Optimization of Fermentation Process for HalotolerantBacillussubtilisTGBio-1433

(Taigu Biotechnology Limited Liability Company in Hunan Province/ Key Laboratory of Plant Nutrient and Bio-fertilizer, Ministry of Agriculture, Changsha 410205, China)

YI Zi-ting, LUO Zhi-wei, XU Tao-ming, ZHOU Fang-ru, FENG Lai*

?

Optimization of Fermentation Process for HalotolerantBacillussubtilisTGBio-1433

(Taigu Biotechnology Limited Liability Company in Hunan Province/ Key Laboratory of Plant Nutrient and Bio-fertilizer, Ministry of Agriculture, Changsha 410205, China)

Abstract：Fermentation medium and conditions ofBacillussubtilisTGBio-1433 were investigated, in order to obtain a higher concentration of bacteria, the fed-batch fermentation ofBacillussubtilisTGBio-1433 were also explored. The results showed that the optimal combination for fermentation was as follows: corn flour 10 g/L, soybean meal 20 g/L, glucose 15 g/L, peptone 15 g/L, beef paste 5 g/L, MgSO41 g/L, CaCO37 g/L. The optimum for fermentation conditions was as follows: the initial pH 7.0～7.5, incubation temperature 35 ℃, incubation time18～20 h , inoculums concentration 5%. Fed-batch fermentation process was as follows: after 16 h fermentation, adding carbon and nitrogen source (glucose∶peptone ∶beef paste = 3∶3 ∶1) 15% of the total one-off. The concentration ofBacillussubtilisTGBio-1433 from the original 24.2×108cfu/mL up to 136.1×108cfu/mL.

Key words：Halotolerant microorganism; Fermentation optimization; Fed-batch fermentation;Bacillussubtilis

由于特定氣候、地質條件造成我國鹽漬土壤眾多，而生態破壞、不合理的灌溉方式又加劇了土壤鹽化[1]。如何利用這些鹽漬化土壤發展可持續農、林業，是目前我國亟待解決的問題。

在利用水利工程措施、化學改良措施等傳統方法改良鹽漬化土壤的同時, 研究者已經普遍認識到生物修復是最有效的改良方式之一[2]。20世紀70年代初，相關研究表明耐鹽菌能增強作物耐鹽性[3]。微生物菌肥中含有大量的有益微生物和有機質，有機質在分解過程中產生的有機酸，能夠改善土壤理化性質、提升土壤微生物活性，是改良鹽漬化土壤的有效途徑之一[4]。其中，枯草芽孢桿菌是植物根際土壤微生物的優勢種群[5]，在植物促生長、病害防治以及土壤修復方面都有天然優勢[6-7]。本文研究了一株分離于微生物菌肥生產過程的耐鹽枯草芽孢桿菌發酵條件，為進一步的產品開發奠定了基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌種耐鹽枯草芽孢桿菌TGBio-1433，由農業部植物營養與生物肥料重點實驗室分離和保存。

1.1.2主要原料玉米粉、豆粕粉均為市售，過60目篩。

1.1.3培養基活化培養基：NA培養基；種子液培養基：活化培養基中除去瓊脂。基礎發酵培養基：玉米粉10 g/L、豆粕粉20 g/L、MgSO41 g/L、CaCO37 g/L。

1.1.4儀器設備大容量全溫振蕩器DHZ-D，雙人凈化工作臺SW-CJ-2D，生化培養箱LRH-150。

1.2實驗方法

1.2.1發酵培養基優化在基礎發酵培養基中添加優質碳、氮源，采用單因素實驗和正交實驗對添加的碳、氮源種類含量進行優化；對發酵液進行稀釋平板計數，測定活菌數；以活菌數的多少作為培養基優化評判標準。

1.2.2發酵條件的優化

1.2.2.1接種量對生長量的影響選取3%、5%、7%、9%接種量，在35 ℃、pH 7.0、140 r/min搖瓶下培養24 h，測定發酵液活菌數。

1.2.2.2培養溫度對生長量的影響選取30、32、35、37 ℃ 4個溫度，在pH 7.0、140 r/min搖瓶下培養24 h，測定發酵液活菌數。

1.2.2.3起始pH對生長量的影響將起始pH分別設為6.5、7.0、7.5、8.0，在35 ℃、140 r/min搖瓶下培養24 h，測定發酵液活菌數。

1.2.2.4培養時間對生長量的影響接種6 h后，毎2 h取樣測定發酵液活菌數，接種量3%，在35 ℃、pH 7.0、140 r/min搖瓶下培養。

1.2.3補料分批發酵優化

1.2.3.1不同含量補料液對生長量的影響在發酵進入對數期后，進行碳、氮源的一次性補加，補料量分別為培養基中碳、氮源總含量的5%、10%、15%、20%，碳、氮源組成為發酵培養基優化中選定的碳、氮源，對照不進行補加。調整起始發酵培養基中碳、氮源含量和培養基體積，使得補料后，培養基碳、氮源總含量、培養基總體積相同。發酵結束后測定發酵液活菌數。

