真菌誘導子對龍眼胚性愈傷組織生長和多糖積累的影響

徐小萍　賴瑞聯　林玉玲　賴鐘雄

摘 要 為探討真菌誘導子對龍眼胚性愈傷組織生長及多糖含量的影響。以龍眼胚性愈傷組織為材料，采用單因素分析法探究了真菌誘導子種類、誘導時間和濃度對龍眼胚性愈傷組織生長和多糖積累的影響。結果表明，不同真菌誘導子處理下龍眼胚性愈傷組織中多糖含量由高到低排序分別為：龍眼擬莖點霉>膠孢鐮刀菌>尖孢鐮刀菌；采用100 mg/L濃度的龍眼擬莖點霉誘導子誘導15 d，龍眼胚性愈傷組織多糖含量最高，比對照提高了61.34%，且不同處理間存在顯著差異。但真菌誘導子處理下龍眼胚性愈傷組織生長狀態較差，且增殖率顯著下降。龍眼擬莖點霉作為龍眼病原內生菌，其活性誘導物能促進龍眼胚性愈傷組織中多糖積累，從而一定程度上提高植物的免疫防御能力。研究結果為探究真菌誘導子對龍眼多糖合成和代謝機理的研究奠定基礎。

關鍵詞 龍眼；真菌誘導子；多糖；胚性愈傷組織；增殖

中圖分類號 S667.2 文獻標識碼 A

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是中國南方熱帶亞熱帶名貴果樹。研究表明，龍眼果肉、果皮及枝葉等各組織器官中含有大量多糖[1-3]，尤其是龍眼果肉多糖成分具有較高的生物藥理活性，其含量高達64.27%，極具開發前景。多糖是生物體中重要初生代謝物質，具有清除自由基、調節免疫系統、抗癌抗菌和抑制酪氨酸酶等生化功能[4-5]。作為一種重要活性成分，多糖還能增強神經功能、治療神經損傷、降血糖和抗腫瘤作用[6-8]。然而，以果肉等組織器官為原材料提取龍眼多糖易受季節、氣候等因素限制，開發一種高效多糖生產技術具有重要的現實意義。

龍眼胚性愈傷組織具有較強的增殖和體細胞胚胎發生能力，為龍眼藥用活性成分的研究生產提供了有效平臺[9-10]。且大量研究表明，植物愈傷組織在多糖生產中具有很好的應用前景[11-13]。因此，筆者認為研究龍眼胚性愈傷組織中的多糖積累有重要意義。真菌誘導子是來自微生物的生物活性物質，能使植物產生過敏反應，并誘導植物積累特定的次生代謝產物[14]，提高植物的防御抗病能力。植物多糖在特定條件下參與某些次生代謝物合成，多糖合成代謝可能受真菌誘導子影響[15-16]，探究龍眼的致病內生真菌與非龍眼內生菌分別制備的誘導子對提高龍眼胚性愈傷組織多糖積累的影響有重要意義。研究表明龍眼果肉中可分離獲得龍眼擬莖點霉、鐮刀菌和炭疽菌，其中龍眼擬莖點霉分離率最高，達44%，其他2種分離率較低[17]。筆者推測真菌誘導子對龍眼胚性愈傷組織多糖誘導具有重要作用。因此，本試驗以龍眼胚性愈傷組織為材料，以3種真菌制備的誘導子為處理因子。采用單因素分析方法研究不同真菌誘導子種類、誘導時間和處理濃度對胚性愈傷組織生長和多糖積累的影響，并通過相關性和顯著性分析，為真菌誘導子對龍眼多糖合成代謝、信號識別和信號轉導等作用機理的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

龍眼‘紅核子（Dimocarpus longan Loμr. cv.Honghezi）胚性愈傷組織由福建農林大學園藝植物生物工程研究所提供[18]。3種真菌分別是龍眼擬莖點霉（Phomopsis longanae Chi）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、膠孢鐮刀菌（Fusarium subglutinans Wollenw. et Reinking），均由福建農林大學植物保護學院贈送。

