外源IBA對裸花紫珠插穗營養物質含量及抗氧化酶活性的影響

李晨晨　周再知　張金浩　梁坤南　馬華明　黃桂華

摘 要 以藥用植物裸花紫珠（Callicarpa nudiflora）一年生半木質化枝條為材料，使用吲哚丁酸（IBA，1 500 mg/L）處理插穗，以清水為對照，每隔6 d取樣1次，測定生根過程中插穗基部可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白含量及吲哚乙酸氧化酶（IAAO）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）活性的動態變化。結果表明，扦插后0～12 d，1 500 mg/L IBA處理增加了插穗內可溶性蛋白含量，降低了淀粉含量，可溶性糖含量先降后升，IAAO、POD、PPO活性增加；扦插后12～30 d，淀粉及可溶性糖含量逐漸降低，可溶性蛋白含量先升后降，但仍都高于對照，IAAO和PPO活性逐漸下降，POD活性先降后增；扦插30 d后，可溶性糖、蛋白、淀粉含量逐步趨于穩定，IAAO活性趨于穩定，而PPO和POD活性逐漸降低。總之，較高濃度的可溶性糖、可溶性蛋白，低濃度的淀粉，較高的IAAO、POD和PPO活性有利于裸花紫珠插穗不定根形成和發育。

關鍵詞 扦插繁殖；營養物質；抗氧化酶活性；IBA處理

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A

裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.）為馬鞭草科（Verbenaceae）紫珠屬（Callicarpa）植物，國內主要分布在福建、廣東、廣西、海南等省區[1]。全株可入藥，具有抗菌、止血、消炎、解毒、收斂等功效，藥用價值高、應用范圍廣[2]。近年來，種植面積不斷擴大，對苗木的需求不斷增大。由于裸花紫珠采種期短且種子不宜儲藏、發芽率較低的緣故[3]，扦插繁殖成為主要的繁殖手段。

外源激素類物質被廣泛用于植物的扦插繁殖，特別是IAA和IBA，對不定根的誘導和發生起調控作用[4-5]。一些研究表明，扦插生根過程中，插穗內的營養物質含量及抗氧化酶活性與不定根形成密切相關。茅林春等[6]研究發現，經IBA處理后的梅（Prunus mume Sieb）插穗在不定根發生和生長過程中，可溶性糖含量和生根率呈顯著的正相關，而淀粉含量和生根率呈顯著的負相關。趙云龍等[7]對糙葉杜鵑（Rhododendron scabrifoliu）扦插研究發現，外源激素可顯著的促進插穗內可溶性糖的增加，有利于插穗不定根的形成。外源激素類物質對插穗內過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性產生顯著影響[8-10]。魏海蓉等[11]對甜櫻桃（Prunus avium）矮化砧‘吉塞拉 6號研究發現，外源IBA處理能夠提高生根率，其主要原因是提高了PPO、POD活性，降低了IAAO活性。

外源IBA處理可顯著提高裸花紫珠扦插生根率[12]。 周再知等[13]采用4種IBA濃度處理裸花紫珠插穗，確定了1 500 mg/L IBA濃度下生根效果最佳，揭示了此濃度下，插穗內源激素IAA、ABA、GA和ZR含量隨生根進程的變化規律。對扦插過程中，插穗營養物質含量和相關氧化酶活性的變化規律尚不明確。本研究的目的是探究外源IBA（1 500 mg/L）處理下，裸花紫珠扦插生根過程中，插穗的可溶性糖、淀粉及可溶性蛋白含量以及POD、PPO和IAAO活性的變化規律，進一步揭示其不定根的形成機理，為裸花紫珠的扦插繁殖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

從海南五指山采集野生裸花紫珠的種子，播種育苗。2年生時，選用生長健壯、無病蟲害的當年生半木質化枝條。截取中部，制成長度9～11 cm，具2～3個芽眼，上端為平口、保留兩側半片葉，下端斜切接近馬蹄形的插穗。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 采用單因素完全隨機區組設計，設置2個IBA濃度（0和1 500 mg/L）處理，每個區組重復3次，每處理小區插穗100條。以泥炭 ∶ 蛭石 ∶ 河沙=2 ∶ 1 ∶ 1的體積比配置混合扦插基質。扦插前2 d，將其裝入長540 mm×寬280 mm×深110 mm規格50穴苗盤內，并用0.5%的高錳酸鉀進行淋灌消毒。將制備好的插穗每50條扎成1捆，用質量百分比為0.1%的高錳酸鉀溶液消毒1～2 min，取出用蒸餾水沖洗干凈。在IBA不同處理濃度溶液及清水中速蘸15 s，而后豎直插于上述穴盤中，深度3～4 cm。扦插后，澆水、覆蓋薄膜，每隔3 d交替噴灑質量百分比為0.1%的高錳酸鉀溶液和50%多菌靈可濕性粉劑500倍液消毒。20 d以后，仍按此濃度交替消毒，7 d 1次。保持扦插環境溫度在21～33 ℃之間，相對濕度在70%以上。

