高效液相色譜-紫外雙波長同時測定咖啡及咖啡制品中10種化合物含量

邵金良，楊東順，樊建麟，劉興勇，杜麗娟，王 麗，劉宏程,*，汪祿祥,*（.云南省農業科學院質量標準與檢測技術研究所，云南 昆明　650223；2.農業部農產品質量安全風險評估實驗室（昆明），云南 昆明　650223）

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高效液相色譜-紫外雙波長同時測定咖啡及咖啡制品中10種化合物含量

邵金良1,2，楊東順1，樊建麟1，劉興勇1，杜麗娟1，王 麗1，劉宏程1,2,*，汪祿祥1,*
（1.云南省農業科學院質量標準與檢測技術研究所，云南 昆明650223；2.農業部農產品質量安全風險評估實驗室（昆明），云南 昆明650223）

摘 要：建立高效液相色譜-紫外雙波長測定咖啡及咖啡制品中葫蘆巴堿、5-咖啡酰奎寧酸、咖啡因、綠原酸、4-咖啡酰奎寧酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、1,5-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸含量的方法。樣品用甲醇-0.10%磷酸溶液（50∶50，V/V）作為提取溶劑經超聲波提取，過聚四氟乙烯濾膜后在Shiseido CAPCELL PAK MGⅡC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）上，以甲醇-0.10%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，選擇254 nm和320 nm雙波長進行目標化合物的檢測。10種化合物在0.10～100.0 mg/L范圍內具有良好的線性關系，相關系數（r）不小于0.999，檢出限為0.05～0.10 mg/kg，定量限為0.16～0.28 mg/kg。在20、40、100 mg/kg添加量的加標回收率為80.00%～113.8%，相對標準偏差在3.63%～9.10%之間。該方法操作簡單、重復性和穩定性好，適合咖啡及咖啡制品中10種化合物同時測定及定量分析。

關鍵詞：高效液相色譜；紫外雙波長；咖啡及咖啡制品；多酚類化合物；生物堿類化合物

引文格式：

邵金良, 楊東順, 樊建麟, 等. 高效液相色譜-紫外雙波長同時測定咖啡及咖啡制品中10種化合物含量[J]. 食品科學, 2016, 37(12): 128-133. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612022. http://www.spkx.net.cn

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咖啡（Coffea spp.）是茜草科（Rubiaceae）、咖啡屬（Coffea）常綠灌木或小喬木[1]，與茶葉、可可并稱為世界3大飲料，咖啡具有獨特醇厚的香味，含大量的活性成分而具有減肥、提神醒腦、利尿、抗氧化等保健功效，被越來越多的消費者所喜愛[2]。綠原酸（咖啡酸與奎尼酸形成的酯）、咖啡因和胡蘆巴堿是咖啡中獨特的次生代謝產物[3]。咖啡中發現存在多種綠原酸的同分異構體，具有抗氧化、抗腫瘤、保肝利膽、清除自由基等功效[4-5]。咖啡含有咖啡因和葫蘆巴堿[6]，咖啡因是一種黃嘌呤生物堿化合物，又稱為1,3,7-三甲基黃嘌呤，對心腦血管系統、消化系統、腫瘤化療的生化調節、神經官能癥和偏頭痛等有一些積極作用[7-8]，是咖啡中較為重要的風味物質[9]。葫蘆巴堿（3-碳酸-N-甲基吡啶）為尼克酸甲基化的產物，是植物體內的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸代謝或轉化而產生的，具有降血糖、抗腫瘤等作用，其含量與咖啡品種、生長環境和加工工藝有關[10-11]。生咖啡豆在焙炒加熱過程中，綠原酸、葫蘆巴堿、多糖、脂肪和蛋白質等發生不同程度的美拉德、Strecker降解、焦糖化等化學反應，生成吡嗪類、呋喃類、吡咯類、吡喃類和吡啶類化合物，還有大量的醛類、酮類、酚類、酯類、醇類化合物，這些復雜的化合物形成咖啡的特征風味[12-14]。

