口腔扁平苔蘚患者血清中白細胞介素-12和白細胞介素-27表達與免疫功能的相關性

黃韻穎??周塑??蔡揚貴州醫科大學附屬醫院口腔內科，貴陽?550004

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·臨床研究·

口腔扁平苔蘚患者血清中白細胞介素-12和白細胞介素-27表達與免疫功能的相關性

黃韻穎??周塑??蔡揚
貴州醫科大學附屬醫院口腔內科，貴陽?550004

[摘要]目的 了解口腔扁平苔蘚（OLP）患者血清中白細胞介素（IL）-12和IL-27的表達與患者免疫功能狀況的相關性，探討IL-12和IL-27在OLP免疫發病機制中的作用及意義。方法 選取對照組健康者20例和OLP組患者30例（其中網紋型15例，糜爛型15例），通過流式細胞術分析OLP患者外周血淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+56[自然殺傷細胞（NK）]的表達情況，散射比濁法檢測患者體液免疫指標免疫球蛋白（Ig）G、IgA、IgM、C3、C4的表達情況。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法檢測血清中IL-12和IL-27的表達水平，分析IL-12和IL-27的表達與OLP患者免疫功能狀況及臨床特征的相關性。結果 與實驗室標準值相比，OLP患者細胞免疫中CD3+、CD4+、CD8+水平降低，CD19+水平增高（P<0.05）；體液免疫中IgM水平增高，C4水平降低（P<0.05）。OLP患者血清中IL-12與IL-27表達水平均高于對照組（P<0.05）。同時相關分析顯示，OLP患者血清中IL-12和IL-27的表達水平呈正相關關系（r=0.912，P<0.01）。但是IL-12及IL-27表達水平與OLP體征計分、病程計分等臨床特征無相關性（P>0.05）。OLP患者中IL-12和IL-27的表達與CD16+56（NK）存在負相關關系（r1=-0.416，P1=0.022；r2=-0.392，P2=0.032），與IgG存在正相關關系（r1=0.445，P1=0.014；r2=0.549，P2=0.002）。結論 OLP患者主要以細胞免疫功能低下為主，同時伴有一定程度的體液免疫功能的紊亂。IL-12和IL-27的異常高表達可能協同引起且促進了OLP的炎癥發生發展，并且通過機體代償性負反饋作用參與了對炎癥性免疫應答的調節，在OLP的發病機制中起到了一定作用。

[關鍵詞]口腔扁平苔蘚； 白細胞介素-12； 白細胞介素-27； 免疫； 酶聯免疫吸附試驗

口腔扁平苔蘚（oral?lichen?planus，OLP）是一種較常見、好發于口腔黏膜的慢性炎癥性非感染性疾病，其發病機制復雜，大量研究[1]已證實T細胞介導的細胞免疫反應在其免疫發病機制中起著重要作用。機體在受到大量抗原刺激后會分泌促炎細胞因子白細胞介素（interleukin，IL）-12和IL-27，它們不僅參與機體的細胞免疫應答[2-3]，還會引起機體的炎癥反應。

本研究擬通過檢測OLP患者血清中IL-12和IL-27的表達水平，分析其與患者免疫功能狀況的相關性，初步探討IL-12和IL-27在OLP免疫發病機制中的作用及意義。

1??材料和方法

1.1??研究對象

選擇2012年6月—2014年4月就診于貴州醫科大學附屬醫院口腔內科的初診患者30名，其中男性11名，女性19名，年齡22~72歲。病例經臨床和病理確診為OLP（診斷標準及分型標準見參考文獻[4]），所有患者均不伴有皮損，無系統性疾病及免疫性疾病，近3個月內未接受任何局部或全身的免疫制劑治療；其中網紋型（包括網狀型、條紋型、斑塊型以及丘疹型等）15例，糜爛型（包括紅斑型、萎縮型）l5例。20例對照組健康人來自貴州醫科大學附屬醫院體檢中心。

本研究經貴州醫科大學附屬醫院倫理學委員會審核批準，所有納入研究對象在研究前均知情同意。實驗組和對照組的年齡、性別差異均無統計學意義（P>0.05）。

對患者臨床癥狀及病損體征分別評分[5-6]。由同一檢查者在患者初診時觀察并記錄損害部位和最大范圍（最大直徑×最小直徑），如有多處相同類型的損害，則累計計算。1）0分：無病損，正常黏膜；2）1分：輕微白色條紋，無充血、萎縮或糜爛面；3）2分：白色條紋伴充血或萎縮面小于1?cm2；4）3分：白色條紋伴充血或萎縮面大于1?cm2；5）4分：白色條紋伴糜爛面小于1?cm2；6）5分：白色條紋伴糜爛面大于1?cm2。采用視覺模擬評分法（visual?analogue?scale，VAS）記錄患者的疼痛程度，評分標準如下。1）0分：無疼痛；2）1~3分：有輕微的疼痛，能忍受；3）4~6分：患者中度疼痛并影響睡眠，但尚能忍受；4）7~10分：患者有漸強烈的疼痛，疼痛難忍，影響食欲，影響睡眠；讓患者根據自我感覺進行評分。