1.2.2 測定項目與方法 扦插后，每隔6 d，取樣1次，總共取樣8次。每個重復隨機抽取10～12條插穗，迅速用蒸餾水將基部沖洗干凈，濾紙擦干，然后置于冰盒內，帶回實驗室。迅速剝取穗條基部2～3 cm韌皮部，剪碎、混勻，經過液氮冷凍處理后，保存于-20 ℃的超低溫冰箱中。采用蒽酮比色法測定可溶性糖和淀粉含量；考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量；吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性和過氧化物酶（POD）活性的測定，參照植物生理學實驗指導[14]；采用鄰苯二酚比色法測定多酚氧化酶（PPO）活性，參照植物生理學實驗技術[15]。各測定項目材料均以鮮重（FW）計量。

2 結果與分析

2.1 裸花紫珠插穗生根過程中營養物質含量的變化

2.1.1 可溶性糖含量的變化 圖1表明，IBA（1 500 mg/L）處理下插穗基部可溶性糖含量，呈現出“下降-上升-下降”的趨勢。扦插后逐漸下降，第6天時降到谷值，降幅34.1%，6～12 d快速上升，12～18 d上升速度減緩，在第18天時達到峰值，增幅為40.7%。對照在扦插第6天后，插穗的可溶性糖含量持續下降，第12天時達到谷值，12～18 d上升較為緩慢，18～24 d上升速度加快，第24天時，達到峰值，增幅為41.0%。峰值之后，IBA處理的可溶性糖含量持續下降，第30天后，趨于平穩，而對照處理則延遲到第36天以后。第42天時，兩者的可溶性糖含量均維持在40.0 mg/g（以鮮重計，以下類同）左右。

2.1.2 淀粉含量的變化 由圖2可知，插穗的淀粉含量總體上均呈現平穩下降的趨勢，不同階段下降幅度有所不同。IBA（1 500 mg/L）處理插穗在扦插后0～12 d內淀粉含量大幅度下降，12～18 d時淀粉含量保持平穩，幾乎不變，接下來的第18～30天又快速下降，第30天時淀粉含量達到了最低值，之后開始緩慢上升。而對照插穗在0～12 d緩慢下降，而第12～24天則急劇下降，12～18 d時淀粉含量下降速率最大，降幅為28.6%，24～30 d時其含量趨于恒定，第30～36天出現小幅度的下降，之后也開始有所回升。

2.1.3 可溶性蛋白含量的變化 從圖3可以看出，扦插后的30 d內，IBA（1 500 mg/L）處理插穗的可溶性蛋白的含量始終高于對照。扦插后12 d，IBA（1 500 mg/L）處理插穗的可溶性蛋白含量大幅下降，第12天后開始回升，第18天時達到峰值，而后持續下降，在第36天時達谷值，降幅16.2%，之后又大幅度上升。而對照插穗在第12天后持續下降，在第18天時達到谷值，之后進入上升期，在第36天時達到峰值，然后又開始下降。

2.2 裸花紫珠插穗生根過程中抗氧化酶活性的變化

2.2.1 吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性變化 從圖4可以看出，IBA（1 500 mg/L）處理和對照插穗內IAAO酶活性大體上都呈現出先上升后下降最后趨于穩定的變化趨勢。IBA（1 500 mg/L）處理插穗的IAAO活性在扦插0～12 d急劇上升，升幅達172.5%，第12天后又大幅度下降，到第30天時出現低谷，降幅達48.1%，之后逐漸趨于平穩。對照處理插穗IAAO活性在扦插0～12 d出現小幅度降低的趨勢，12～18 d開始緩慢上升，18～24 d急劇上升并到達峰值，升幅126.9%，24 d之后逐漸降低，其降低的幅度越來越小，在第36天后趨于平穩。

