牙齦卟啉單胞菌脂多糖對人臍靜脈內皮細胞表達趨化因子RANTES和分形素的影響

漆曉玲??趙蕾??陳珊珊??孟姝??吳亞菲.口腔疾病研究國家重點實驗室?華西口腔醫院（四川大學），成都?6004；2.重慶醫科大學附屬口腔醫院牙周病科，重慶?4047；.口腔疾病研究國家重點實驗室?華西口腔醫院牙周病科（四川大學），成都?6004

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·口腔微生物毒力因子專欄·

牙齦卟啉單胞菌脂多糖對人臍靜脈內皮細胞表達趨化因子RANTES和分形素的影響

漆曉玲1,2趙蕾3陳珊珊1孟姝3吳亞菲3
1.口腔疾病研究國家重點實驗室?華西口腔醫院（四川大學），成都?610041；2.重慶醫科大學附屬口腔醫院牙周病科，重慶?401147；3.口腔疾病研究國家重點實驗室?華西口腔醫院牙周病科（四川大學），成都?610041

[摘要]目的 觀察牙齦卟啉單胞菌脂多糖（Pg-LPS）對人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）表達調節活化正常T細胞表達和分泌的趨化因子（RANTES）和分形素的影響。方法 應用不同質量濃度（200、500、1?000?ng·mL-1）的Pg-LPS分別處理HUVEC?1、6、12、24?h，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）及酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測RANTES及分形素mRNA及蛋白質的表達變化。結果 在Pg-LPS與HUVEC共同培養?1、6和12?h時，除培養時間為12?h、Pg-LPS質量濃度為200?ng·mL-1組的RANTES?mRNA和1?h、200?ng·mL-1組RANTES蛋白表達與對照組無明顯差異外，其余各實驗組RANTES蛋白和mRNA表達量及分形素mRNA表達量均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；6?h時，二者mRNA表達量達到峰值，分別為對照組的4.88倍和6.20倍；刺激6?h后，RANTES蛋白和mRNA表達量及分形素的mRNA表達量均降低，24?h時，僅Pg-LPS質量濃度為500?ng·mL-1組與對照組相比有統計學差異（P＜0.05）；分形素蛋白的表達量則僅在Pg-LPS濃度為1?000?ng·mL-1刺激6、12?h時與對照組相比有統計學差異（P＜0.05）。結論 Pg-LPS感染具有上調HUVEC表達趨化因子RANTES和分形素的作用，可能在牙周炎促進動脈粥樣硬化發生、發展的過程中起一定作用。

[關鍵詞]動脈粥樣硬化；?牙周炎；?趨化因子；?牙齦卟啉單胞菌；?脂多糖

牙周炎與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）及心血管疾病（cardiovascular?disease，CVD）密切相關，是CVD的獨立危險因素之一。血循環中的單核細胞趨化進入血管壁的過程是AS形成和發展中的關鍵環節之一，與單核細胞趨化功能相關的CC類及CX3C類趨化因子在這一過程中起重要作用。調節活化正常T細胞表達和分泌的趨化因子（regulated?upon?activation?normal?T-cell?expressed?and?secreted，RANTES）是一種CC類趨化因子。目前CX3C類趨化因子亞家族只發現了不規則趨化因子，又稱分形素（fractalkine）這一個成員。研究證明，RANTES和分形素均參與了AS的炎癥反應過程，具有促進炎癥反應及AS形成的作用[1-4]。

牙齦卟啉單胞菌是牙周炎主要致病菌，脂多糖（lipopolysacchearide，LPS）是其重要的毒力因子之一。本課題組前期研究[5]表明：牙齦卟啉單胞菌可侵入人臍靜脈內皮細胞（human?umbilical?vein?endothelial?cells，HUVEC），并對其細胞功能產生一定影響；進一步研究[6]顯示：牙齦卟啉單胞菌及其毒力因子LPS可促進單核細胞表面趨化因子受體的表達上調。另有研究[7]也表明，牙齦卟啉單胞菌能黏附并侵入血管內皮細胞，其毒力因子LPS還可以通過上調黏附分子、趨化因子及趨化因子受體等從而促進白細胞的活化，參與AS病損的形成。但牙齦卟啉單胞菌的LPS能否通過影響血管內皮細胞趨化因子RANTES和分形素的表達，從而調節單核細胞向血管內皮趨化遷移的作用，目前國內外研究還較少。本研究通過觀察不同質量濃度牙齦卟啉單胞菌LPS對HUVEC表達趨化因子RANTES和分形素的影響，探索其在CVD中的可能致病機制，為牙周炎與CVD的相關關系提供依據。