關于葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因等化合物的分析國內外均有報道，檢測方法主要有高效液相色譜法[15-17]、毛細管電泳-電化學檢測法[18-19]、高效液相色譜-質譜法[20-22]和分光光度法[23]等。但是采用高效液相色譜法同時測定咖啡及其咖啡制品中葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因含量的研究報道比較少。云南具有緯度低、海拔高、晝夜溫差大等獨特優勢，特別適合咖啡的生長，其種植的咖啡具有口味層次多樣化的優點，是全國最大的咖啡生產和出口基地[24-27]。受氣候和土壤等環境因素的影響，不同產地咖啡其葫蘆巴堿、咖啡因和綠原酸含量有一定的差異性。本實驗采用高效液相色譜-紫外雙波長同時測定咖啡及咖啡制品中葫蘆巴堿、5-咖啡酰奎寧酸、咖啡因、綠原酸、4-咖啡酰奎寧酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、1,5-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸的含量，方法可為評價咖啡及其相關產品的品質質量提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

速溶咖啡粉購于本地超市；生咖啡豆和烘焙咖啡豆粉碎后過60 目篩，備用。

葫蘆巴堿、5-咖啡酰奎寧酸、咖啡因、綠原酸、4-咖啡酰奎寧酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、1,5-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸對照品（經高效液相色譜峰面積歸一化法測定，純度質量分數大于98%）成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜級）德國Merck公司；Millipore-Q超純水。

e2695-2489高效液相色譜儀（在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、2489紫外檢測器）、Empower 3色譜數據工作站美國Waters公司；JJ200電子分析天平江蘇省常熟市雙杰測試儀器廠；KQ500-E型超聲清洗器江蘇昆山市超聲儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1高效液相色譜條件

色譜柱為Shiseido CAPCELL PAK MGⅡC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；進樣量10.0 μL；柱溫35.0 ℃；葫蘆巴堿和咖啡因的檢測波長為254 nm，5-咖啡酰奎寧酸、綠原酸、4-咖啡酰奎寧酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、1,5-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸檢測波長為320 nm；流動相A為甲醇，流動相B為0.10%磷酸溶液；流速1.00 mL/min；梯度洗脫程序為：0～20 min，12%～30% A，20～50.0 min，20%～50% A，50～55 min，50%～12% A。樣品過聚四氟乙烯濾膜后再進樣。

1.2.2對照品溶液的配制

分別準確稱取葫蘆巴堿、5-咖啡酰奎寧酸、咖啡因、綠原酸、4-咖啡酰奎寧酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、1,5-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸的對照品10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，得到單一對照品溶液，然后分別量取上述對照品溶液1 mL于10 mL容量瓶中并用甲醇定容，得到綠原酸、5-咖啡酰奎寧酸、4-咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸和1,5-二咖啡酰奎寧酸質量濃度分別為100 mg/L的混合對照品溶液，4 ℃儲存，備用。

1.2.3樣品前處理

1.2.3.1浸泡過夜

稱取0.50 g咖啡樣品，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL甲醇-0.10%磷酸溶液（50∶50，V/V），室溫條件下浸泡24 h后，過0.45 μm濾膜，待測。

1.2.3.2振蕩提取

稱取0.50 g咖啡樣品，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇-0.10%磷酸溶液（50∶50，V/V），室溫條件下振蕩提取30 min，靜置，將上清液轉入25 mL容量瓶中，樣品殘渣再用20 mL甲醇-0.10%磷酸溶液（50∶50，V/V），提取1 次，合并2 次提取液，用甲醇-0.10%磷酸溶液（50∶50，V/V）定容至25 mL，過0.45 μm濾膜，待測。

1.2.3.3熱浸提

稱取0.50 g咖啡樣品，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇-0.10%磷酸溶液（50∶50，V/V），80 ℃水浴加熱提取30 min，靜置，將上清液轉入25 mL容量瓶中，樣品殘渣再用20 mL甲醇-0.10%磷酸溶液（50∶50，V/V），提取1 次，合并2 次提取液，冷卻后用甲醇-0.10%磷酸溶液（50∶50，V/V）定容至25 mL，過0.45 μm濾膜，待測。