2.2.2 過氧化物酶（POD）活性的變化 POD活性與扦插生根的關系密切，被一致認為是植物生根的標志性物質之一。IBA（1 500 mg/L）處理和對照插穗內POD活性隨扦插時間總體上呈先升高后降低的變化趨勢，在插穗生根的不同階段差別明顯（圖5）。整個扦插生根監測過程中，IBA（1 500 mg/L）處理插穗內的POD活性一直都高于對照處理，說明較高水平的POD活性可能會促進插穗生根。IBA（1 500 mg/L）處理插穗的POD活性在扦插后的6 d內變化不大，第6～12天時快速升高并于第12天時達到第1個峰值，增幅42.1%，12～18 d逐漸降低，第18天后又開始大幅度的升高，第30天時形成第2個峰值，此時也是整條變化曲線的最高點，比扦插前增加了124.1%，之后再次降低，到第42天時，已接近扦插前POD活性的水平。對照在扦插后6 d，POD活性急劇降低，在第24天活性到達最高值，之后其活性緩緩下降，但是變化幅度十分微小，第36天時POD活性到達第2個峰值，兩個峰值大小接近，36～42 d活性大幅降低。

2.2.3 多酚氧化酶（PPO）活性的變化 扦插過程中插穗內PPO活性變化見圖6。扦插前，插穗內PPO活性比較低，扦插后6 d內兩個處理PPO活性變化幅度都不大，但是IBA（1 500 mg/L）處理表現出升高趨勢，而對照則相反。IBA（1 500 mg/L）處理插穗的PPO活性在第6～12天急劇升高，第18天達到最大值，增幅60.8%，且比對照早12 d。之后PPO活性大幅度降低，第30天下降幅度變小至觀測結束。對照的PPO活性在第6～24天之間升高，且升高的幅度是逐漸變大的，第30天達到最大值，增幅39.0%，第30天之后持續下降，第42天所測的PPO活性水平與扦插時基本一致。

3 討論

3.1 扦插生根過程中營養物質含量的變化

魏海蓉等[11]用外源激素IBA（1 000 mg/L）處理甜櫻桃矮化砧‘吉塞拉6號（Gisela 6，Prunus cerasus × P. canescens）發現其插穗內可溶性糖含量隨生根進程呈現“升高-降低”的變化規律。而本研究發現，裸花紫珠插穗內可溶性糖含量隨生根進程呈現“下降-上升-下降”的變化規律。結合周再知等[13]對裸花紫珠扦插不定根形成階段的劃分，即扦插后0～12 d為皮內根原基誘導分化、愈傷組織形成期階段，12～30 d為不定根形成及發生階段，30 d以后為不定根伸長及發育階段，IBA（1 500 mg/L）處理的裸花紫珠插穗在不定根誘導分化期的前期（1～6 d），插穗內的可溶性糖含量大幅度下降，這可能是由于插穗基部呼吸作用增強、愈傷組織和根原始體形成消耗大量的能量和養分，及可溶性糖的消耗速度遠大于形成速度所致。在不定根誘導分化期的后期（6～12 d），可溶性糖含量快速回升，而對照依然在下降，這可能是外源IBA處理加快了插穗內淀粉水解成可溶性糖的緣故。在不定根的形成階段（12～30 d），插穗的可溶性糖逐漸降低，可能與生根過程中快速消耗大量能量有關；期間，盡管能量物質依然在快速水解，但是水解速度小于可溶性糖的消耗速度，這與多數人的研究結果一致[16-18]。

淀粉作為植物體內能量的儲藏形式，在植物生長的特殊階段可以轉化為可溶性糖，是插穗生根過程中主要的能量來源[19]。本研究發現，裸花紫珠在扦插生根過程中，淀粉含量呈逐漸下降的趨勢，主要是因為生根過程中消耗了大量的能量。IBA處理插穗在扦插后0～12 d內，淀粉含量大幅度下降，遠遠大于對照的下降速度，這可能與IBA處理可以增強插穗內某些糖類水解酶的活性，加強對淀粉的水解有關[20]。在不定的形成階段（12～30 d），IBA處理插穗內淀粉含量下降速度減緩，而對照開始出現大幅度下降，可能是因為IBA處理的插穗在不定根形成的過程中，地上部分已經長出部分新葉，通過光合作用，合成少量的淀粉和糖類，從而減緩了淀粉的水解速度，而對照的地上部分新葉形成和生長則相對遲緩。當插穗進入不定根伸長階段（30 d后），插穗根系生長較完全、新葉完全長出，插穗逐漸恢復光合能力，同化產物得以積累和運輸，多余的糖分轉化為淀粉，導致淀粉含量的升高。