1??材料和方法

1.1??實驗細胞株

HUVEC細胞株EA-hy926，由上海斯信生物科技有限公司提供。

1.2??試劑和儀器

牙齦卟啉單胞菌的LPS（Invivogen公司，美國）；胎牛血清，DMEM-高糖培養基（Gibco公司，美國）；TrizolTMReagent（Invitrogen公司，美國）；人RANTES及分形素酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked?immunosorbent?assay，ELISA）試劑盒（上海源葉生物科技有限公司提供）；RNA逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）。恒溫培養箱（Thermo公司，美國），超凈工作臺（Biological?Safety?Cabinets，Thermo公司，美國），水平搖床（SYC-2101型，Crystal公司，美國），酶標儀（Thermo公司，美國），高速冷凍離心機（Hermle公司，德國），高通量聚合酶鏈反應（polymerase?chain?reaction，PCR）儀（BIO-RAD公司，美國），ABI7300型熒光定量PCR儀（Applied?Biosystems公司，美國）。1.3??細胞培養

用含15%胎牛血清的DMEM培養基復蘇細胞，置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37?℃和5%CO2環境中常規培養，每2?d傳代1次（去除培養基中血清，PBS清洗3次，加入胰酶消化），鏡下觀察細胞形態。

1.4??細胞毒性實驗

將對數生長期的HUVEC接種于96孔板，密度為每毫升5×104個，每孔0.2?mL。培養24?h后，每孔加入不同質量濃度的LPS，使孔內LPS終質量濃度分別為0（對照組）、10、50、100、200、500、1?000、2?000、5?000?ng·mL-1，每個不同的質量濃度設置4個復孔，空白組僅加入DMEM培養基0.2?mL，余孔加入等體積的PBS液。培養24?h后，吸出待測孔的培養基，更換新鮮培養基0.2?mL，每孔中加入MTT 液20 μL，置于培養箱中3.5~4?h后終止培養，吸棄上清液，每孔中加入DMSO液200 μL，置于培養箱中30?min后水平搖床低速震蕩10?min，待結晶充分溶解后，利用ELISA檢測儀測定出490?nm波長的相應吸光度A值，計算細胞存活率。細胞存活率=（實驗組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）。

1.5??LPS感染HUVEC模型

選取不同質量濃度的LPS與HUVEC共培養，使其終質量濃度為0、200、500、1?000?ng·mL-1。分別于培養后1、6、12、24?h收集細胞上清液，Trizol法裂解細胞以提取細胞總RNA。

1.6??RANTES及分形素mRNA表達

采用實時熒光定量PCR（real?time?quantitative-PCR，RT-PCR）檢測RANTES及分形素mRNA的表達。提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，然后進行RTPCR反應，采用β-actin作為內參基因。各基因的引物序列如下。β-actin，F：5’-CCACGAAACTACCTTCAA-CTCC-3’，R：5’-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3’；RANTES，F：5’-CATCCTCATTGCTACTGCCCTCT-3’，R：5’-GCCACTGGTGTAGAAATACTCCTTG-3’；分形素，F：5’-TTCTGCCATCTGACTGTCCTGC-3’，R：5’-TGCCTGGTTCTGTTGATAGTGGAT-3’。

1.7??RANTES及分形素蛋白的表達

采用ELISA法測定細胞上清液中RANTES及分形素蛋白的表達，根據試劑盒所示步驟進行操作。RANTES最低檢測質量濃度為70?pg·mL-1，分形素最低檢測質量濃度為20?pg·mL-1。

1.8??統計學方法

所有數據為3次重復實驗結果，采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析。統計方法采用方差分析法，兩兩比較采用LSD檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2??結果

2.1??細胞毒性實驗結果

應用不同質量濃度LPS刺激HUVEC細胞24?h后的MTT實驗結果見圖1。10、50、100、200、500、1?000?ng·mL-1LPS組細胞存活率均在95%以上，與對照組相比差異無統計學意義（P>0.05）。2?000、5?000?ng·mL-1LPS刺激后，細胞存活率較對照組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。根據MTT實驗結果，篩選出后續實驗中LPS刺激的質量濃度為0、200、500、1?000?ng·mL-1。

