的B/B0值，根據其平均值（M）和標準偏差（s）計算出M－6s的值，帶入標準曲線方程中，求出對應的質量濃度值，即為相應基體的定量限。

1.3.7準確度與重復性的測定

采用豬肝、豬肉和牛肉3種基體加標進行回收率實驗，基體按照1.3.1節步驟進行處理，分別對1、5、10 ng/mL三個質量濃度水平進行實驗，每種基體、每種質量濃度做10 個平行，按1.3.2節步驟檢測。

1.3.8批間差異穩定性的測定

每種試劑盒取3 個批次的產品，分別對3種基體進行測試，β-興奮劑添加質量濃度為0.5 ng/mL，基體按照1.3.1節步驟進行處理，每個批次進行10 個平行，按1.3.2節步驟檢測。

1.3.9HPLC-MS/MS驗證

1.3.9.1樣品前處理

采用農業部1025號公告—18—2008中HPLC-MS/MS方法。

1.3.9.2HPLC條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm× 150 mm，3.5 μm）；流動相：A相：甲醇；B相：0.1%甲酸溶液；梯度洗脫：0～2 min，維持80% A；2～12 min，80% A線性變化至40% A；12～12.1 min，40% A線性變至4% A；12.1～18 min，維持4% A；18～18.1 min，線性變至80% A；流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量2 μL。

1.3.9.3MS條件

離子源：電噴霧離子化正離子模式；氣流溫度：330 ℃；氣流速率：8 L/min；噴霧氣壓力：30 psi；毛細管電壓：3 500 V；多反應監測掃描采集參數見表1。

表1　HPLC-MS/MS采集參數條件Table l Mass spectral parameters of salbutamol, clenbuterol hydrochloride and ractompaine

2　結果與分析

2.1標準曲線和靈敏度

表2　CLEIA試劑盒與HPLC-MS/MS方法測定結果的比較Table 2　Results of CLEIA and HPLC-MS/MS

根據標準溶液發光值（B）與對照溶液發光值（B0）之比計算抑制率，以標準溶液質量濃度的對數（lgC）值為橫坐標，對應的抑制率為縱坐標繪制標準曲線，以50%抑制濃度（IC50）值衡量檢測方法的靈敏度，結果見表2。IC50越低說明靈敏度越高，由此可見，3種試劑盒檢測方法均具有較高的靈敏度，且符合產品說明書要求。

2.2選擇性

2.2.1同類藥物的選擇性

表3　同類藥物的交叉反應率（n=3）Table 3 Cross-reactivity of kits with related compounds (n= 3)

同類藥物選擇性實驗結果見表3，因為沙丁胺醇和鹽酸克倫特羅結構最相近，都含有苯環和叔胺結構，具有類似的免疫活性基團，所以體現出了3.0%～2.4%的交叉反應，其他物質之間交叉反應率均小于0.1%，符合產品說明書要求。可見3種試劑盒均具有較好的選擇性，檢測時受結構類似物影響小。

2.2.2基體的選擇性

表4　豬肝、豬肉、牛肉的交叉反應率（n=3）Table 4 Cross-reactivity of kits with pork liver, pork and beef (n= 3)

如表4所示，沙丁胺醇試劑盒中豬肝基體交叉反應率為110.7%，豬肉為96.3%，牛肉為105.9%；鹽酸克倫特羅試劑盒中豬肝基體交叉反應率為107.7%，豬肉為91.7%，牛肉為101.0%；萊克多巴胺試劑盒中豬肝基體交叉反應率為90.6%，豬肉為103.9%，牛肉為92.7%；說明基體對3種試劑盒的干擾均很小。

2.3檢出限和定量限測定結果

對不同基體陰性樣品進行測定，經計算得，沙丁胺醇試劑盒檢測豬肝、豬肉和牛肉的檢出限分別為0.17、0.20、0.18 ng/mL，定量限分別為0.54、0.49、0.51 ng/mL；鹽酸克倫特羅試劑盒檢測豬肝、豬肉和牛肉的檢出限分別為0.15、0.15、0.14 ng/mL，定量限分別為0.48、0.54、0.46 ng/mL；萊克多巴胺試劑盒檢測豬肝、豬肉和牛肉的檢出限分別為0.16、0.19、0.16 ng/mL，定量限分別為0.41、0.45、0.37 ng/mL。

2.4準確度與重復性實驗結果

表5　試劑盒檢測法準確度與重復性測定結果（n=10）Table 5 Mean recovery rates of 10 replicates for -adrenergic agonists in negative pork liver, pork and beef samples spiked at three levels (n= 10)

如表2、5所示，在豬肝、豬肉和牛肉中分別添加3種β-興奮劑，其中沙丁胺醇的回收率為81.9%～115.2%，平均回收率為100.3%，變異系數（coefficient of variation，CV）為4.3%～9.9%，平均CV 為6.8%；鹽酸克倫特羅的回收率為88.7%～111.4%，平均回收率為98.6%，CV為3.8%～9.7%，平均CV為5.9%；萊克多巴胺的回收率為85.8%～110.2%，平均回收率為97.7%，CV為3.3%～9.3%，平均CV為5.4%。在各樣品的添加回收率實驗中，CV均在試劑盒說明書所允許的范圍內，證明試劑盒有較好的準確性和重復性，可以用于豬肝、豬肉和牛肉的檢測。