1.2 方法

1.2.1 不同種類誘導子處理龍眼胚性愈傷組織

參考Wang等[19]、林艷君等[20]的方法，獲得3種真菌誘導子。往龍眼胚性愈傷組織增殖培養基L1分別添加100 mg/L的3種真菌誘導子處理龍眼胚性愈傷組織，暗培養20 d，通過多糖含量測定篩選最適宜的誘導子類型。

1.2.2 不同誘導時間和誘導子濃度處理龍眼胚性愈傷組織 試驗進一步采用單因素法分別探究處理15、20、25 d后龍眼胚性愈傷組織多糖積累情況，并設置對照試驗；其次在最適宜天數處理試驗的基礎上，結合前人研究報道[20]，分別采用0、50、100、200 mg/L濃度的誘導子進行最佳濃度篩選。每個處理進行3個重復，分別采用苯酚硫酸法進行多糖含量測定[21]、愈傷組織狀態觀察和增殖系數統計。

1.2.3 標準曲線制作及多糖測定 稱取0.1 g蔗糖干樣作為標準品，溶解定容至1 000 mL，依次稀釋成不同倍數的濃度，以紫外分光光度計在485 nm波長下測定的吸光值為縱坐標，以糖濃度為橫坐標，利用吸光值與總糖量成線性關系，制作多糖含量標準曲線如圖1，線性回歸方程為y=0.018 3x+0.004 6，相關系數R2=0.999 8。

多糖提取測定，采用苯酚硫酸法。稱取龍眼胚性愈傷組織干樣0.03 g，加1 mL的雙蒸水，沸水浴30 min，7 800 r/min常溫離心10 min，取上清液后重復該步驟2次，雙蒸水漂洗殘渣，離心，定容至10 mL；加5 mL石油醚，臺式恒溫振蕩器常溫200 r/min，10 min；靜置分層，棄上層溶液，下層溶液加2 mL氯仿 ∶ 正丁醇（5 ∶ 1）溶液，混勻至乳濁狀，靜置分層；取50 μL上層溶液，雙蒸水定容至2 mL；加1 mL 9%苯酚溶液，搖勻，加5 mL濃硫酸，搖勻。室溫下冷卻靜置30 min，紫外分光光度計485 nm波長測定吸光值。多糖含量計算公式：多糖含量（%）=X/（M/V1）*V2/V3×100%。其中X：樣品中多糖濃度（mg/mL），M：樣品質量g，V1：首次樣品定容的體積10 mL，V2：稀釋時吸取的樣品體積50 μL，V3：稀釋后定容的體積2 mL，見圖1。

1.3 數據統計

采用Excel 2003進行數據統計和圖表制作，并采SPSS20.0進行相關分析、方差分析和顯著性測驗。

2 結果與分析

2.1 真菌誘導子對多糖含量的影響

2.1.1 真菌誘導子種類對多糖含量的影響 對所得數據進行方差齊性檢驗、單因素分析結合Duncan法進行兩兩比較，如表1，結果表明3種真菌誘導子中龍眼擬莖點霉誘導子對龍眼胚性愈傷組織中多糖含量的影響達到極顯著性水平（α=0.01），多糖含量高達15.29%，尖孢鐮刀菌誘導子不利于胚性愈傷組織多糖積累，膠孢鐮刀菌誘導子對多糖積累誘導效果不顯著。因此，選用龍眼擬莖點霉誘導子對龍眼胚性愈傷組織進行不同誘導天數和不同濃度的處理，進一步探究多糖含量的積累情況。