圖 1??不同質量濃度LPS作用下HUVEC存活率?Fig?1??The?survival?rate?of?HUVEC?under?different?concentrations ?of?LPS

2.2??RANTES及分形素的mRNA表達

2.2.1??RANTES?mRNA的表達 ?不同質量濃度LPS刺激HUVEC細胞后RANTES?mRNA的表達變化見表1。在刺激的12?h內，RANTES?mRNA相對表達量隨著LPS質量濃度增高呈增加趨勢，除12?h時200?ng·mL-1組外，其余實驗組與對照組的差異均有統計學意義（P＜0.05）。6?h時1?000?ng·mL-1組RANTES?mRNA相對表達量達到峰值，為對照組的4.88倍。6?h后，各實驗組RANTES?mRNA的表達量較之前呈下降趨勢，24?h時，各實驗組RANTES?mRNA表達量均略微高于對照組，僅500?ng·mL-1組與對照組的差異有統計學意義（P＜0.05）。同一時間點各實驗組間比較顯示：1、6、12?h時，1?000?ng·mL-1組RANTES?mRNA相對表達量均高于200?ng·mL-1及500?ng·mL-1組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表 1 LPS刺激HUVEC后RANTES mRNA的相對表達量Tab 1 RANTES mRNA expression levels of HUVEC stimulated by LPS±s

表 1 LPS刺激HUVEC后RANTES mRNA的相對表達量Tab 1 RANTES mRNA expression levels of HUVEC stimulated by LPS±s

注：a：與相同時間點對照組相比，P＜0.05；b：與相同時間點2?00?ng·mL-1組相比，P＜0.05；c：與相同時間點500?ng·mL-1組相比，P＜0.05；d：與相同質量濃度1?h組相比，P＜0.05；e：與相同質量濃度6?h組相比，P＜0.05；f：與相同質量濃度12?h組相比，P＜0.05。

時間/h LPS質量濃度/（ng·mL-1） F值 P值0 200 500 1?000 1 1.71±0.24a2.22±0.78ae3.57±0.39abce23.32 ＜0.000?1 6 1 2.29±0.79ac3.81±0.80abdf4.88±0.38abcdf33.51 ＜0.000?1 1 12 1 1.64±0.34 2.22±0.28ae3.21±0.71abce20.14 ＜0.000?1 24 1 1.53±0.27 1.81±0.48ae1.39±0.52def3.13 0.066

2.2.2??分形素mRNA的表達 ?LPS刺激HUVEC細胞后分形素mRNA的表達變化見表2。在刺激的12?h內，分形素mRNA相對表達量隨LPS質量濃度增高呈增加趨勢，各實驗組與對照組相比均有統計學差異（P＜0.05）。6?h時1?000?ng·mL-1組分形素mRNA表達量達到峰值，為對照組的6.20倍。6?h后，各實驗組分形素mRNA表達量較之前下降，24?h時，各實驗組分形素mRNA表達量均略微高于對照組，僅500?ng·mL-1組與對照組差異有統計學意義（P＜0.05）。同一時間點各實驗組間比較顯示：1、6、12?h時，隨著LPS質量濃度增加，分形素mRNA相對表達量相應增高， 各組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表 2 LPS刺激HUVEC后分形素mRNA的相對表達量Tab 2 Fractalkine mRNA expression levels of HUVEC stimulated by LPS???±s

表 2 LPS刺激HUVEC后分形素mRNA的相對表達量Tab 2 Fractalkine mRNA expression levels of HUVEC stimulated by LPS???±s

注：a：與相同時間點對照組相比，P＜0.05；b：與相同時間點2?00?ng·mL-1組相比，P＜0.05；c：與相同時間點500?ng·mL-1組相比，P＜0.05；d：與相同質量濃度1?h組相比，P＜0.05；e：與相同質量濃度6?h組相比，P＜0.05；f：與相同質量濃度12?h組相比，P＜0.05。

LPS質量濃度/（ng·mL-1）時間/h F值 P值0 200 500 1?000 1 2.07±0.48ac3.47±0.30abe4.60±0.52abce68.14 ＜0.000?1 6 1 2.78±0.70ac4.86±0.46abd6.20±0.57abcd73.57 ＜0.000?1 1 12 1 2.00±0.62ac3.91±0.89ab5.55±0.27abc52.82 ＜0.000?1 24 1 1.36±0.34ce3.17±0.81abe1.66±0.69cdef11.71 0.000?7