1.2.3.4超聲波提取

稱取0.50 g咖啡樣品，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇-0.10%磷酸溶液（50∶50，V/V），室溫條件下超聲（功率200 W、頻率40 kHz）提取10 min，靜置，轉移定容于50 mL容量瓶中；繼續加入20 mL甲醇-0.10%磷酸溶液（50∶50，V/V）到250 mL具塞錐形瓶中，室溫條件下超聲（功率200 W、頻率40 kHz）提取10 min，靜置，合并濾液到25 mL容量瓶中，定容，過0.45 μm濾膜，待測。

2　結果與分析

2.1提取條件優化

葫蘆巴堿和咖啡因易溶于水，但綠原酸及其7種同分異構體在水中的溶解度比較小。用流動相作為提取溶劑不僅提取完全，而且干擾組分少，溶劑干擾小。因此，本實驗選擇用流動相作提取溶劑。采用經過日內和日間穩定性測試得到10種成分固定參考值的焙炒咖啡粉為試樣，分別按照1.2.3節所述4種處理方法提取10種成分并測定其含量，分別計算其提取率。圖1表明：4種提取方式對10種成分的平均提取率超聲波提取（95.59%）＞熱浸提（78.87%）＞振蕩提取（60.56%）＞浸泡過夜（47.22%）。超聲波提取具有快速簡單、能耗低、提取完全等優點；綠原酸在酸性介質（pH 2.0～4.0）中的穩定性較好，但在較高溫度條件下會加速其分子中酯鍵的水解[28]，為保證綠原酸在提取過程中不被破壞且提取完全，本實驗采用2 次超聲波間歇提取作為10種待測化合物的提取方法。目前測定咖啡中的咖啡因和葫蘆巴堿含量，一般加入輕質氧化鎂[29]、磺基水楊酸或者醋酸鋅＋亞鐵氰化鉀作為蛋白沉淀劑。實驗發現，加入蛋白沉淀劑后，對葫蘆巴堿和咖啡因含量影響較小，但對綠原酸及其同分異構體含量影響比較大，可能綠原酸不溶于水，蛋白沉淀劑在沉淀蛋白質過程中，包裹了綠原酸周圍的水不溶性顆粒，形成了帶電大分子膠體，吸附了綠原酸及其7種同分異構體。所以本實驗直接采用甲醇-0.10%磷酸溶液（50∶50，V/V）作為提取溶劑，經0.45 μm水相濾膜過濾后直接上機測定。

圖1　不同提取方法的比較Fig. 1　Comparison of different extraction methods

2.2流動相的優化

葫蘆巴堿為極性的水溶性酸，在反相C18柱上有弱的保留。為了提高葫蘆巴堿在反相C18柱上的保留，需要在流動相中添加酸、緩沖鹽或者離子對試劑[11]。綠原酸的同分異構體含多個酚羥基，溶液呈酸性，堿性條件易被氧化，流動相中添加適當的酸性成分，不僅能防止拖尾改善峰形，還能抑制其水解和氧化褐變。目前測定綠原酸、咖啡因和葫蘆巴堿的流動相有乙腈-磷酸溶液、乙腈-甲酸溶液、甲醇-冰乙酸溶液和甲醇-磷酸溶液等。結果表明：1）采用乙腈-磷酸溶液和乙腈-甲酸溶液作為流動相，流動相中乙腈的比例對8種綠原酸同分異構體的保留行為影響很大，無論怎么調整乙腈比例，很難實現1,5-二咖啡酰奎寧酸和3,4-二咖啡酰奎寧酸分離；2）采用甲醇-冰乙酸溶液作為流動相，葫蘆巴堿、5-咖啡酰奎寧酸、咖啡因、綠原酸、4-咖啡酰奎寧酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸6種化合物分離效果良好，但是1,5-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸和4,5-二咖啡酰奎寧酸保留時間延長，分離效果不好，峰形差；3）采用甲醇-磷酸溶液作為流動相，10種化合物對磷酸選擇性良好，該色譜條件下，目標化合物與其他雜峰分離度良好；4）進一步比較甲醇-0.10%磷酸溶液、甲醇-0.20%磷酸溶液和甲醇-0.30%磷酸溶液對10種化合物色譜分離行為的影響，結果表明，改變流動相的pH值對葫蘆巴堿、咖啡因和綠原酸8種同分異構體的保留時間影響較小，綜合考慮各被測成分的分離效果及色譜峰峰形，最終確定甲醇-0.10%磷酸溶液結合梯度洗脫程序，能保證10種待測化合物的完全分離，基線比較平滑，10種化合物混合標準溶液和速溶咖啡空白樣品的色譜圖見圖2。

