油茶優良無性系‘閩43’和‘閩60’果實發育過程中油脂積累規律研究

陳俊杰　湯佳　陳輝　鄭國華　鄭鈺銦　劉國敏

摘 要 以油茶優良無性系‘閩43和‘閩60所產果實為試材，研究油茶果實生長發育過程中油脂積累規律。結果表明，‘閩43和‘閩60種子中乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）和磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性均在9月至果實成熟期間快速上升，基本上與種子內油脂合成的高峰期相吻合，ACCase和PPase活性與種子中粗脂肪含量均呈顯著正相關，表明油茶種子內ACCase和PPase活性促進了油脂合成。兩無性系種子的粗脂肪含量與可溶性蛋白含量呈顯著正相關，與還原糖含量呈極顯著負相關，與可溶性淀粉含量呈極顯著正相關。可見油脂的積累伴隨著蛋白質與糖類的代謝、分解與轉化，推測一部分的蛋白質和糖類可被代謝轉化形成油脂。

關鍵詞 油茶；果實生長發育；油脂積累；油脂合成相關酶

中圖分類號 S606.2 文獻標識碼 A

油茶（Camellia oleifera Abel.）屬山茶科山茶屬常綠小喬木或灌木，廣義上油茶泛指山茶屬中油脂含量較高并具有一定栽培面積的物種，與油棕、油橄欖、椰子并稱為“世界四大木本食用油料植物”[1-2]。油茶極具利用價值，其果實中的茶籽榨取的茶油色清而味香。茶油中亞油酸和亞麻酸的含量比例為4 ∶ 1，是營養學界里最佳配比的“腦黃金”。茶油的脂肪酸結構和比例與橄欖油極其相似，有“東方橄欖油”的美稱[3]。

油脂是木本食用油料植物果實的主要成分，因此含油量成為評價油料植物果實品質的重要指標。Mahmood等對112個芥菜型油菜DH系進行研究，發現油脂含量與蛋白質含量呈顯著負相關[4]。目前，對于油茶果實的研究大多集中在與果實含油量相關的影響因子[5-6]、成熟果實脂肪酸組成分析[7-9]、果實病蟲害防治[10-12]、油茶果實表型性狀的變異[13-16]以及采后生理[17-19]等幾個方面，對油茶果實采前生理即生長發育過程的系統研究較少。本文以福建省油茶主栽無性系‘閩43和‘閩60為材料，研究油茶果實生長過程中油脂積累的變化規律，旨在揭示油茶果實生長發育及油脂轉化的特點，為栽培實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為福建省2個普通油茶優良無性系‘閩43和‘閩60所產的果實，這2個無性系種植于福建省閩侯縣桐口國有林場油茶種質資源圃，和其它無性系一起采用完全隨機區組試驗，每個無性系10株為一小區，共3個區組。該林場地處E 119°17'、N 26°05'，氣候溫和，雨量充沛，海拔高度約為100 m，適宜油茶生長。課題組前期已對這兩個無性系的果實形態性狀進行了測定[20]。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集方法 2014年4月1日至11月9日，對各無性系果實進行觀察和取樣測定。選取樹體特征與生長條件基本一致的無病蟲害植株，在晴朗或陰天的上午10 ： 00左右定期連續采樣，共采樣12次。7月10日之前每隔30 d采1次，7月10日之后油脂合成逐漸增多，適當縮短取樣時間，每隔15 d采集1次，直至果實完全成熟。在油茶種質資源圃中每個區組隨機采集3個植株的果實，每個植株從東南西北4個方向采收生長發育期接近、無病蟲害的果實各10個。采摘的油茶果實用干冰帶回實驗室，立即敲碎分離果皮和種子，待種皮硬化后剝離，將種子用液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2.2 粗脂肪及果實營養成分的測定 粗脂肪的測定采用索氏抽提法，參照陳永忠等[21]的方法。可溶性糖、蔗糖的測定參考張志良等[22]的方法。可溶性蛋白、還原糖的測定參照王學奎[23]的《植物生理生化實驗原理和技術》，其中可溶性蛋白采用考馬斯亮藍G-250染色法；可溶性淀粉的測定參照宗學鳳等[24]的蒽酮比色法。