2.3??細胞上清液中RANTES和分形素蛋白質量濃度2.3.1??RANTES蛋白質量濃度 ?不同質量濃度LPS刺激HUVEC細胞后RANTES蛋白的表達變化見表3。在刺激的12?h內，細胞上清液中RANTES質量濃度隨LPS刺激濃度增高呈增加趨勢，除1?h時200?ng·mL-1組外，其余各實驗組與對照組相比均具有統計學差異（P＜0.05）。刺激6?h后，各實驗組的細胞上清液中RANTES質量濃度較之前呈下降趨勢；24?h時，各實驗組RANTES質量濃度均略微高于對照組，僅500?ng·mL-1組與對照組的差異有統計學意義（P＜0.05）。同一時間點各實驗組間比較顯示：1、6、12?h時，隨著LPS質量濃度增加，RANTES表達量相應增高，1?000?ng·mL-1組和200、500?ng·mL-1組的差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表 3??LPS刺激HUVEC后細胞上清液中RANTES的質量濃度變化Tab 3 RANTES protein levels in the supernatant of HUVEC stimulated by LPS pg·mL-1,±s

表 3??LPS刺激HUVEC后細胞上清液中RANTES的質量濃度變化Tab 3 RANTES protein levels in the supernatant of HUVEC stimulated by LPS pg·mL-1,±s

注：a：與相同時間點對照組相比，P＜0.05；b：與相同時間點2?00?ng·mL-1組相比，P＜0.05；c：與相同時間點500?ng·mL-1組相比，P＜0.05；d：與相同質量濃度1?h組相比，P＜0.05；e：與相同質量濃度6?h組相比，P＜0.05；f：與相同質量濃度12?h組相比，P＜0.05。

LPS質量濃度/（ng·mL-1）時間/h F值 P值0 200 500 1?000 1 1?227.50±71.12 1?309.39±51.47cef1?471.59±34.02abe1?629.47±34.40abce50.63 ＜0.000?1 6 1?201.05±44.50 1?566.81±51.21acdf1?698.93±36.56abdf1?826.73±40.31abcdf154.1 ＜0.000?1 12 1?252.21±20.48 1?413.77±51.31ade1?489.81±33.10ae1?633.71±34.00abce76.19 ＜0.000?1 24 1?265.21±31.75 1?339.70±34.43ce1?440.99±46.50abe1?344.83±41.15cdef13.74 0.000?3

2.3.2??分形素蛋白質量濃度 ?不同質量濃度LPS刺激HUVEC細胞后分形素蛋白的表達變化見表4。不同質量濃度LPS刺激后細胞上清液中分形素質量濃度與對照組相比較沒有明顯的變化，僅刺激6、12?h時1?000?ng·mL-1組與其他各組的差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表 4 LPS刺激HUVEC后細胞上清液中分形素的質量濃度變化Tab 4 Fractalkine protein levels in the supernatant of HUVEC stimulated by LPS pg·mL-1,±s

表 4 LPS刺激HUVEC后細胞上清液中分形素的質量濃度變化Tab 4 Fractalkine protein levels in the supernatant of HUVEC stimulated by LPS pg·mL-1,±s

注：a：與相同時間點對照組相比，P＜0.05；b：與相同時間點2?00?ng·mL-1組相比，P＜0.05；c：與相同時間點500?ng·mL-1組相比，P＜0.05；d：與相同質量濃度1?h組相比，P＜0.05；e：與相同質量濃度6?h組相比，P＜0.05；f：與相同質量濃度12?h組相比，P＜0.05。

LPS質量濃度/（ng·mL-1）時間/h F值 P值0 200 500 1?000 986.60±24.13 1?038.19±38.43 1?055.24±43.41 1?078.43±61.10e3.17 0.063?7 6 993.49±10.99 1?052.15±46.25 1?076.08±52.92 1?178.41±36.46abcd14.91 0.000?2 12 989.86±12.14 1?034.05±36.93 1?062.60±42.05 1?161.37±39.06abc17.10 0.000?1 24 960.80±48.60 1?025.05±29.84 1?047.51±58.37 1?057.78±43.53ef3.543 0.048?1 1