圖2　標準品（A）和速溶咖啡空白樣品（B）高效液相色譜圖Fig. 2　HPLC chromatograms of standards (A) and blank instant coffee (B)

2.3檢測波長的選擇

通過配制一定質量濃度的標準溶液，確定葫蘆巴堿和咖啡因的最大吸收波長為254 nm，5-咖啡酰奎寧酸、綠原酸、4-咖啡酰奎寧酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、1,5-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸和4,5-二咖啡酰奎寧酸的最大吸收波長320 nm。由于綠原酸的8種同分異構體與葫蘆巴堿和咖啡因的最大吸收波長相差比較大，在波長320 nm處，低質量濃度的葫蘆巴堿和咖啡因紫外吸收很低，故采用紫外雙波長同時檢測模式進行分析測定。因分析的10種化合物中，綠原酸的同分異構體居多，選擇320 nm作為測定的第1檢測波長，5-咖啡酰奎寧酸、綠原酸、4-咖啡酰奎寧酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、1,5-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸和4,5-二咖啡酰奎寧酸也具有較大的吸收，檢測靈敏度足以達到分析要求。以葫蘆巴堿和咖啡因的最大吸收波長254 nm作為第2檢測波長對葫蘆巴堿和咖啡因進行檢測。紫外雙波長檢測技術保證各組分的含量差別和檢測靈敏度，實現同一色譜條件下不同性質化合物的同時測定和準確定量。

2.4線性范圍、檢出限和定量限測定結果

用流動相配制葫蘆巴堿、5-咖啡酰奎寧酸、咖啡因、綠原酸、4-咖啡酰奎寧酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、1,5-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸質量濃度均為0.05、0.10、0.50、1.0、2.0、5.0 mg/L和10.0 mg/L的混合標準溶液。在優化后的測定條件下進行測定，分別以峰目標化合物的峰面積（y）對目標化合物的質量濃度（x）做工作曲線，葫蘆巴堿、5-咖啡酰奎寧酸、咖啡因、綠原酸、4-咖啡酰奎寧酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、1,5-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸在0.05～10.0 mg/L范圍內有良好的線性關系，滿足測定的要求。方法的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限見表1。10種化合物在0.10～100.0 mg/L范圍內具有良好的線性，相關系數（r）≥0.999，檢出限為0.05～0.10 mg/kg，定量限為0.16～0.28 mg/kg。

表1　線性范圍、線性回歸方程和相關系數Table 1 Linear ranges, linear regression equations and correlation coefficients for 10 compounds

2.5回收率與精密度實驗結果

表2　方法的回收率和精密度（n=5）Table 2 Recovery and precision (RSD) of the method (n=5)

對已知10種成分含量的速溶咖啡粉樣品進行低、中、高3種不同質量分數（20、40 mg/kg和100 mg/kg）的加標回收實驗，每個添加水平做5 組平行實驗。表2結果表明，10種化合物的回收率為80.00%～113.8%，相對標準偏差為3.63%～9.10%。

2.6樣品測定結果

對收集的3 份咖啡及咖啡制品樣品，分別測定葫蘆巴堿、5-咖啡酰奎寧酸、咖啡因、綠原酸、4-咖啡酰奎寧酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、1,5-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸10種化合物的含量，結果見表3。結果表明，咖啡及咖啡制品中均能檢測出10種化合物，生咖啡豆中的10種化合物含量高于焙炒咖啡豆，速溶咖啡粉的含量最低；速溶咖啡粉和焙炒咖啡豆中咖啡因含量較高，生咖啡豆中綠原酸含量較高，咖啡因含量次之。

表3　咖啡及咖啡制品中10種成分的質量分數Table 3 Contents of 10 components in coffee and processed coffee products

