不同頻率微振動(dòng)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)及通透性的影響

朱卓立??馬瑞陽(yáng)??楊揚(yáng)??甘雪琦口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室?華西口腔醫(yī)院修復(fù)科（四川大學(xué)），成都?610041

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不同頻率微振動(dòng)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)及通透性的影響

朱卓立??馬瑞陽(yáng)??楊揚(yáng)??甘雪琦
口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室?華西口腔醫(yī)院修復(fù)科（四川大學(xué)），成都?610041

[摘要]目的 研究微振動(dòng)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）及通透性的影響。方法 培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），每日施加0.2、0.5、2、5?Hz?4種低頻率微振動(dòng)30?min，通過(guò)Tagman探針實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)VEGF的表達(dá)，并檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。結(jié)果 加載0.2?Hz和0.5?Hz微振動(dòng)可使血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF?mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），加載2?Hz和5?Hz振動(dòng)后VEGF?mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）；加載0.2?Hz和0.5?Hz微振動(dòng)可使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增強(qiáng)（P＜0.01），2?Hz和5?Hz微振動(dòng)則使內(nèi)皮細(xì)胞通透性降低（P＜0.01）。結(jié)論 0.2~0.5?Hz的微振動(dòng)可使血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF增高，并提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。

[關(guān)鍵詞]低頻微振動(dòng)； 內(nèi)皮細(xì)胞； 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子； 通透性

近年來(lái)，骨組織工程技術(shù)成為骨缺損修復(fù)的研究重點(diǎn)，其過(guò)程包括血管化、骨再生、骨端融合3個(gè)基本環(huán)節(jié)，其中血管化是骨愈合過(guò)程中最基本的環(huán)節(jié)，它能將參與骨發(fā)生與修復(fù)的相關(guān)細(xì)胞、信號(hào)分子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攜帶入微環(huán)境并帶走新陳代謝廢物及壞死分解產(chǎn)物以維持局部動(dòng)態(tài)微環(huán)境。目前，組織工程骨血管化的主要方法包括利用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular?endothelial?growth?factor，VEGF）、血管生成素（angiopoietin，Ang）等與生物材料復(fù)合促進(jìn)血管生長(zhǎng)，但因其在體內(nèi)迅速降解，故很難達(dá)到理想的效應(yīng)濃度[1]。因此，如何促進(jìn)促血管生長(zhǎng)因子的濃度增長(zhǎng)成為增強(qiáng)骨缺損修復(fù)血管化的新的突破點(diǎn)。既往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低幅度的高頻振動(dòng)能有效促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力[2]。因此本研究擬在細(xì)胞水平研究高頻率低強(qiáng)度的微振動(dòng)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)及通透性的影響，以期為微振動(dòng)在骨組織工程血管化的應(yīng)用提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1??材料和方法

1.1??主要材料和儀器

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human?umbilical?vein?endothelial?cell，HUVEC）（美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心提供），低糖培養(yǎng)基（L-glutamine?dulbecco’s?modified?eagle?medium，L-DMEM）（Gibco公司，美國(guó)），胎牛血清（fetal?bovine?serum，F(xiàn)BS）（Hyclone公司，美國(guó)），倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），GJX-5型振動(dòng)傳感器校準(zhǔn)儀（北京森德格科技有限公司）。

校準(zhǔn)儀可用于校準(zhǔn)加速度傳感器、速度傳感器及渦流位移傳感器，并可在垂直、水平兩個(gè)方向測(cè)量，它包括正弦信號(hào)源、功率放大器、振動(dòng)臺(tái)體、內(nèi)部基準(zhǔn)加速度傳感器及測(cè)量和顯示的電路。

1.2??細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

將HUVEC接種于25?mL培養(yǎng)瓶，加入含10%FBS 的L-DMEM培養(yǎng)基中，于37?℃、5%CO2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)90%時(shí)，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%乙二胺四乙酸（ethylenediamine?tetraacetic?acid，EDTA）混合物進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)，復(fù)蘇后細(xì)胞傳代培養(yǎng)至2~3代用于實(shí)驗(yàn)。將HUVEC以每毫升5×104個(gè)的密度接種于6孔板，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48?h后置于振動(dòng)儀上，分別加載0.2、0.5、2、5?Hz?4種振動(dòng)頻率，每日30?min，連續(xù)5?d，以正常HUVEC為對(duì)照組。

1.3??檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1??Tagman探針實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase?chain?reaction，PCR）檢測(cè)VEGF?mRNA的表達(dá) ??微振動(dòng)處理后，靜置1?h，加入1?mL?Trizol試劑于每個(gè)6孔板孔中，反復(fù)吹打，常溫放置5?min。加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15?s至乳膠狀，室溫放置15?min，4?℃下12?000?r·min-1離心10?min。取上層水相于另一個(gè)EP管中，加入500 μL異丙醇，混合均勻，4?℃放置10?min，?4?℃下12?000?r·min-1離心10?min。移去上清液，加入1?mL用0.1%焦碳酸二乙酯（diethyl?pyrocarbonate，DEPC）水配制的預(yù)冷的75%乙醇，混勻。4?℃下7?500?r·min-1離心15?min，盡量去除上清液，RNA沉淀室溫干燥12~15?min，加入25 μL DEPC水溶解RNA。而后檢測(cè)RNA純度及濃度，在260?nm和280?nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值，若A260/A280為1.8~2.1，取RNA濃度為25～50 ng·μL-1進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄后，通過(guò)配制Tagman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系，于ABI?7000熒光定量PCR儀（ABI）中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95?℃?3?min；95?℃?12?s，62?℃?40?s，40個(gè)循壞。