1.2.3 乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）活性的測定

參照楊若琳等[25]的方法稍作改進。稱3 g鮮樣，切碎于研缽中，加入少量石英砂后再加入5 mL預冷的提取Buffer快速研磨，轉入50 mL離心管，于研缽中再加入5 mL預冷的提取Buffer將殘余的樣品全部轉移至離心管內，4 ℃條件下靜置2 h。將靜置后的勻漿液離心30 min（4 000 r/min，4 ℃），留清液棄沉淀。將上清液繼續離心30 min（10 000 r/min，4 ℃），棄去沉淀，保留上清液，即為待測液，轉入1.5 mL的離心管內備用。應用植物乙酰輔酶A羧化酶（ACC）酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒的說明方法對ACCase的活性進行測定。

1.2.4 磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性的測定

參照西北農業大學的實驗指導測定[26]，酶活性以每小時每毫克蛋白質產生的P的毫克數，單位為mg/（g·h）。

1.3 數據處理

利用Excel 2003軟件對數據進行處理繪圖。用SPSS 20.0軟件進行方差分析、多重比較和相關分析。

2 結果與分析

2.1 粗脂肪含量變化

油茶‘閩43與‘閩60果實粗脂肪含量的動態變化如圖1所示，果皮和種子中粗脂肪含量變化差異大，果皮中粗脂肪含量整體水平較低。‘閩43果皮中粗脂肪含量在8月9日前甚微，8月9日后緩慢增多，9月10日達到最大值2.94%，此后逐漸下降；種子中粗脂肪含量在6月10前含量同樣甚微，幾乎無測出，7月10日后開始緩慢增加，9月26日后粗脂肪含量開始急劇上升，在果實成熟時達到最大值45.05%。‘閩60果皮中粗脂肪含量在7月26日前幾乎無測出，在8月9日達到最大值1.90%，此后逐漸下降；種子中粗脂肪含量在9月10日前均處于較低水平，9月10日后幾乎呈線性上升直至果實成熟，成熟時果實粗脂肪含量為43.48%。總體上，可以看出油茶果實中脂肪的積累主要在種子中，且油茶種子中粗脂肪的積累主要在生長的中后期，這與大多數的油料植物種子中脂肪的積累規律相近。

2.2 乙酰輔酶A羧化酶活性變化

油茶‘閩43與‘閩60果實內ACCase活性的動態變化如圖2所示，兩無性系果皮中ACCase活性變化幅度較小，維持在較低水平波動。‘閩43種子中ACCase活性在7月26日前與果皮基本一致，處在較低水平，7月26日之后酶活性開始緩慢上升，9月26日后開始急劇上升，果實成熟時達到最大值2 929.19 U/L。而‘閩60種子中ACCase活性在9月10日前與果皮基本一致，處于較低水平波動變化，9月10日之后酶活性開始呈近似線性快速上升，直至果實成熟時達到最大值2 157.68 U/L。

2.3 磷脂酸磷酸酯酶活性變化

油茶‘閩43與‘閩60果實內PPase活性的動態變化如圖3所示，兩無性系果皮中PPase活性變化幅度較小，維持在較低水平，總體上呈下降趨勢。‘閩43種子中PPase活性在7月26日前處在較低水平，且呈緩慢下降趨勢，7月26日之后酶活性開始急劇上升，果實成熟時達到最大值60.30 mg/（g·h）。而‘閩60種子中PPase活性在8月9日前與果皮基本一致，穩定在較低水平，8月9日之后酶活性開始呈近似線性快速上升，直至果實成熟時達到最大值83.96 mg/（g·h）。

2.4 油茶果實生長發育期間脂類合成酶與粗脂肪的相關性分析

‘閩43和‘閩60果皮和種子中ACCase活性和PPase活性與粗脂肪的相關性分析如表1所示。由表1可見，兩無性系果皮中ACCase活性均與粗脂肪含量呈正相關，但相關系數不大；而兩無性系果皮中PPase活性均與粗脂肪含量呈負相關，其中‘閩43果皮中PPase活性與粗脂肪含量呈顯著負相關（p<0.05）。兩無性系種子中ACCase活性均與粗脂肪含量呈極顯著正相關（p<0.01）；PPase活性也均與粗脂肪含量達到極顯著正相關（p<0.01）。表明油茶種子中高活性的ACCase和PPase極大促進粗脂肪的合成。