3　結 論

建立了生咖啡豆、焙炒咖啡豆、速溶咖啡粉等咖啡及咖啡制品中葫蘆巴堿、5-咖啡酰奎寧酸、咖啡因、綠原酸、4-咖啡酰奎寧酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、1,5-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸10種化合物高效液相色譜-紫外雙波長測定方法。在保證各化合物充分分離前提條件下，為縮短分析時間，在Shiseido CAPCELL PAK MGⅡC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）上，以甲醇-0.10%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，選擇254 nm 和320 nm雙波長進行目標化合物的檢測。10種化合物在0.10～100.0 mg/L范圍內具有良好的線性關系，相關系數（r）≥0.999，檢出限為0.05～0.10 mg/kg，定量限為0.16～0.28 mg/kg。在20、40、100 mg/kg添加量的加標回收率為80.00%～113.8%，相對標準偏差在3.63%～9.10%之間。采用一次提取和色譜分離雙波長進行10種不同性質化合物含量的測定，咖啡及咖啡制品中均能檢測出10種化合物，生咖啡豆中的10種化合物含量高于焙炒咖啡豆，速溶咖啡粉的含量最低；速溶咖啡粉和焙炒咖啡豆中咖啡因含量較高，生咖啡豆中綠原酸含量較高，咖啡因含量次之。本方法具有操作簡便、靈敏度高、選擇性好、試劑用量少等優點。

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Simultaneous Determination of 10 Polyphenolic and Alkaloidal Components in Coffee and Coffee-Based Products by HPLC-Double Wavelength UV Detection

SHAO Jinliang1,2, YANG Dongshun1, FAN Jianlin1, LIU Xingyong1, DU Lijuan1, WANG Li1, LIU Hongcheng1,2,*, WANG Luxiang1,*
(1. Institute of Agriculture Quality Standards and Testing Technique, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming650223, China; 2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-Products (Kunming), Ministry of Agriculture, Kunming650223, China)

Abstract:The aim of this study was to establish a method for the simultaneous determination of polyphenolic compounds including neochlorogenic acid, chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, cynarin, 1,5-dicaffeoylquinic acid, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C and alkaloidal compounds including caffeine and trigonelline in coffee and coffee-based products. These 10 components were extracted ultrasonically with 0.10% phosphoric acid solutionmethanol (50:50, V/V) and then analyzed by high performance eliquid chromatography (HPLC) at 254 nm and 320 nm. The chromatographic separation was performed on a Shiseido CAPCELL PAK MGⅡC18（4.6 mm × 250 mm, 5.0 μm） by using 0.10% phosphoric acid solution-methanol as the mobile phase. The average recoveries of the 10 analytes in spiked samples ranged from 80.00% to 113.8%, with relative standard deviations (RSDs) of 3.63%–9.10%. The calibration curves for these analytes were linear in the range of 0.10–100.0 mg/L with correlation coefficients of more than 0.999. The limits of detection (LODs) varied from 0.05 to 1.0 mg/kg and the limits of quantitation (LOQ) ranged from 0.16 to 0.28 mg/kg for 10 polyphenolic and alkaloidal components. The method showed good repeatability, accuracy and stability and enabled the accurate quantification of 10 polyphenolic and alkaloidal components in coffee and coffee-based products.

Key words:HPLC; double UV wavelengths; coffee and coffee-based products; polyphenolic compounds; alkaloidal compounds

收稿日期：2015-09-08

基金項目：農業部2014年農業行業標準制定和修訂項目；云南省科技惠民專項（農業）重點項目（2014RA054）；云南省科技創新平臺建設計劃（公共科技服務）項目（2014DA001）；云南省農業科學院農產品質量與食品安全省創新團隊計劃項目（2015HC025）

作者簡介：邵金良（1979—），男，副研究員，碩士，研究方向為農產品質量安全與分析檢測。E-mail：shaojinliang@126.com

*通信作者：劉宏程（1975—），男，研究員，博士，研究方向為農產品質量安全與風險評估。E-mail：liuorg@163.com汪祿祥（1966—），男，研究員，碩士，研究方向為農產品質量安全與品質評價。E-mail：wangluxiang@sina.com.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612022

中圖分類號：TS207.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0128-06