變異鏈球菌耐酸毒力因子質子移位膜ATP酶在齲病進展中的動態變化

高敬??黃文明重慶醫科大學附屬口腔醫院牙體牙髓病科·口腔疾病與生物醫學重慶市重點實驗室·重慶市高校市級口腔生物醫學工程重點實驗室，重慶?401147

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變異鏈球菌耐酸毒力因子質子移位膜ATP酶在齲病進展中的動態變化

高敬??黃文明
重慶醫科大學附屬口腔醫院牙體牙髓病科·口腔疾病與生物醫學重慶市重點實驗室·
重慶市高校市級口腔生物醫學工程重點實驗室，重慶?401147

[摘要]目的 研究變異鏈球菌耐酸毒力因子質子移位膜ATP酶（F-ATPase）在不同pH環境和齲病發生發展過程中的表達，評價F-ATPase在齲病進展中的動態變化。方法 將變異鏈球菌菌懸液在不同pH（pH4.0～7.0）和不同葡萄糖濃度（含5%和不含葡萄糖）的BHI液體培養基中培養，檢測F-ATPase基因的表達水平。將雄性Wistar大鼠隨機分成致齲組和對照組，其中致齲組喂養致齲飼料及5%葡萄糖水，對照組喂養普通飼料。每2周采集菌斑樣本，檢測F-ATPase基因的表達水平。第11周時取大鼠上下頜骨標本，對磨牙進行齲損評定。結果 1）5%葡萄糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達高于不含葡萄糖（P<0.05），在pH5.0時F-ATPase基因的表達最高，pH4.0時表達最低（P<0.05）。2）成功構建了齲病動物模型，在齲病發生發展過程中，致齲組和對照組F-ATPase的表達逐漸增強，致齲組表達高于對照組（P<0.05）。結論 耐酸毒力因子F-ATPase的表達變化與齲病的發生發展密切相關。

[關鍵詞]齲病； 牙菌斑； 質子移位膜ATP酶；??pH

耐酸性是細菌在致齲過程中最重要的毒力表現，細菌產酸后若不能耐酸，則細菌就不能繼續生存、代謝。Bender等[1]研究發現細菌的耐酸性與細菌膜對質子的透過性有關，變異鏈球菌的耐酸性主要依賴于細胞膜上的質子移位膜ATP酶（membranebound?proton-translocating?ATPase，F-ATPase），通過F-ATPase將質子泵出胞內，使胞內pH（pHi）高于胞外pH（pHo），即維持了一個跨膜梯度ΔpH （pHi-pHo），保持胞內pH接近中性，保護胞漿中與糖酵解相關酶的活性，使菌細胞在低pH的苛刻環境中仍能產酸、生存并最終導致齲病的發生[2-3]。可見，F-ATPase是變異鏈球菌致齲菌耐酸的引擎和馬達，與齲病的發生密切相關。

目前尚缺乏關于變異鏈球菌耐酸毒力因子FATPase在齲病發生發展過程中的研究，為了進一步了解F-ATPase在齲病進展中的變化，本研究建立致齲動物模型縱向研究F-ATPase基因在齲病進展中的表達變化，比較F-ATPase基因在不同pH環境的表達，以評價生物膜中耐酸毒力因子F-ATPase與齲病發生的關系。

1??材料和方法

1.1??實驗菌株及動物

變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）標準株UA159由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供。18?d齡的雄性Wistar大鼠購于重慶醫科大學實驗動物中心，許可證編號為SYXK（渝）2012-0001。

1.2??主要試劑及儀器

BHI培養基（OXOID公司，英國），YJ-875型超凈工作臺（蘇州市華宇凈化設備有限公司），FQ-聚合酶鏈反應（polymerase?chain?reaction，PCR）儀（Bio-Rad公司，美國）?，200型分光光度計（Thermo?Fisher公司，美國），pH計（Mettler?Toledo公司，瑞士），Bio-Rad電泳儀（Bio-Rad公司，美國）。

1.3??引物設計

根據GenBank報道的變異鏈球菌F-ATPase β亞基基因[4]序列及16sRNA基因序列（GenBank?accession?number?NC_004350），采用Primer?primer?5.0計算機軟件設計引物。F-ATPase上游引物?5’-CGGATGCGTGTTGCTCTTACTG-3’，下游引物5’-GGCTGATAACCAACGGCTGATG-3’；16sRNA上游引物5’-TGGAACTGAGACACGGTCCA-3’，下游引物5’-CGCTTTACGCCCAGTAATTCCG-3’。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4??不同pH和葡萄糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達