2.1.2 誘導時間對龍眼胚性愈傷組織多糖含量的影響

篩選出最適的誘導子種類后，試驗進一步對最適誘導時間進行篩選。結果表明，龍眼擬莖點霉誘導子處理15 d時，最能促進胚性愈傷組織多糖積累，處理25 d時對多糖積累也有促進作用，但積累量最少。經方差齊性檢驗、單因素方差分析、F檢驗及LSD多重比較數據分析表明，與對照相比，α=0.05顯著性水平下，龍眼擬莖點霉誘導子誘導不同時間對愈傷組織多糖積累具有顯著性影響。結合圖2分析，龍眼胚性愈傷組織在相同濃度不同誘導天數的龍眼擬莖點霉誘導子處理下，多糖含量隨誘導天數增加而減少，其中15 d時的多糖含量達到最高為17.99%，其次是20 d（14.27%），25 d時最低，僅為7.22%；與對照相比，多糖含量分別提高了61.34%、42.56%、12.04%?？梢?，龍眼胚性愈傷組織多糖積累與誘導時間密切相關，而15 d為最佳處理時間。

2.1.3 龍眼擬莖點霉誘導子濃度對多糖含量的影響

繼不同誘導天數處理后，進一步探究誘導子濃度對龍眼胚性愈傷組織多糖含量影響。結果表明100 mg/L龍眼擬莖點霉誘導子最能促進龍眼胚性愈傷組織多糖積累，其次是200 mg/L，多糖含量分別達到20.40%和19.92%，二者無顯著差異；而添加濃度為50 mg/L時對多糖積累作用不明顯（圖3），其他處理間的差異顯著性較為明顯。

2.2 龍眼擬莖點霉誘導子對龍眼胚性愈傷組織生長的影響

2.2.1 誘導時間對龍眼胚性愈傷組織生長的影響

用相同濃度100 mg/L龍眼擬莖點霉誘導子處理不同時間后，龍眼胚性愈傷組織生長情況如圖4、5所示。從形態上看，誘導20 d時胚性愈傷組織形態較松散淡黃，顆粒較小，15 d時愈傷組織形態松散淺黃，顆粒較小，可能是龍眼胚性愈傷組織正處于旺盛生長階段，25 d時形態較為緊實，出現顆粒化現象；25 d增殖系數最高，15 d時增殖系數較小，20 d時增殖系數相對較高處于中間水平。SPSS20.0分析可知，不同誘導天數的誘導子對龍眼胚性愈傷組織增殖生長均具有顯著性影響，且經誘導子處理后的龍眼胚性愈傷組織增殖系數整體較低，說明龍眼擬莖點霉誘導子明顯抑制龍眼胚性愈傷組織增殖生長。

2.2.2 誘導子濃度對龍眼胚性愈傷組織生長的影響

對不同濃度誘導子處理15 d時的龍眼胚性愈傷組織生長狀態和增殖系數進行分析（圖6和圖7）。從總體上看，與對照相比，不同濃度誘導子對龍眼胚性愈傷組織生長均有抑制作用。而50 mg/L的誘導子有利于龍眼胚性愈傷組織正常形態維持，200 mg/L的誘導子不利于龍眼胚性愈傷組織正常生長，100 mg/L的誘導子處理下龍眼胚性愈傷組織雖顆粒稍大，但色澤較為正常。方差齊次性檢驗得p=0.11，大于0.05，單因素方差分析的F檢驗中p=0，小于0.05，說明不同濃度誘導子對龍眼胚性愈傷組織增殖生長具有顯著性影響，且添加100和200 mg/L的誘導子對龍眼胚性愈傷組織增殖生長均有極顯著性差異，但100 mg/L誘導子相對抑制作用最小，增殖系數為4.94，與對照相比減小40.48%?？梢姡?0～200 mg/L的誘導子對龍眼胚性愈傷組織增殖生長均有抑制作用，而均衡多糖含量與龍眼胚性愈傷組織生長情況，選擇添加100 mg/L龍眼擬莖點霉誘導子，暗培養誘導15 d作為本試驗龍眼胚性愈傷組織多糖積累的最佳條件。