1.2??主要儀器和試劑

恒溫水浴箱（天津市泰斯特儀器有限公司），Model?680酶標儀（BIO-RAD公司，美國），超低溫冰箱（合肥中科美菱低溫科技責任有限公司），酶聯免疫吸附試驗（enzyme?linked?immunosorbent?assay，ELISA）試劑盒（上海研輝生物科技有限公司），流式細胞儀、6色TBNK檢測試劑盒（BD公司，美國），特定蛋白分析系統（Beckman?Coulter公司，美國），免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G/M/A檢測試劑盒、補體C3/C4檢測試劑盒（貝克曼庫爾特實驗系統蘇州有限公司）。

1.3??標本采集及方法

采集患者清晨9點以前空腹外周靜脈血，對照組健康人則在體檢時空腹抽取，3?000?r·min-1離心10?min后取血清，貯存于-80?℃冰箱，按照ELISA試劑盒說明書進行集中測定，利用酶標儀讀取450?nm吸光度值，根據繪制的標準曲線計算待測血清IL-12和IL-27的濃度。流式細胞術檢測患者細胞免疫指標，包括CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+56[自然殺傷細胞（natural?killer?cell，NK）]；散射比濁法檢測患者體液免疫指標，包括IgG、IgA、IgM、C3、C4。該操作分別由貴州醫科大學附屬醫院中心實驗室及微生物免疫實驗室完成，并以實驗室標準值為正常對照。

1.4??統計學處理

所有實驗數據均采用SPSS?16.0統計學軟件進行分析。組間采用兩獨立樣本t檢驗和秩和檢驗；各因素間相關性分析采用Spearman相關分析。P<0.05認為差異具有統計學意義。

2??結果

2.1??OLP患者相關免疫檢測結果

2.1.1??OLP患者細胞免疫檢測結果 ?采用流式細胞術對30例OLP患者的細胞亞群免疫進行檢測，OLP患者CD3+、CD4+、CD8+低于實驗室標準值，CD19+高于實驗室標準值，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

表 ?1 ? OLP患者細胞免疫檢測結果Tab 1 Cellular immune test results in patients with OLP %,±s

表 ?1 ? OLP患者細胞免疫檢測結果Tab 1 Cellular immune test results in patients with OLP %,±s

注：*與實驗室標準值比較P<0.05。

組別 CD3+ CD4+ CD8+ CD19+ CD16+56（NK）實驗室標準值 70.85±8.81 38.46±8.16 30.40±7.91 9.42±4.30 22.37±11.17 OLP組 63.17±9.96* 33.59±7.88* 26.14±8.73* 10.98±3.63* 20.30±8.46

2.1.2??OLP患者體液免疫檢測結果 ?采用散射比濁法對30例OLP患者進行體液免疫檢測，OLP患者IgM高于實驗室標準值，C4低于實驗室標準值，差異有統計學意義（P<0.05）（表2）。

表 ?2 ??OLP患者體液免疫檢測結果Tab 2 Humoral immune test results in patients with OLP mg·L-1,±s

表 ?2 ??OLP患者體液免疫檢測結果Tab 2 Humoral immune test results in patients with OLP mg·L-1,±s

注：*與實驗室標準值比較P<0.05。

組別 IgG IgA IgM C3 C4實驗室標準值 12?870±1?909 2?350±480 1?080±339 1?140±381 250±212 OLP組 14?203±4?882 3?133±5?484 1?565±722* 1?081±208 222±45*

2.2??OLP患者外周血中IL-12和IL-27的表達水平

采用ELISA方法對20例對照組健康人和30例OLP組患者血清中IL-12和IL-27進行檢測，經秩和檢驗結果顯示，OLP患者血清中IL-12和IL-27的表達水平與對照組相比表達均升高，差異具有統計學意義（P<0.05）（表3，圖1）。相關分析顯示，OLP患者血清中IL-12和IL-27的表達水平呈正相關關系，差異具有統計學意義（r=0.912，P<0.01）。但IL-12 和IL-27表達水平與OLP體征計分（r1=-0.100，P1= 0.598；r2=-0.036，P2=0.852）、病程計分（r1=-0.181，P1=0.338；r2=-0.060，P2=0.754）等臨床特征沒有相關性。