將變異鏈球菌標準株UA159復蘇，培養24?h，3?000?r·min-1離心15?min，棄上清，用無菌生理鹽水于紫外分光光度計540?nm處制備成吸光度為1.0的菌懸液備用。以0.5為間隔配制pH4.0～7.0系列的含5%葡萄糖和不含葡萄糖的BHI液體培養基。取變異鏈球菌懸液，按菌液與BHI液體培養基1∶10的體積比接種細菌，37?℃厭氧培養至16?h指數生長期，每個樣品一式3份，3?000?r·min-1離心15?min收集菌體，通過RNAiso?Plus（Takara公司，日本）提取RNA，逆轉錄成cDNA，PCR擴增反應總體積為20 μL，含SYBR?Premix?Ex?Taq（2x）10 μL（包括DNA?Taq酶、Mg2+、dNTP、SYBR?GreenⅠ熒光染料和Buffer緩沖液）、上下游引物各0.5 μL、模板cDNA 2 μL，加滅菌去離子水至20 μL。反應循環參數設置為三步法PCR擴增標準程序：95?℃預變性3?min，95?℃變性30?s，60?℃退火30?s，72?℃延伸30?s，共40個循環。在延伸階段收集熒光信號，循環結束后附加溶解曲線分析：95?℃?15?s，62?℃?23?s，95?℃?15?s。實驗重復3次，取均值，收集實驗數據，測定各樣品的循環閾值（Ct值），通過2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

1.5???齲病動物模型的建立及變異鏈球菌F-ATPase基因表達檢測

12只18?d齡的雄性Wistar大鼠，隨機分為2組，致齲組6只，喂養致齲飼料2?000號及5%葡萄糖水；對照組6只，喂養普通飼料。從第1周開始每2周采集菌斑樣本（共6次），采集樣本前2?h大鼠禁食，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，以棉拭子采集磨牙面及頰舌（頰腭）面的菌斑，置于含硫乙醇酸鹽傳送液的離心管中洗脫，將樣本收集于離心管中，提取混合菌斑RNA，進行逆轉錄和實時熒光定量PCR（引物及反應體系同上）。結果取均值，通過2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

第11周時處死大鼠，取上下頜骨標本，染色，根據Keyes經典評分方法[5]對磨牙進行齲損評定，將齲損分為4級。E級：僅限于釉質；Ds級：累及釉質及牙本質外層1/4以內；Dm級：累及牙本質厚度的1/4至3/4；Dx級：累及超過牙本質厚度的3/4，甚至達牙本質全層。

1.6??數據分析

采用SPSS?17.0軟件進行統計分析，所有數據均以均數±標準差表示，多組之間比較采用單因素方差分析。

2??結果

2.1??變異鏈球菌F-ATPase基因及16sRNA內參基因

F-ATPase基因和16sRNA內參基因經常規PCR都能得到特異性擴增，2%凝膠電泳顯示各基因各實驗組中的cDNA產物均為單一條帶（圖1、2），條帶片段大小與引物預期擴增片段大小一致。

圖 1??F-ATPase基因擴增產物電泳圖Fig?1??Electrophoresis?of?products?of?F-ATPase?gene

2.2??不同pH和葡萄糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達

不同pH和葡萄糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達見圖3。實驗結果顯示，1）在pH5.0時FATPase基因的表達最高，然后依次是pH5.5、6.0、6.5，7.0，4.5，最低的是pH4.0（P<0.05）；2）5%葡萄糖濃度下F-ATPase的表達高于不含葡萄糖（P< 0.05）。

2.3??大鼠磨牙齲病動物模型的建立

11周后處死大鼠，取磨牙進行Keyes評分，結果見圖4和表1。實驗成功構建了齲病動物模型，各組Wistar大鼠磨牙均有不同程度的齲損發生，但是齲損發生的嚴重程度、累及范圍不盡相同。致齲組齲齒計分明顯高于對照組，且齲壞病變的程度要高于對照組。對照組牙齒的損壞最小，僅達到牙本質中層，致齲組齲損多數達牙本質中層，其次是牙本質深層。

圖 2??16sRNA基因擴增產物電泳圖Fig?2??Electrophoresis?of?products?of?16sRNA?gene

?圖?3??不同pH和葡萄糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達?Fig?3???F-ATPase?expression?under?different?pH?and?glucose?con-?centration