1.3.2??蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)VEGF的表達(dá) ?微振動(dòng)處理后，靜置1?h再進(jìn)行細(xì)胞裂解：4?℃下12?000?r·min-1離心15?min，取上清，裂解液裂解細(xì)胞，收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4~15?min，4?℃下14?000?r·min-1離心15?min，棄沉淀，取上清備用。電泳分離：取15 μL上清液至10?cm×10?cm膠上電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1?h，1∶1?000加入VEGF抗體，再加入羊抗兔二抗，37?℃孵育45?min，緩沖液洗滌30?min，每10?min換液1次。在暗室中壓片，顯影、定影后進(jìn)行圖像分析。

1.3.3???內(nèi)皮細(xì)胞通透性的檢測(cè) ??將HUVEC接種到24孔帶濾網(wǎng)培養(yǎng)板上層小室中，培養(yǎng)使細(xì)胞鋪滿濾網(wǎng)表面后，施加微振動(dòng)處理，而后培養(yǎng)基換為無(wú)酚紅DMEM，在上層小室中加入FITC-dextran（相對(duì)分子質(zhì)量為70?000）（2.5 μmol·L-1）。2?h后，移去濾網(wǎng)，下層培養(yǎng)板中的熒光量在494?nm激發(fā)光和521?nm發(fā)射光處定量測(cè)量。

2??結(jié)果

2.1??細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

培養(yǎng)的HUVEC具有典型的血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，體積較小，緊密排列在一起，呈鋪路石樣。細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。

2.2??施加微振動(dòng)對(duì)VEGF表達(dá)的影響

不同振動(dòng)頻率下VEGF?mRNA和蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖1、2。由圖1、2可見(jiàn)，在連續(xù)培養(yǎng)5?d后，施加0.2?Hz和0.5?Hz微振動(dòng)的HUVEC較對(duì)照組明顯上調(diào)了VEGF?mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)（P＜0.05），而施加2?Hz和5?Hz微振動(dòng)可使VEGF?mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）。0.2?Hz與0.5?Hz微振動(dòng)組相比，2?Hz 與5?Hz微振動(dòng)組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3??內(nèi)皮細(xì)胞通透性

不同振動(dòng)頻率對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，施加0.2?Hz和0.5?Hz微振動(dòng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，其細(xì)胞通透性明顯高于對(duì)照組（P＜0.01)，而施加2?Hz和5?Hz微振動(dòng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性則低于對(duì)照組（P＜0.01)。0.2?Hz與0.5?Hz微振動(dòng)組相比，2?Hz與5?Hz微振動(dòng)組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖 ?1??不同振動(dòng)頻率下VEGF?mRNA的表達(dá)?Fig?1??The?expression?of?VEGF?mRNA?under?different?frequency?of??microvibration

圖 ?2??不同振動(dòng)頻率下VEGF蛋白的表達(dá)?Fig?2??The?expression?of?VEGF?protein?under?different?frequency?of??microvibration

圖 ?3??不同振動(dòng)頻率對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響?Fig?3??The?permeability?of?endothelial?cells?under?different?frequency???of?microvibration

3??討論

骨組織工程血管化是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，內(nèi)皮細(xì)胞是影響骨缺損修復(fù)血管化的因素之一，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移能促進(jìn)血管的生成[3]。VEGF是作用最強(qiáng)的促血管生長(zhǎng)因子，能特異性、多途徑地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其增殖及毛細(xì)血管瓣生成，從而促進(jìn)新生血管生成[4-5]。

微振動(dòng)是一種極低幅度低強(qiáng)度（low-amplitude，LA≤50 μm；low-magnitude，LM<1×g）的力學(xué)信號(hào)。近年來(lái)，許多研究[6-8]表明微振動(dòng)可以促進(jìn)骨的愈合。

已有實(shí)驗(yàn)證明，在微振動(dòng)對(duì)骨愈合的實(shí)驗(yàn)中，微振動(dòng)刺激使骨折端血流量較對(duì)照組具有顯著的增加[9]。實(shí)施微振動(dòng)可能是通過(guò)增加VEGF表達(dá)，使毛細(xì)血管再生增加，增進(jìn)了骨痂的生長(zhǎng)，但是其在體內(nèi)的確切分子生物學(xué)機(jī)理尚不清楚，且尚未有研究涉及微振動(dòng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響。本研究選用HUVEC作為研究對(duì)象，因其具有一般內(nèi)皮細(xì)胞的性能。本研究以其為模型來(lái)研究微振動(dòng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)以及細(xì)胞通透性的影響，具有一定意義。