表 ?3 ?OLP患者和對照組健康人血清中IL-12和IL-27的表達水平Tab 3 Serum level of IL-12 and IL-27 in OLP patients and normal controls pg·mL-1

圖 ?1??IL-12和IL-27在對照組健康人和OLP患者血清中的表達Fig?1??Serum?levels?of?IL-12?and?IL-27?in?OLP?patients?and?normal?controls

2.3??OLP患者血清中IL-12和IL-27的表達水平與免疫相關性分析

采用Spearman相關分析法分析OLP外周血中IL-12和IL-27的表達與免疫功能指標的相關性，實驗結果見表4。由表4可見，OLP患者IL-12和IL-27的表達水平與CD16+56（NK）存在負相關關系（r1=-0.416，P1=0.022；r2=-0.392，P2=0.032），與IgG存在正相關關系（r1=0.445，P1=0.014；r2=0.549，P2=0.002），均有統計學意義。

表 ?4??OLP患者血清中IL-12和IL-27的表達與免疫相關性分析Tab 4 The correlate analysis between the expression of IL-12, IL-27 and the immune system

3 ?討論

OLP是一種比較常見的口腔黏膜病，研究[1]表明T淋巴細胞介導的免疫反應在其發病過程中起著重要的作用。在適應性免疫應答過程中，細胞免疫和體液免疫之間相互調節，保持機體內環境的相對穩定[7]。

本研究細胞免疫檢測結果可見，OLP患者CD3+、CD4+、CD8+均明顯低于實驗室標準值（P<0.05）。NK作為一類可以反映T細胞功能的重要淋巴細胞，其數量的減少會導致機體的細胞免疫功能下降[8]，本研究同時發現NK細胞低于實驗室標準值，但差異無統計學意義（P>0.05）。以上結果均提示OLP患者處于細胞免疫功能低下的狀態，這與目前的其他研究[1,9-12]結果一致。

CD19+的表達代表B細胞水平，主要是通過抗原刺激B細胞合成和分泌Ig來介導機體的體液免疫，IgG作為應答的主要抗體，集中參與了機體免疫穩態的建立與維護[13]。C3、C4是補體系統中含量最多、最重要的一個組分。本研究中，相較于實驗室標準值，OLP患者CD19+、IgM均升高，C4降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。由于機體處于炎癥期，推測C4通過經典途徑或旁路途徑激活抗原抗體免疫復合物而使得補體成分被消耗[14]。提示機體體液免疫功能出現紊亂或亢進[7]。

機體中的病原體在受到大量抗原持續刺激后，轉變為抗原遞呈細胞（antigen?presenting?cell，APC），APC可同時分泌IL-12和IL-27，刺激產生多種細胞因子，從而引起機體的炎癥反應。且IL-27與IL-12同源，兩者的受體均存在于CD4+T細胞表面[15]，所以二者可以協同誘導T細胞的分化，參與機體的細胞免疫應答[2]。本實驗研究結果顯示，OLP組患者血清中IL-12和IL-27的表達水平均顯著高于對照組，相關性分析顯示，IL-12與IL-27的表達呈正相關。由于OLP主要表現為一個慢性炎癥的過程，推測IL-12可能在OLP的發病機制中協同IL-27引起且促進機體炎癥的發生發展。

IL-12是已知的最強激活NK細胞生物學活性的細胞因子，在機體早期的非特異性免疫和隨后的抗原特異性免疫過程中發揮相應的作用；IL-12能促進NK細胞生成干擾素γ（interferon-gamma，IFN-γ），同時IL-27也能促進NK細胞的增殖，IL-12和IL-27在體內持續高表達，則會超過機體的固有免疫應答，推測二者協同使NK細胞產生INF-γ的作用也是其促進及加重免疫炎癥發生的機制之一[16]。上述免疫結果已經顯示，OLP組IL-12和IL-27的高表達與OLP細胞免疫中NK細胞呈負相關關系，與體液免疫中IgG呈正相關關系（P<0.05）。即在OLP細胞免疫中NK細胞減少，相應的分泌IFN-γ也降低，提示OLP患者處于細胞免疫功能低下狀態。但是CD19+細胞、IgG增高，在特異性免疫應答過程中，推測其可能正向通過刺激B細胞的分泌來增加Ig含量從而調節機體的體液免疫，負向調節細胞免疫，通過負反饋調節的方式代償性增強機體的保護能力[7]。同時IL-27能夠限制過度的T細胞免疫應答強度[3]，由此推測IL-27的高表達也可能同時通過負反饋的方式增進體液免疫應答，從而導致機體出現體液免疫功能亢進或紊亂。本研究結果中IL-12和IL-27的表達水平與OLP臨床特征均無相關性（P>0.05），提示IL-12和IL-27的表達在不同臨床類型的OLP中可能是共同的免疫發病因素。