圖 4??大鼠齲齒 ?體視顯微鏡 ?×?30Fig?4??The?caries?of?rats??stereomicroscope??×?30

表 1 ?各組大鼠磨牙齲齒Keyes評分Tab 1 The Keyes score in the molar teeth of each rat group

2.4??齲病過程中F-ATPase基因的表達

齲病過程中各組F-ATPase基因的表達見表2。在齲病的發生發展過程中，隨時間的推移各組F-ATPase基因的表達逐漸增強，致齲組表達高于對照組（P< 0.05），第9周后，致齲組增長程度有一定下降，對照組的表達下降。

表 2 ?齲病過程中各組F-ATPase基因的表達Tab 2 F-ATPase expression in each group during the de velopment of caries

3 ?討論

F-ATPase具有調節胞漿pH以及決定菌細胞耐酸性的生物學特性。細菌細胞的胞外質子向胞內擴散降低胞內pH，影響對酸敏感的糖酵解的活性，為了最大程度的發揮糖酵解的活性，致齲菌通過細胞膜和F-ATPase抵抗胞漿的酸化，F-ATPase將質子泵出細胞從而調節pH，使致齲菌在低pH值環境下仍能進行糖酵解[6-7]。

早期齲病研究表明，環境pH和糖在齲病的發生發展過程中起著重要的作用，而口腔原位環境是一個復雜且動態變化的環境，獲取大鼠致齲過程中牙菌斑pH較困難，為了研究高糖濃度下變異鏈球菌FATPase基因的表達與pH之間的關系，本研究設計了體外實驗，結果顯示，變異鏈球菌在5%葡萄糖濃度下耐酸毒力因子F-ATPase表達高于不含葡萄糖環境。研究[8]表明，在高糖濃度下，變異鏈球菌的黏附毒力、產酸毒力、耐酸毒力及耐藥毒力均高于低糖或無糖環境下，由此推測，高糖濃度下變異鏈球菌致齲能力上調。當外界環境中有充足的糖源時，變異鏈球菌能迅速合成胞外多糖，伴隨著產酸耐酸能力的增強，環境中pH迅速下降，變異鏈球菌在酸壓力狀態下通過上調耐酸因子F-ATPase表達來維持生存代謝。Kuhnert等[4]對浮游狀態的變異鏈球菌F-ATPase基因表達研究證實，在pH5.0時mRNA的表達水平大約是pH7.0時的2倍。研究[9]發現，當培養基中的pH 由8.0下降至5.0時，變異鏈球菌的F-ATPase活性提高4倍，從而增強了其質子泵作用。本實驗研究也證實，高糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達高于無糖或低糖環境，F-ATPase的表達在pH5.0時最高，pH4.0時最低，pH5.0到7.0時F-ATPase表達緩慢降低，在pH5.0以下時F-ATPase的表達急劇減少。學者[10]研究對比了干酪乳桿菌、變異鏈球菌和血鏈球菌3種耐酸性分別為高、中、低的口腔耐酸菌膜結合F-ATPase的pH活性范圍，發現其最適pH值分別為5.5、6.0和7.0，證明了細菌的相對耐酸性與F-ATPase的活性和最適pH值有關，活性越大，最適pH值越低。在酸性環境中排除胞內多余H+能力越強，因而越耐酸。可見在最適pH以內，F-ATPase的表達隨pH降低而升高，而當pH降低至5.0以下時，酶活性超過最適pH使F-ATPase的表達量下降，同時強酸的環境壓力可以使細菌合成ATP不足，并破壞細胞質內的蛋白結構使之死亡[11]。通過對大腸桿菌的研究，Kasimoglu等[12]發現，F-ATPase的表達量在轉錄和翻譯水平的調控是多層次的，其中細菌的生長率在F-ATPase的產生和表達中起著比較重要的作用，大量細菌死亡也會導致生物膜中F-ATPase的表達量大大減少。同樣在pH5.0以下的環境，隨著變異鏈球菌的大量死亡，F-ATPase的基因表達在高糖和無糖環境中差異較小。