可溶性蛋白是插穗總氮含量的主要組成部分且可以激活與生根有關的基因[21]。氮素類化合物不僅與根原始體形成有關，而且還能促進根和地上部分的生長[22]。雖然可溶性蛋白質只占總體蛋白質的一小部分，但是機體所能吸收的主要是可溶性蛋白，它在生命體活動中發揮著運輸協調、免疫保護、傳導神經活動等重要功能[23]。在裸花紫珠的生根過程中，其插穗內可溶性蛋白含量表現為“下降-上升-下降-上升”的變化趨勢，結合生根進程來看，前期的可溶性蛋白的大幅度降低主要是因為在不定根誘導階段，可能是可溶性蛋白大量轉化為細胞分裂和分化過程中所需要功能蛋白，為不定根的形成做準備，而后出現短期的上升可能是因為隨著根原基形成，插穗吸收能力增強且短期內消耗較小，可溶性蛋白合成較多的緣故。待不定根進入伸長期時，根部分生區需要大量的進行分裂分化，可溶性蛋白消耗大，導致含量下降，當插穗地上部分長出新葉后，光合能力逐漸恢復，光合產物增多，可溶性蛋白逐漸積累。

3.2 扦插生根過程中抗氧化酶活性的變化

IAAO是分解IAA的專一性酶，該酶利用氧氣來氧化IAA，并且與不定根的形成有關[24-26]。研究表明，難生根的樹種插穗內IAAO活性較低，對不定根的誘導及形成作用不明顯，而易生根的樹種插穗內IAAO活性高，可降低插穗IAA濃度，有利于誘導不定根的形成[27-28]。本研究發現 IAAO活性呈現出先上升后下降的趨勢。在裸花紫珠插穗不定根誘導階段（0～12 d），外源激素IBA處理大幅度提高了IAAO活性。裸花紫珠插穗的IAA含量在扦插6～12 d時，大幅下降[13]，這可能與高活性的IAAO有關。在不定根的形成階段（12～30 d），IAAO活性逐漸下降。IAAO活性的下降，致使插穗內IAA含量升高，有利于不定根的表達，促進根的伸長生長，這與王小玲等[29]用1 000 mg/L IBA處理四倍體刺槐（tetraploid Robinia pseudoacacia）硬枝進行扦插的研究結果一致，但是扈紅軍等[30]對歐榛（Corylus avellana）扦插研究表明，不定根表達期內，IAAO活性高有益于促進根的伸長。不同樹種在扦插生根過程中IAAO活性及其作用不同，比較復雜。

POD是一種存在于植物體內的含Fe卟啉輔基的酶，參與多種生理生化過程。POD活性與扦插生根密切相關，被普遍認為是植物生根的標志性物質之一。本試驗發現，經IBA處理的插穗生根過程中，POD活性呈現“上升-下降-上升-下降”的趨勢。且出現了兩個高度不同峰值，這與多數有關扦插生根過程中POD活性會有兩個高峰的結果一致[30-33]。第1個峰值出現在誘導期內，它的升高主要與抑制傷呼吸有關，傷呼吸產生大量的活性氧類物質（ROS），如O2-等，機體會產生大量的防御酶，例如超氧化物歧化酶，它能夠將O2-歧化為H2O2和O2，再由POD氧化為H2O和O2，從而避免活性氧所造成的膜系統的損害[23]。POD活性的升高可以氧化插穗內過多的內源IAA，有利于誘導根原基發育。對于第二峰值出現在不定根的表達時期，扈紅軍等[30]認為該峰值的出現也與不定根的表達有關，高活性的POD有利于不定根的表達。在根的伸長和發育期，POD活性下降，促使插穗內IAA含量增加，有利于根的伸長和發育。

PPO是普遍存在植物體內的一種含銅的氧化酶，它可以將酚類化合物和吲哚乙酸催化成一種“IAA-酚酸化合物”，這種復合物具有促進不定根分化及形成的作用[34]。本試驗結果表明，IBA處理顯著提高了裸花紫珠插穗內PPO的活性。扦插后，PPO活性先升高， 之后隨不定根的形成和伸長， 活性逐漸降低。這與趙云龍等[7]對糙葉杜鵑（Rhododendron scabrifoliu）、扈紅軍等[35]對榛子（Corylus heterophylla）扦插研究結論一致。多數研究表明，易生根植物體內PPO活性較高，PPO可以把高濃度的酚類物質轉化為促根物質，進而促進了不定根的分化及形成[36-37]。裸花紫珠為較易生根的植物，在不定根的誘導分化階段，IBA（1 500 mg/L）處理的插穗內PPO活性明顯升高，可能與PPO促成酚類物質轉化有關。

植物的扦插生根機理復雜，一種物質含量的變化可能導致其他一種或多種物質含量的變化，以及與之相關的抗氧化酶活性的變化，弄清它們之間內在的聯系，還需從激素信號轉導、次生代謝、基因調控等方面深入研究。

參考文獻

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