綜上所述，IL-12和IL-27的高表達引起且共同促進了OLP的炎癥發生發展，同時IL-12和IL-27的異常高表達通過抑制OLP的細胞免疫，同時誘發OLP的體液免疫紊亂，在OLP中參與了機體對炎癥性免疫應答的調節作用，IL-12和IL-27的表達水平在一定程度上也可以反映出OLP患者機體的免疫功能狀況，但是具體的調節機制尚需要進一步的研究闡述。

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（本文編輯 ?杜冰）

[中圖分類號]R?781.5

[文獻標志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.007

[收稿日期]2015-07-21；?[修回日期] ?2016-01-18

[基金項目]國家自然科學基金（81460104）

[作者簡介]黃韻穎，碩士，E-mail：305014272@qq.com

[通信作者]蔡揚，教授，博士，E-mail：caiyang85@163.com

Expression of interleukin-12 and interleukin-27 proteins and immune status in serum of patients with oral lichen planus

Huang Yunying, Zhou Su, Cai Yang. (Dept. of Stomatology, The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China)
Supported by: Natural Science Foundation of China (81460104). Correspondence: Cai Yang, E-mail: caiyang85@163.com.

[Abstract]Objective This?study?aimed?to?conduct?a?preliminary?study?on?the?possible?role?and?significance?of?interleukin?(IL)-12?and?IL-27?in?the?pathogeneses?of?oral?lichen?planus?(OLP).?Methods???Thirty?cases?of?patients?with?OLP?(fifteen?cases?of?reticular?OLP?and?fifteen?cases?of?erosive?OLP)?were?enrolled?in?this?study,?and?twenty?cases?of?healthy?people?served?as?controls.?Lymphocyte?subsets?CD3+,?CD4+,?CD8+,?CD19+,?and?CD16+56[natural?killer?cell?(NK)]?were?tested?using?flow?cytometry,?and?humoral?immunity?[immunoglobulin?(Ig)G,?IgA,?IgM,?C3,?C4]?were?examined?using?nephelometry?assays.?IL-12?and?IL-27?contents?in?serum?of?patients?with?OLP?and?normal?controls?were?detected?through?enzyme?linked?immunosorbent?assay.?The?correlations?between?the?levels?of?IL-12,?IL-27,?immune?status,?and?clinical?characteristics?of?patients?with?OLP?were?analyzed,?respectively.?Results??CD3+,?CD4+,?and?CD8+in?patients?with?OLP?were?markedly?lower?than?the?normal?value,?whereas?CD19+of?OLP?in?patients?was?significantly?higher?than?the?normal?value?(P<0.05).?IgM?in?patients?with?OLP?was?increased,?whereas?C4?was?declined?(P<0.05).?IL-12?and?IL-27?levels?showed?significant?upregulation? of?OLP?patients?compared?with?control?groups?(P<0.05).?Meanwhile,?positive?correlations?existed?between?IL-12?and?IL-27?levels?in?the?serum?of?patients?with?OLP?(r=0.912,?P<0.01).?No?significant?correlations?of?IL-12?and?IL-27?expressions?with?clinical?characteristics?of?OLP?were?found?(P>0.05).?Negative?correlations?of?IL-12?and?IL-27?levels?with?CD16+56(NK)?cells?were?observed?(r1=-0.416,?P1=0.022;?r2=-0.392,?P2=0.032,?respectively),?whereas?a?positive?correlation?existed?for?IgG?(r1=0.445,?P1=0.014;?r2=0.549,?P2=0.002,?respectively).?Conclusion??A?cellular?immune?dysfunction?mainly?dominate?in?patients?with?OLP,?accompanied?by?some?degree?of?humoral-immunity-function?disorder.?The?abnormally?high?expressions?of?IL-12?and?IL-27?are?possibly?synergized?and?promoted?inflammation?development?in?OLP.?Its?promotion?takes?place?through?the?negative?feedback?regulation?of?humoral?immune?responses,?which?are?involved?in?the?regulation?of?immune?mechanisms?of?OLP.

[Key words]oral?lichen?planus;??interleukin-12;??interleukin-27;??immune;??enzyme?linked?immunosorbent?assay