3??討論

牙周炎和心血管疾病聯系密切。牙周炎癥能導致血液中的重要冠心病相關生物標志物濃度升高，而經過牙周治療后其濃度下降[8-9]。研究[10]顯示，牙周炎臨床指標與動脈瓣膜狹窄，頸動脈粥樣硬化，內皮細胞功能障礙等有關，牙周治療可以改善內皮細胞功能。牙齦卟啉單胞菌是目前公認的引起牙周炎的主要致病菌之一，LPS是其最重要的毒力因子之一。研究[11]表明，亞臨床內毒素血癥使AS和CVD的發生風險增加3倍。目前為止，尚未見文獻報道牙齦卟啉單胞菌LPS引起亞臨床膿毒血癥的濃度范圍參考值。以往在體外研究中，牙齦卟啉單胞菌LPS的質量濃度多選擇為1~5?000?ng·mL-1[12-13]。結合本研究細胞毒性實驗結果，后續實驗中LPS刺激質量濃度選擇為0、200、500、1?000?ng·mL-1。

AS是CVD的基本病變，動脈壁上形成粥樣硬化斑塊是AS的主要特點，斑塊中含有大量炎癥細胞，其中單核細胞約占80%左右。單核細胞通過對血管內皮細胞的趨化作用而進入血管壁變成巨噬細胞，進一步吞噬脂質后變為泡沫細胞，成為粥樣硬化斑塊的主要組成成分。其中趨化因子在單核細胞黏附、侵入血管內皮以及AS的形成和發展中起重要作用。趨化因子家族主要分為四大類：C、CC、CXC、CX3C，其中具有單核細胞趨化功能的是CC類和CX3C類趨化因子。

RANTES是CC類趨化因子亞家族中的一員，其受體為CCR1、CCR3和CCR5，具有典型的趨化效應，與G蛋白偶聯受體結合后可引起短暫的鈣離子內流，導致受體極化和細胞遷移，增加細胞表面細胞間黏附分子-1（intercellular?adhesion?molecule-1，ICAM-1）、CD43、CD44及CD45等的表達，誘導白細胞向炎癥部位浸潤[14]。趨化因子RANTES可促進炎癥反應，參與AS發生發展過程。流行病學調查[15]顯示，RANTES受體CCR5的基因多態性與心血管疾病的發生有關。研究人員在AS病變中檢測到RANTES存在[16]。用多肽拮抗劑抑制RANTES受體后可以抑制白細胞浸潤，AS病變形成及發展[1]。動物實驗[2]顯示，血清RANTES濃度與粥樣斑塊不穩定性呈正相關。另外Gamonal等[17]研究表明，牙周炎患者局部炎癥位點齦溝液（gingival?crevicular?fluid，GCF）中可檢測到趨化因子RANTES的存在，但在牙周健康者的齦溝液中無法檢測到。Johnson等[18]發現牙周炎患者牙齦組織中RANTES表達增加，且與牙周袋的探診深度有一定的關系。這些研究結果提示，牙周炎引起的RANTES表達水平變化可能是牙周炎與CVD相關的橋梁分子之一。本研究的結果顯示，200、500、1?000?ng·mL-1的LPS均能影響HUVEC?RANTES蛋白和mRNA表達，且在12?h內，RANTES蛋白和mRNA表達量隨LPS刺激的質量濃度增高呈增加趨勢，在6?h時的表達量最高。這提示LPS可能通過上調RANTES的表達影響單核細胞對血管內皮細胞的趨化功能，進而影響AS形成。Bodet等[19]利用不同的牙齦卟啉單胞菌（ATCC33277、ATCC53977、W83）感染人全血，結果發現，牙齦卟啉單胞菌可呈濃度依賴性促進RANTES表達，且ATCC53977的刺激作用更強，這與本研究結果一致。