2.5 油茶果實生長發育期間粗脂肪與其它果實性狀的相關性分析

為了探討油茶果實中油脂積累與其它果實性狀的相關關系，在‘閩43和‘閩60果實粗脂肪含量迅速增加到峰值期間，對果形、可溶性糖、蔗糖、還原糖、可溶性淀粉、可溶性蛋白含量的動態變化與種子中粗脂肪含量進行了相關分析。由表2可以看出，兩無性系種子的粗脂肪含量均與可溶性蛋白含量呈顯著正相關（p<0.05），與還原糖含量呈極顯著負相關（p<0.01），與可溶性淀粉含量呈極顯著正相關（p<0.01）。其中，‘閩60種子中粗脂肪含量與果形指數呈顯著負相關（p<0.01）。

3 討論與結論

本試驗結果表明，兩無性系均表現為果皮粗脂肪含量遠低于種子中粗脂肪含量，表明油茶果實中種子含油量占極大份額。‘閩43果實比‘閩60更早開始油脂的合成，但兩無性系油脂合成的高峰期均主要集中在9月10日至果實成熟期間。

油脂的合成起始于ACCase催化乙酰-CoA生成丙二酰-CoA，ACCase是催化脂肪合成的限速酶。三酰甘油是通過二酰甘油轉化生成的，而二酰甘油的形成得益于PPase的催化作用[27]。本試驗發現，‘閩43和‘閩60果皮中ACCase和PPase活性均穩定于低水平范圍，而種子中ACCase和PPase活性均在9月至果實成熟期間快速上升，基本上與種子內油脂合成的高峰期相吻合，此期間ACCase和PPase活性與種子中粗脂肪含量的正相關都達到極顯著水平，表明油茶種子內ACCase和PPase是參與油脂合成代謝的調節酶，在果實生長發育過程中，其活性的大小可以促使粗脂肪含量發生變化。同時，在此期間兩無性系種子的粗脂肪含量與可溶性蛋白含量呈顯著正相關（p<0.05），與還原糖含量呈極顯著負相關（p<0.01），與可溶性淀粉含量呈極顯著正相關（p<0.01）。油脂的積累伴隨著蛋白質與糖類的代謝、分解與轉化，推測一部分的蛋白質和糖類在油脂轉化過程中形成油脂，這與張凌云等[28]的研究結果相吻合。而‘閩60種子中粗脂肪含量與果形指數呈顯著負相關（p<0.01），表明果形指數可作為此品種果實采集的一個標準。

通過比較可以發現，在油脂合成高峰期，‘閩43種子內ACCase活性水平（1 339.19 ～2 929.19 U/L）顯著大于‘閩60（1 161.66～2 157.68 U/L），這大概也是引起兩油茶無性系種子粗脂肪含量差異的主要原因之一。油脂的生物合成是由數十種酶共同參與，除了ACCase和PPase外，還有許多其他酶對油脂的合成過程具有調節作用，如植物脂肪酸合酶系統（FAS）和植物脂酞ACP脫飽和酶等，本文僅初步探索了油茶果實中ACCase和PPase活性的變化，而油脂轉化和積累過程中相關的其他酶及其作用還需進一步深入研究。

參考文獻

[1] 馬小煥. 油茶油的研究現狀及其應用前景[J]. 綠色科技， 2013， （12）： 116-117.

[2] 莊瑞林. 中國油茶（第2版）[M]. 北京： 中國林業出版社， 2008.

[3] 柏云愛， 宋大海， 張富強， 等. 油茶籽油與橄欖油營養價值的比較[J]. 中國油脂， 2008， 33（3）： 39-41.

[4] Mahmood T， Rahman M H， Stringam G R， et al. Identification of quantitative trait loci（QTL）for oil and protein conents and their relationships with other seed quality traits in Brassica juncea[J]. Theor Appl Genet， 2006， 113： 1 211-1 220.

[5] 陳永忠， 王湘南， 彭邵鋒， 等. 植物生長調節劑對油茶果實含油率的影響[J]. 中南林業科技大學學報（自然科學版）， 2007， 27（1）： 25-29.