1.2.3.2不同補加時間對生長量的影響在確定補料量后，在發酵對數期中選取3個時間點進行補料，發酵結束后測定發酵液活菌數。

2結果與分析

2.1發酵培養基優化

2.1.1添加不同碳源對耐鹽枯草芽孢桿菌發酵水平的影響在培養基中分別添加5 g/L葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉，以基礎發酵培養基為對照，發酵24 h后測定發酵液活菌數。

如圖1所示，添加碳源葡萄糖的發酵液活菌數最高，其次為蔗糖，再次為可溶性淀粉，3種碳源對耐鹽枯草芽孢桿菌發酵水平均有不同程度的提高。雖然蔗糖、可溶性淀粉是相對廉價的生產原料，但葡萄糖對耐鹽枯草芽孢桿菌發酵24 h活菌數的提高，遠遠大于蔗糖、可溶性淀粉，因此，選擇葡萄糖作為耐鹽枯草芽孢桿菌的最佳碳源。

2.1.2添加不同氮源對耐鹽枯草芽孢桿菌發酵水平的影響在培養基中分別添加5 g/L蛋白胨、牛肉膏、酵母粉，以基礎發酵培養基為對照，發酵24 h后測定發酵液活菌數。

如圖2所示，添加氮源牛肉膏的發酵液活菌數最高，其次為蛋白胨，再次為酵母粉。添加蛋白胨、牛肉膏對耐鹽枯草芽孢桿菌發酵液活菌數提高程度非常相近。考慮到碳、氮源之間可能存在交互作用，因此，選擇蛋白胨、牛肉膏與葡萄糖進行正交試驗。

圖1　不同碳源對耐鹽枯草芽孢桿菌生長量的影響

圖2　不同氮源對耐鹽枯草芽孢桿菌生長量的影響

2.1.3正交優化實驗試驗選擇了葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏3個因素作為研究對象。設計了4因素3水平的正交試驗L9(3)4，優化耐鹽枯草芽孢桿菌發酵培養基。試驗中設定葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏的3個水平均為0.5%、1.0%、1.5%。

按正交表L9(3)4進行了發酵優化試驗，試驗結果如表1所示。根據表1進行極差比較和水平、組合選優，得出以下結果：3個因素的極差大小關系為：|R|葡萄糖>|R|牛肉膏>|R|蛋白胨>|R|空白。由此可得出，葡萄糖對耐鹽枯草芽孢桿菌的發酵水平影響最大，其次為牛肉膏，再次是蛋白胨。

比較葡萄糖3個水平發酵液平均活菌數，發現x3最大，所以選擇1.5%水平為最優；同理牛肉膏選擇0.5%水平為最優；蛋白胨選擇1.5%水平為最優。所以得到的最優組合為：A3B1C3，即玉米粉10 g/L、豆粕粉20 g/L、葡萄糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、牛肉膏5 g/L、MgSO41 g/L、CaCO37 g/L。在此最優培養基上能收獲最大的耐鹽枯草芽孢桿菌生物量。

2.2發酵條件優化

2.2.1接種量對生長量的影響由圖3可知，當接種量為5%時，發酵液活菌數最大，因此，耐鹽枯草芽孢桿菌最適接種量為5%。

表1　L9(3)4正交試驗結果

圖3　不同接種量對耐鹽枯草芽孢桿菌生長量的影響

2.2.2溫度對生長量的影響由圖4可知，在30～35 ℃溫度范圍內，隨著發酵溫度的升高，發酵液活菌數升高。在35 ℃時，發酵液活菌數最大，高于35 ℃時，發酵液活菌數出現略微下降，因此，耐鹽枯草芽孢桿菌的最適發酵溫度為35 ℃。

2.2.3起始pH對生長量的影響由圖5可知，調節起始發酵pH在7.0～7.5范圍內有利于收獲高密度的耐鹽枯草芽孢桿菌活菌。

2.2.4培養時間對生長量的影響由圖6可知，在耐鹽枯草芽孢桿菌搖瓶發酵過程中，8～18 h為對數生長期，18 h以后開始進入穩定生長期。因此，為了獲得最大活菌數，縮短發酵周期，選擇18～20 h培養時間為宜。

2.3補料分批發酵優化

2.3.1不同含量補料液對生長量的影響由圖7可知，對數期補加不同含量補料，耐鹽枯草芽孢桿菌發酵液活菌數均較對照45.2×108cfu/mL有所提高。其中補料量為15%時，發酵液活菌數最高，達123.1×108cfu/mL，是對照的2.7倍，因此，發酵進入對數期后補料量為15%時，對耐鹽枯草芽孢桿菌發酵最好。

圖4　不同溫度對耐鹽枯草芽孢桿菌生長量的影響

圖5　不同起始pH值對耐鹽枯草

圖6　不同培養時間對耐鹽枯草芽孢桿菌生長量的影響

2.3.2不同補加時間對生長量的影響由圖8可知，在對數生長期選取的3個補料時間8、12、16 h中，發酵16 h后補料發酵液活菌數最高，為136.1×108cfu/mL。