分形素是趨化因子CX3C亞家族目前的唯一成員，具有膜結合型和分泌型兩種形式，是一種兼具黏附功能的趨化因子，不僅能夠誘導單核細胞的定向遷移，還能介導單核細胞與血管內皮細胞的緊密黏附。研究[20]發現，分形素及其受體參與AS形成及去穩定化的過程。Rius等[3]研究表明，吸煙可以增加人動脈內皮細胞分形素的表達，促進單核細胞對其的黏附。Stolla等[4]研究發現，分形素在人動脈粥樣硬化斑塊的早、晚期都可檢測到，并且可促進單核細胞的趨化作用。Park等[21]研究表明，100?ng·mL-1的LPS刺激鼠腎小球膜細胞4h后，分形素的mRNA表達量是空白對照組的2.2倍。Hosokawa等[22]研究發現，在正常的人牙齦組織中未檢測到分形素表達，而炎性牙齦組織中可檢測到其表達，且主要表達于血管內皮細胞；進一步用1?000?ng·mL-1的牙齦卟啉單胞菌LPS刺激HUVEC，結果表明，LPS可上調分形素的mRNA表達，8?h時表達量最高。本研究結果表明，200、500、1?000?ng·mL-1的Pg-LPS均能影響人臍靜脈內皮細胞分形素的mRNA表達，且在12?h內，分形素的mRNA表達量隨LPS質量濃度增高呈增加趨勢，6?h時的表達量最高。這一結果類似Hosokawa 等[22]的研究結果。但是本研究中LPS對分形素蛋白水平表達的影響并不明顯，這可能是由于分形素具有膜結合型和分泌型兩種形式，而本實驗利用ELISA法測量細胞上清液中分形素質量濃度僅能測得其分泌形式，測量結果可能欠缺對膜結合型分形素表達變化的分析。本課題組后續實驗將通過流式細胞術和Western-blot進一步分析LPS對HUVEC表面膜結合型分形素表達的影響。

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（本文編輯 ?吳愛華）

[中圖分類號]R?780.2

[文獻標志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.018

[收稿日期]2015-09-30；?[修回日期] ?2015-11-21

[基金項目]國家自然科學基金（30973323，81371150）

[作者簡介]漆曉玲，碩士，E-mail:?815655244@qq.com

[通信作者]吳亞菲，教授，博士，E-mail：yafeiwu@tom.com

Effects of Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide on the expression of RANTES and fractalkine in human um-bilical vein endothelial cells

Qi Xiaoling1,2, Zhao Lei3, Chen Shanshan1, Meng Shu3, Wu Yafei3. (1. State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China; 2. Dept. of Periodontics, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 401147, China; 3. State Key Laboratory of Oral Diseases, Dept. of Periodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Supported by: Natural Science Foundation of China (30973323, 81371150). Correspondence: Wu Yafei, E-mail: yafeiwu@ tom.com.

[Abstract]Objective A?study?was?conducted?to?investigate?the?effects?of?Porphyromonas gingivalis?lipopolysaccharide?(Pg-LPS)?on?the?expression?of?regulated?upon?activation?normal?T-cell?expressed?and?secreted?(RANTES)?and?fractalkine?in?human?umbilical?vein?endothelial?cells?(HUVECs).?Methods??HUVECs?were?incubated?with?different?concentrations?of?Pg-LPS?(200,?500,?and?1?000?ng·mLˉ1)?for?1,?6,?12,?and?24?h,?respectively.?Then?real?time?quantitative?polymerase?chain?reaction?(RT-PCR)?and?enzyme-linked?immunosorbent?method?(ELISA)?were?adopted?to?detect?the?protein?levels?and?mRNA?levels?of?RANTES?and?fractalkine.?Results??The?RANTES?protein?levels?and?mRNA?levels,?as?well?as?fractalkine?mRNA?levels,?were?significantly?higher?in?all?experimental?groups?of?1,?6,?and?12?h?than?in?the?control?group?(P<0.05),?except?the?expression?of?RANTES?mRNA?in?200?ng·mLˉ1group?of?12?h?and?RANTES?protein?in?200?ng·mLˉ1group?of?1?h.?The?expression?levels?of? RANTES?mRNA?and?fractalkine?mRNA?were?highest?in?1?000?ng·mLˉ1group?of?6?h?and?were?4.88-?and?6.20-fold?higher,?respectively,?than?those?in?the?control?group.?The?expression?levels?of?RANTES?protein,?mRNA,?and?frac-talkine?mRNA?decreased?6?h?after?stimulation,?and?were?significantly?higher?than?those?in?the?control?group?(P<0.05)?in?the?500?ng·mLˉ1group?of?24?h.?There?was?a?significant?difference?between?the?expression?of?fractalkine?mRNA?in?1?000?ng·mLˉ1group?of?6?and?12?h?than?in?the?control?group?(P<0.05).?Conclusion??Pg-LPS?infection?might?up-regulate?the?expression?of?RANTES?and?fractalkine?in?HUVEC,?and?such?expression?is?important?in?the?development?of?atherosclerosis.

[Key words]atherosclerosis;??periodontitis;??chemokines;??Porphyromonas gingivalis;??lipopolysacchearide