2.5批間差異穩定性實驗結果

計算不同批次產品的測定平均值和CV，結果如表6所示，沙丁胺醇試劑盒3 個批次產品中添加在豬肝、豬肉和牛肉中的CV分別為11.3%、16.5%和10.2%；鹽酸克倫特羅試劑盒3 個批次產品中添加在豬肝、豬肉和牛肉中的CV分別為12.0%、15.6%和14.5%；萊克多巴胺試劑盒3 個批次產品中添加在豬肝、豬肉和牛肉中的CV分別為9.9%、14.7%和11.8%。數據表明試劑盒批次間穩定性良好。

表6　試劑盒檢測法批間差異穩定性測定結果（n=10）Table 6 Inter-assay variance of the three kits (n= 10)

2.6HPLC-MS/MS驗證結果

2.6.1標準曲線的測定結果

用甲醇逐級稀釋的3種β-興奮劑混合標準工作液（1、5、10、20、50 ng/mL）分別進樣，以樣品的峰面積對質量濃度進行線性回歸。結果表明，在1～50 ng/mL范圍內，沙丁胺醇線性相關系數R2為0.999 6；鹽酸克倫特羅線性相關系數R2為0.999 7；萊克多巴胺線性相關系數R2為0.999 7。

2.6.2檢出限和定量限的測定結果

選用豬肝、豬肉和牛肉3種陰性樣品，分別用絞肉機絞勻，稱取6 份，每份10 g，在其中加入一定量的β-興奮劑標準混合液，而后按照前述樣品處理方法和所定條件進行分析，以3 倍和10 倍信噪比分別計算出本方法的檢出限為0.2 ng/mL，定量限為1.0 ng/mL。

2.6.3準確度和重復性的測定結果

表7　HPLC-MS/MS檢測法準確度與重復性測定結果（n=6）Table 7 Mean recovery rates of 6 replicates for -adrenergic agonists in negative pork liver, pork and beef samples spiked at three levels (n= 6)

實驗選用3種基體陰性試樣中添加不同量的β-興奮劑混合標準液，進行加標回收實驗，每種基體，每個化合物做3 個水平的添加，每個添加水平均做6 個平行樣，從表7可以看出，該方法具有良好的精密度和較高的準確性。以此方法為標準，對CLEIA試劑盒分析法的準確性進行驗證。對2.4節和2.6.3節測定結果進行線性回歸分析，以相關性表示兩種方法的一致性。所得沙丁胺醇線性方程為y = 0.785 5 x＋0.460 4，R2=0.987 8；鹽酸克倫特羅線性方程為y = 0.904 5x＋0.293 5，R2=0.971 9；萊克多巴胺線性方程為y = 0.887 6x＋0.314 4，R2=0.973 4，說明3種CLEIA試劑盒檢測豬肝、豬肉、牛肉中的沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺結果準確可靠。

3　結 論

本實驗針對試劑盒質量評價體系混亂的問題，綜合CLEIA方法自身特點，以3種經農業備案且年銷售量占據市場上同類產品1/3以上的β-興奮劑CLEIA試劑盒作為檢測對象，設計了一套質量評價方法，并與農業部1025號公告—18—2008中的HPLC-MS/MS方法進行了比較驗證。為企業在生產過程中的質量控制及監管部門日常監督檢驗工作提供了參考依據。

實驗結果表明，選擇的3種試劑盒線性關系良好、靈敏度和準確度高，在檢出限、選擇性、重復性和變異性等方面符合產品說明書要求。對豬肝、豬肉和牛肉中沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺的測定方便快捷，更具有針對性。

參考文獻：

[1] STOLKER A A M, ZOONTJES P W, van GINKELL L A. The use of super critical fluid extraction for the determination of steroids in animal tissues[J]. The Analyst, 1998, 123: 2671-2676.

[2] DAESELEIRE E, VANDEPUTTE R, van PETEGHEM C. Validation of multiresidue methods for the detection of anabolic steroids by GCMS in muscle tissues and urine samples from cattle[J]. The Analyst, 1998, 123: 2595-2598.

[3] 邱陽生, 楊根海, 何方洋. β-興奮劑沙丁胺醇及其檢測技術研究進展[J]. 動物醫學進展, 2002, 23(4): 50-52. DOI:10.3969/ j.issn.1007-5038.2002.04.013.

[4] 翟福麗, 賴克強, 張衍亮, 等. 動物性食品中β-興奮劑殘留概述[J]. 食品科學, 2011, 32(5): 351-356.

[5] 農業部. 禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種錄[B]. 2002-02-09.

[6] 農業部. 獸藥管理條例實施細則[B]. 1988-06-30.

[7] 農業部. 關于嚴禁非法使用獸藥的通知[B]. 1997-03-25.

[8] 張改平, 王選年, 肖肖. 瘦肉精的毒害作用及其試紙快速檢測技術[J]. 中國動物檢疫, 2011, 28(5): 1-6. DOI:10.3969/j.issn.1005-944X.2011.05.001.