齲齒Keyes評分結果顯示，致齲組齲齒計分明顯高于對照組，且齲壞病變的程度要高于對照組，證明本實驗齲齒模型的建立成功。實驗中所使用的致齲飼料為高糖飼料，大鼠牙菌斑長期暴露在高糖的環境中，致齲菌有足夠的底物產酸，造成牙菌斑內pH持續下降，在齲病發生發展過程中，致齲組和對照組F-ATPase表達均逐漸增強，致齲組表達高于對照組，第9周后，致齲組增長程度有一定下降，對照組的表達有一定下降。在實驗過程中第5周時大鼠齲壞開始出現，在齲壞啟動前期，變異鏈球菌等致齲菌大量產酸，使菌斑內pH達到脫礦臨界值pH5.0~ 5.5。F-ATPase是一種應激蛋白，當外界環境pH下降時，變異鏈球菌F-ATPase基因表達上調，從而合成更多的F-ATPase蛋白以排除更多的氫離子維持細菌的生存，當更多的氫離子排到外環境時，環境中的pH繼續下降酸蝕牙齒致齲。當齲病發展到第9周時，牙菌斑內微生物已經形成一個穩定的動態平衡狀態，隨著唾液蛋白等的中和緩沖作用，牙菌斑內pH值上升[13]，F-ATPase表達下調。學者[14]分離臨床牙菌斑中變異鏈球菌，結果表明高齲牙菌斑變異鏈球菌分離株黏附、產酸和耐酸能力高于無齲牙菌斑分離株。本實驗中致齲組耐酸因子表達亦高于對照組。對照組大鼠使用的普通飼料內碳水化合物含量較低，大鼠本身的口腔自潔能力較強，唾液分泌較多，對菌斑內pH緩沖能力強，使菌斑pH維持在一個穩定的范圍，F-ATPase的表達也維持在一個穩定的范圍。

本文對變異鏈球菌耐酸毒力因子F-ATPase在不同pH中的基因表達進行了研究，并建立了大鼠致齲模型，結果顯示，變異鏈球菌F-ATPase在pH5.0時表達最高，致齲組大鼠在齲病發展過程中F-ATPase表達上調，提示耐酸毒力因子F-ATPase在釉質脫礦及齲病的形成中發揮著重要的作用。

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（本文編輯 ?李彩）

[中圖分類號]R?780.2

[文獻標志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.019

[收稿日期]2015-07-12；?[修回日期] ?2015-10-18

[基金項目]國家自然科學基金（31371473）；重慶市衛生局醫學科研計劃（2012-2-129）；重慶市衛生局醫學科研計劃重點項目（2011-1-062）；重慶市渝北區科技項目（2011）

[作者簡介]高敬，碩士，E-mail：326188065@qq.com

[通信作者]黃文明，講師，碩士，E-mail：jxhwm@163.com

Dynamic changes of aciduric virulence factor membrane-bound proton-translocating ATPase of Streptococcus mutans in the development of dental caries

Gao Jing, Huang Wenming. (Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University; Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences; Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering Higher Education, Chongqing 401147, China)
Supported by: Natural Science Foundation of China (31371473); Medical Scientific Research Plan of Chongqing Municipal Health Bureau (2012-2-129); Key Program for Medical Scientific Research Plan of Chongqing Municipal Health Bureau (2011-1-062); Scientific and Technical Program of Chongqing Yubei District (2011). Correspondence: Huang Wenming, E-mail: jxhwm@163.com.

[Abstract]Objective To?observe?the?dynamic?changes?of?membrane-bound?proton-translocating?ATPase?(F-ATPase)?in?the?development?of?dental?caries,?the?expression?of?Streptococcus mutans?F-ATPase?under?different?pH?concentrations?and?during?the?development?of?dental?caries?is?analyzed.?Methods??Streptococcus mutans?cultured?under?different?pH?(pH4.0-7.0)?concentrations?and?containing?5%?glucose?and?no?glucose?containing?BHI?were?collected.?RNA?was?extracted.?Subsequently,?F-ATPase?gene?was?detected?using?real-time?polymerase?chain?reaction.?Male?Wistar?rats?were?divided?randomly?into?caries?group?and?control?group.?The?rats?in?the?caries?group?were?fed?caries?feed?and?5%?glucose?water,?whereas?those?of?control?group?were?fed?normal?feed.?Total?RNA?was?extracted?from?plaque?samples,?which?were?collected?from?rats’?oral?cavity?every?two?weeks.?F-ATPase?gene?was?detected?by?real-time?PCR.?In?the?11th?week,?the?upper?and?lower?jaw?bone?specimens?of?rats?were?taken,?and?molar?caries?damage?assessed.?Results??The?expression?of?F-ATPase?in?the?caries?group?was?higher?than?that?in?the?control?group?(P<0.05).?In?addition,?the?gene?was?expressed?highest?in?pH5.0?and?the?lowest?in?pH4.0?(P<0.05).?2)?The?expression?of?F-ATPase?progressively?increased?during?the?caries?development?in?both?groups;?expression?in?the?caries?group?was?higher?than?that?in?control?group?(P<0.05).?Conclusion?Acid-resisting?viru-lence?factor?F-ATPase?is?related?closely?with?the?incidence?and?development?of?dental?caries.

[Key words]dental?caries;??dental?plaque;??membrane-bound?proton-translocating?ATPase;??pH