3 討論與結論

3.1 龍眼擬莖點霉誘導子促進龍眼胚性愈傷組織多糖積累

本試驗研究認為，龍眼擬莖點霉誘導子半活體營養型龍眼內生真菌，其活性誘導物能促進龍眼胚性愈傷組織中多糖含量的積累。白樺懸浮細胞中三萜系化合物會受擬莖點霉誘導子的影響[22]，進一步證實了真菌誘導子能有效促進植物次生代謝物合成。真菌誘導子能通過信號識別、信號轉導及信號轉錄介導的胞內應答等途徑，調控相關基因的表達進而影響植物次生代謝物積累。龍眼擬莖點霉誘導子來源于龍眼果肉致病內生菌-龍眼擬莖點霉[15]，該霉能產生細胞壁降解酶，降解細胞壁多糖，誘發龍眼果腐病[23-24]。陳藝輝等[25]研究發現龍眼擬莖點霉可以促進酚類物質積累使果皮褐變，病原菌侵染早期能引起果實細胞氧化迸發的應激反應，增強植物體免疫防御能力；多糖作為初生代謝產物，也是植物細胞壁主要成分，不僅能作為眾多植物次生代謝物合成前體，還具有免疫、防御及抗逆等相關功能[26]。龍眼擬莖點霉誘導子可能通過誘導調控龍眼胚性愈傷組織中某些病原抗性基因，在病原侵染初期通過合成多糖來提高植物自身的免疫防御能力，這與江曙等[27]研究的明黨參內生真菌能顯著促進明黨參多糖積累一致。

研究表明，生物誘導子具有高效、專一及濃度效應等特點[28-29]。本試驗認為龍眼擬莖點霉誘導子較其他2種非龍眼內生真菌誘導子更能顯著提高龍眼胚性愈傷組織多糖含量。尖孢鐮刀菌誘導子對龍眼胚性愈傷組織多糖積累有一定抑制作用，與劉長軍等[30]的研究結論并不一致，可能由于同種誘導子響應植物中同種次生代謝物合成的細胞受體的結合位點存在差異。也可能通過鈣調素、磷酸肌醇、G蛋白等誘導信號，以IP3-DAG-Ca2+/PKC系統、腺苷酸環化酶調節的cAMP/PKA胞內信號傳導的第二信使傳遞系統，影響次生代謝物合成相關基因的表達，改變次生代謝通路，從而調節次生代謝物積累[31]。因此，研究龍眼本身致病內生菌的生物活性物質適當的誘導時間、濃度及添加時間對龍眼本身多糖和次生代謝物的積累具有重要意義。

3.2 龍眼擬莖點霉誘導子抑制龍眼胚性愈傷組織生長

試驗中，添加100 mg/L龍眼擬莖點霉誘導子時發現，龍眼愈傷組織增殖生長抑制率達40.48%，這與陶金華等[32]研究的100 mg/L內生真菌抑制茅蒼術細胞生長結果類似。誘導子對次生代謝物調節具有特異性，同時由于誘導產生的抗毒素對細胞自身大多具有毒性，濃度過高有可能抑制細胞生長。且粗誘導物中誘導子的活性成分和拮抗成分相互制約，加量少時拮抗作用小，誘導作用也小，反之亦然。

在前人的研究中，劉長軍等[30]研究發現尖孢鐮刀菌誘導子在西洋參懸浮細胞培養前期能促進細胞生長，而Zhu等[33]發現蛋白類誘導子在促進靈芝酸合成的同時抑制了細胞生長?？梢?，誘導子促進細胞生長與次生代謝物合成還可能和誘導子本身的活性成分種類有關，其可能和細胞間信號傳導、基因表達調控等機制有關，這與添加非生物因子如激素、光質、營養物質等因素對次生代謝物的誘導有所不同[34]。試驗研究結果可為在龍眼細胞組織培養生產中提高多糖含量提供科學依據。

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