[9] MITCHELL G A, DUNNAVAN G. Illegal use of beta-adrenergic agonists in the United States[J]. Journal of Animal Science, 1998, 76(1): 208-211.

[10] 趙思俊, 鄭增忍, 曲志娜, 等. 瘦肉精的危害及監管檢測技術[J].中國動物檢疫, 2011, 28(4): 1-4. DOI:10.3969/j.issn.1005-944X.2011.04.001.

[11] 路平, 肖肖, 張衍海, 等. 我國“瘦肉精”監管現狀分析及對策建議[J]. 中國動物檢疫, 2011, 28(4): 4-6. DOI:10.3969/j.issn.1005-944X.2011.04.002

[12] 朱龍佼, 劉萍, 周子瑩, 等. 全自動化學發光免疫分析儀及配套研發試劑盒質量的評價[J]. 農業生物技術學報, 2014, 22(5): 651-660. DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2014.05.014.

[13] ZHANG S, ZHANG Z, SHI W, et al. Development of a chemiluminescent ELISA for determining chloramphenicol in chicken muscle[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(16): 5718-5722.

[14] ZHANG C, WANG S, FANG G, et al. Competitive immunoassay by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence for the trace detection of chloramphenicol in animal-derived foods[J]. Electrophoresis, 2008, 29(16): 3422-3428.

[15] 農業部. 關于加強獸藥殘留檢測試劑(盒)管理的通知[B]. 2005-01-21.

[16] 國家食品藥品監督管理總局. YY/T 1183—2010 酶聯免疫吸附法檢測試劑(盒)[S]. 北京: 中國標準出版社, 2010.

[17] 伏慧明, 郭展旗, 王翠英, 等. 獸藥殘留檢測中試劑盒的驗證評判方法研究[J]. 中國農業科技導報, 2008, 10(增刊2): 109-111. DOI:10.3969/j.issn.1008-0864.2008.z2.024.

[18] 何田田, 薛強, 段潛, 等. 氯霉素ELISA檢測試劑盒評價技術[J]. 食品科技, 2013, 38(2): 311-314.

[19] 蔣文曉. 動物性食品中喹惡林類藥物代謝物和磺胺類-喹諾酮類藥物多殘留免疫分析方法研究[D]. 北京: 中國農業大學, 2014.

[20] 尹偉偉. 萊克多巴胺、氯霉素、三聚氰胺藥物殘留的酶聯免疫檢測法的建立[D]. 濟南: 山東大學, 2010.

[21] 金茂俊. 農藥殘留檢測的熒光和化學發光免疫分析方法研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2009.

[22] 李霜, 薛強, 李莉, 等. 三聚氰胺ELISA檢測試劑盒評價研究[J]. 食品科技, 2014, 39(1): 317-321.

[23] 姚焱, 吳海珍, 陳鍵. 化學發光酶免疫分析(CLEIA)法測定豬肌肉組織中的氯霉素含量[J]. 農業災害研究, 2012, 2(2): 42-44.

[24] 何方洋, 方華林, 羅曉琴, 等. 克侖特羅CLEIA試劑盒與ELISA試劑盒的比較分析[J]. 浙江農業學報, 2013, 25(6): 1360-1363. DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2013.06.34.

[25] 高彬文, 張素霞, 梁永紅, 等. 化學發光免疫分析法檢測豬尿中萊克多巴胺殘留[J]. 中國畜牧獸醫, 2009, 36(8): 27-29.

Evaluation of Three β-Adrenergic Agonist Chemiluminescence Enzyme Immunoassay Detection Kits

Key words:salbutamol; clenbuterol hydrochloride; ractompaine; chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA); kit; evaluation method

Abstract:In this study, three commercially available β-adrenergic agonist chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA) detection kits were evaluated in term of regression curve, sensitivity, specificity, detection limit, accuracy, reproducibility and inter-assay coefficients of variation. The validated test between CLEIA and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) was done. This work established a methodology for the quality evaluation of CLEIA test kits. The results showed that three detection kits all had good linearity. Their sensitivities for three β-adrenergic agonists, salbutamol, clenbuterol hydrochloride and ractompaine, were 0.7, 1.8, and 1.0 ng/mL, and the corresponding limits of detection (LODs) were 0.2, 0.1, and 0.2 ng/mL, respectively. The recovery rates from spiked pork liver, pork and beef were between 81.9% and 115.2%. The reproducibility and inter-assay coefficients of variation were 3.3%–9.7% and 9.9%–16.5%, respectively. Cross-reactivity rate was in compliance with the product specification requirements. The three kits can be used in detection of salbutamol, clenbuterol hydrochloride and ractompaine residues in pork liver, pork and beef.

收稿日期：2015-08-13

作者簡介：寧霄（1985—），女，助理研究員，碩士，研究方向為食品及化妝品質量控制。E-mail：xiao200730079@hotmail.com

*通信作者：曹進（1970—），男，研究員，博士，研究方向為食品及化妝品質量控制。E-mail：caojin@tsinghua.org.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612043

中圖分類號：TS207

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0238-05