[6] 劉 偉， 陳世品， 陳 輝， 等. 土壤養分與油茶產量與種仁含油率的相關性研究[J]. 中南林業科技大學學報， 2015， 35（3）： 59-63.

[7] 靳高中， 姚小華， 任華東， 等. 騰沖紅花油茶產量及脂肪酸組成變異研究[J]. 江西農業大學學報， 2012， 34（3）： 492-498.

[8] 王小藝， 曹一博， 張凌云， 等. 油茶生長發育過程中脂肪酸成分的測定分析[J]. 中國農學通報， 2012， 28（13）： 76-80.

[9] 王湘南， 陳永忠， 伍利奇， 等. 油茶種子含油率和脂肪酸組成研究[J]. 中南林業科技大學學報， 2008， 28（3）： 11-17.

[10]何立紅， 李志文， 劉勁軍， 等. 油茶象危害與小果油茶果實特征的相關性[J]. 林業科學， 2014， 50（12）： 151-155.

[11] 董傳媛. 油茶炭疽病的發生與植株內含物和酶活性關系的研究[D]. 合肥： 安徽農業大學， 2009.

[12] 董傳媛， 曹志華， 束慶龍， 等. 油茶果皮內含物以及緩沖容量與炭疽病的關系研究[J]. 安徽農業大學學報， 2013， 40（5）： 146-149.

[13] 劉子雷， 姚小華， 楊水平， 等. 浙江紅花油茶果實經濟性狀變異的研究[J]. 西南大學學報（自然科學版）， 2007， 29（4）： 83-88.

[14] 杜洋文， 鄧先珍， 周偉國， 等. 油茶長林品種引進及綜合評價[J]. 林業科技開發， 2014， 28（3）： 96-100.

[15] 丁曉綱， 張應中， 陳清鳳， 等. 廣寧紅花油茶果實性狀的遺傳變異規律[J]. 經濟林研究， 2012， 30（2）： 23-27.

[16] 周志美， 任華東， 俞新水， 等. 騰沖紅花油茶果實形態劃分及經濟性狀差異[J]. 林業科技開發， 2013， 27（5）： 67-69.

[17] 季志平. 漚置后油茶果實內物質的轉化和積累[J]. 經濟林研究， 1991， 9（2）： 53-56.

[18] 黃佳聰， 闞 歡， 萬曉軍， 等. 騰沖紅花油茶果實成熟度及堆漚處理對油產量及其品質的影響[J]. 林業科學研究， 2012， 25（5）： 612-615.

[19] 梁文斌， 譚益民， 佘祥威， 等.催裂劑對油茶果采后生理效應與品質的影響[J]. 中南林業科技大學學報， 2010， 30（8）： 72-77.

[20] 湯 佳， 馮金玲， 楊志堅， 等. 油茶果實內源激素變化與果實發育的關系[J]. 森林與環境學報， 2015， 35（4）： 331-336.

[21] 陳永忠， 肖志紅， 彭邵鋒， 等. 油茶果實生長特性和油脂含量變化的研究[J]. 林業科學研究， 2006， 19（1）： 9-14.

[22] 張志良， 瞿偉菁. 植物生理學實驗指導[M]. 北京： 高等教育出版社， 2005.

[23] 王學奎. 植物生理生化實驗原理和技術（第2版）[M]. 北京： 高等教育出版社， 2006.

[24] 宗學鳳， 王三根. 植物生理研究技術[M]. 重慶： 西南師范大學出版社， 2011.

[25] 楊若琳， 楊 敏， 張 芬， 等. 油莎豆葉片發育過程中乙酰輔酶A羧化酶活性與脂肪酸含量的變化及其相關性分析[J]. 新疆農業科學， 2013， 50（10）： 1 902-1 907.

[26] 西北農業大學. 基礎生物化實驗指導[M]. 西安： 陜西科學技術出版社， 1986.

[27] 劉 泉. 引進油橄欖果肉油脂積累規律及相關合成酶活性的研究[D]. 成都： 四川農業大學， 2012.

[28] 張凌云， 王小藝， 曹一博. 油茶果實糖含量及代謝相關酶活性與油脂積累關系分析[J]. 北京林業大學學報， 2013， 35（4）： 55-60.