本實(shí)驗(yàn)利用Tagman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR高度特異性、靈敏性和精確性的特點(diǎn)，檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF?mRNA的表達(dá)，并采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，微振動(dòng)能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF?mRNA和蛋白的表達(dá)，其中，0.2~0.5?Hz的微振動(dòng)較對(duì)照組明顯上調(diào)了血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)（P＜0.05），說(shuō)明較低頻率的微振動(dòng)能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF，促進(jìn)新生血管的生成，這可能是微振動(dòng)增進(jìn)骨缺損修復(fù)血管化的機(jī)制之一；而2~5?Hz的微振動(dòng)較對(duì)照組明顯下調(diào)了血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)（P＜0.01）。

Lal等[10]的研究結(jié)果表明，VEGF通過(guò)激活蛋白激酶B（protein?kinase?B，PKB/akt）通路、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial?nitric?oxide?synthase，eNOS）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated?protein?kinases，MAPK）通路來(lái)增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性。值得一提的是，參與該調(diào)控過(guò)程的細(xì)胞通路與VEGF誘導(dǎo)血管生成和細(xì)胞存活的通路相同，但其機(jī)制還有待闡明。Gavard等[11]發(fā)現(xiàn)，VEGF可通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮鈣黏蛋白β-arrestin2依賴的細(xì)胞內(nèi)吞作用來(lái)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞通透性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的檢測(cè)結(jié)果表明，0.2~0.5?Hz微振動(dòng)組在提高VEGF表達(dá)的同時(shí)，明顯提高了血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性；而2~5?Hz微振動(dòng)組表現(xiàn)為VEGF表達(dá)下調(diào)，同時(shí)其血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性下降。本研究揭示了微振動(dòng)所致的VEGF表達(dá)改變與其所致的內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變有所關(guān)聯(lián)，提示微振動(dòng)可能是通過(guò)改變內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF表達(dá)量從而調(diào)控細(xì)胞的通透性，然而其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。不同頻率的微振動(dòng)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生不同的影響，有研究[12]表明，微振動(dòng)的頻率不同，骨折愈合的結(jié)果也會(huì)不相同，但其機(jī)制尚未闡明。而大量研究[13-15]表明血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)不同的力學(xué)信號(hào)刺激的反應(yīng)不同。

綜上所述，本研究顯示，加載適當(dāng)頻率的微振動(dòng)能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)進(jìn)而影響內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。深入了解微振動(dòng)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞影響的分子機(jī)制以及如何更加有效地向有利于骨缺損修復(fù)血管化的方向調(diào)節(jié)尚有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 ?杜冰）

[中圖分類號(hào)]Q?68

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.006

[收稿日期]2015-08-03；?[修回日期] ?2016-01-16

[基金項(xiàng)目]高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20120181120007）

[作者簡(jiǎn)介]朱卓立，主治醫(yī)師，博士，E-mail：zzl7507@126.com

[通信作者]甘雪琦，主治醫(yī)師，博士，E-mail：xueqigan@scu.edu.cn

Effects of different frequency microvibrations in the vascular endothelial growth factor expression and permeability of vascular endothelial cell

Zhu Zhuoli, Ma Ruiyang, Yang Yang, Gan Xueqi. (State Key Laboratory of Oral Diseases, Dept. of Prosthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Supported by: Specialized Research Fund for The Doctoral Program of Higher Education (20120181120007). Correspondence: Gan Xueqi, E-mail: xueqigan@scu.edu.cn.

[Abstract]Objective This?study?aimed?to?evaluate?the?vascular?endothelial?growth?factor?(VEGF)?expression?and?permeability?of?vascular?endothelial?cell?under?microvibration.?Methods???Human?umbilical?vein?endothelial?cell?(HUVEC)?were?cultured,?randomly?vibrated?under?low?frequency?of?0.2,?0.5,?2,?5?Hz,?30?min?per?day.?The?VEGF?mRNA?level?was?detected?by?Tagman?probe?real-time?fluorescence?quantitative?polymerase?chain?reaction?(PCR),?and?the?VEGF?protein?expression?level?was?detected?by?Western?blot.?The?permeability?of?vascular?endothelial?cell?was?evaluated.?Results???Compared?with?the?blank?control?group,?the?mRNA?and?protein?expression?level?of?VEGF?were?significantly?increased?under?0.2,?0.5?Hz?microvibration?(P＜0.05),?and?decreased?under?2,?5?Hz?microvibration?(P＜0.01).?The?vascular?endothelial?permeability?increased?under?0.2,?0.5?Hz?microvibration?(P＜0.01),?whereas?the?permeability?decreased?under?2,?5?Hz?microvibration?(P＜0.01).?Conclusion??0.2-0.5?Hz?microvibration?can?up-regulate?the?expression?of?VEGF?mRNA?and?protein?in?vascular?endothelial,?and?increase?the?permeability.

[Key words]low?frequency?microvibration; endothelial?cell; vascular?endothelial?growth?factor;??permeability