3結論

對1株耐鹽枯草芽孢桿菌進行了發酵培養基、發酵條件優化，通過稀釋平板計數法測定其培養20 h后的活菌數，以活菌數的高低作為評價培養基優劣的指標。優化后的培養基為：玉米粉10 g/L、豆粕粉20 g/L、葡萄糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、牛肉膏5 g/L、MgSO41 g/L、CaCO37 g/L；培養條件為：起始pH 7.0～7.5，發酵溫度35 ℃，培養時間18～20 h，接種量5%；耐鹽枯草芽孢桿菌發酵液活菌數由優化前的24×108cfu/mL提高到55×108cfu/mL。

圖7　不同補料量對耐鹽枯草芽孢桿菌生長量的影響

圖8　不同補料時間對耐鹽枯草芽孢桿菌生長量的影響

為了獲得更高密度的活菌數，采用補料分批發酵技術，在發酵進入對數生長期后補加碳、氮源(葡萄糖∶蛋白胨∶牛肉膏=3∶3∶1)，補加量為總量的15%，補加方式為發酵16 h后一次性補加，耐鹽枯草芽孢桿菌發酵液活菌數由分批培養的24.2×108cfu/mL提高到136.1×108cfu/mL。

目前，補料發酵已經被越來越多地應用，是進行高密度發酵的一個重要技術手段。在補料發酵過程中，前期可減少高濃度底物的反饋抑制，后期又能補充充足的營養生產生物量或產物。在此基礎上，研究者又探索了分段補料[8]、間歇補料[9]等發酵方式，來進一步精細控制發酵過程，最大化提高產物量。

參考文獻：

[1] 鄧紹云,邱清華.中國鹽堿土壤修復研究綜述[J].北方園藝,2011(22):171-174.

[2] 孫薊鋒,王旭.土壤調理劑的研究和應用進展[J].中國土壤與肥料,2013(1):1-7.

[3] 曲發斌,于明禮,張柱岐，等.鹽生植物根際耐鹽堿微生物的篩選及其降解特性[J].貴州農業科學,2015,43(3):121-124.

[4] 艾雪,王藝霖,張威，等.柴達木沙漠結皮中耐鹽堿細菌的分離及其固沙作用研究[J].干旱區資源與環境,2015,29(10):145-451.

[5] 杜傳英,李海濤,劉榮梅,等.東北地區耐鹽芽孢桿菌篩選統計及初步鑒定[J].生物技術通報,2014(10):179 -187.

[6] 賈均輝,鄭宇,楊青娟，等.生防枯草芽孢桿菌B579補料分批發酵工藝優化[J].山東農業大學學報:自然科學版,2013,44(1):35 -39.

[7] 錢風光,陳守文,蔡皓.生防菌枯草芽孢桿菌BS-5在3L發酵罐中的發酵工藝優化[J].中國生物防治,2009,25(1)：74-78.

[8] 薛學東,李志敏,李偉,等.補料分批發酵過程中的兩階段發酵生產1,3-丙二醇[J].工業微生物,2011,41(3):7-11.

[9] 冷云偉,徐根娣,趙梅,等.分批補料乙酸發酵條件的研究[J].徐州工程學院學報,2009,24(4):19-23.

(責任編輯：許晶晶)

YI Zi-ting, LUO Zhi-wei, XU Tao-ming, ZHOU Fang-ru, FENG Lai*

關鍵詞：耐鹽微生物；發酵優化；補料分批發酵；枯草芽孢桿菌

摘要：對1株耐鹽枯草芽孢桿菌TGBio-1433培養基、培養條件進行了優化；為了獲得更高的菌體濃度，還探索了枯草芽孢桿菌TGBio-1433補料分批發酵工藝。試驗結果表明，最優培養基為：玉米粉10 g/L、豆粕粉20 g/L、葡萄糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、牛肉膏5 g/L、MgSO41 g/L、CaCO37 g/L。最優培養條件為：起始pH 7.0～7.5，發酵溫度35 ℃，培養時間18～20 h，接種量5%補料分批發酵工藝為：發酵16 h后，一次性補加碳、氮源(葡萄糖∶蛋白胨∶牛肉膏=3∶3∶1)總量的15%。枯草芽孢桿菌TGBio-1433發酵液活菌數由最初的24.2×108cfu/mL提高到136.1×108cfu/mL。

收稿日期：2015-10-28

作者簡介：易子霆(1989—)，男，湖南邵陽人，碩士，主要從事資源微生物篩選與利用方面研究。*通訊作1株耐鹽枯草芽孢桿菌TGBio-1433發酵工藝優化易子霆，羅志威，徐滔明，周芳如，豐 來*者：豐來。

中圖分類號：Q939.9

文獻標志碼：A

文章編號：1001-8581(2016)06-0105-04

(湖南泰谷生物科技股份有限公司/農業部 植物營養與生物肥料重點實驗室，湖南 長沙 410205)