Notch1蛋白高表達(dá)抑制破骨細(xì)胞增殖和分化

平依林??婁鋒??楊肖??張平口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室?華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)），成都?610041

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Notch1蛋白高表達(dá)抑制破骨細(xì)胞增殖和分化

平依林??婁鋒??楊肖??張平
口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室?華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)），成都?610041

[摘要]目的 ??探究體外培養(yǎng)條件下Notch1蛋白高表達(dá)對(duì)細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（MCSF）誘導(dǎo)的骨髓源破骨細(xì)胞增殖分化的影響。方法 ??體外培養(yǎng)Rosa-notch1轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），采用RANKL和MCSF刺激BMSCs向破骨細(xì)胞方向分化。培養(yǎng)至第3天，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染攜帶Cre重組酶和綠色熒光蛋白（GFP）的重組腺病毒（Ad-Cre-GFP）和攜帶GFP的重組腺病毒（Ad-GFP），啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)組Notch1高表達(dá)，采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)Notch信號(hào)通路成分（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Delta1、Delta3、Delta4、Jagged1）、靶基因（Hes1）mRNA表達(dá)量以及抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）在誘導(dǎo)后mRNA的表達(dá)量。采用TRAP染色法觀察破骨細(xì)胞增殖分化情況。結(jié)果 ??TRAP染色顯示實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞形成數(shù)量明顯少于對(duì)照組（P<0.05）。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Notch1、Notch3、Jagged1、Delta3、Hes1?mRNA表達(dá)量明顯增高（P<0.05），TRAP的mRNA表達(dá)量明顯降低（P<0.05）。結(jié)論 ??Notch1高表達(dá)抑制RANKL和MCSF誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞增殖分化。

[關(guān)鍵詞]Notch1； 破骨細(xì)胞； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

牙槽骨吸收是各型牙周炎主要癥狀之一，牙槽骨吸收過程中破骨細(xì)胞的激活和功能亢進(jìn)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其增殖、分化受到Notch信號(hào)通路的調(diào)控[1-3]。研究破骨細(xì)胞增殖、分化過程中Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)作用，可以進(jìn)一步了解牙槽骨吸收機(jī)制；抑制Notch信號(hào)通路可能成為治療牙槽骨吸收提供新依據(jù)。已有研究[1]表明，敲除骨髓源巨噬細(xì)胞Notch1，將促使其向破骨細(xì)胞方向分化。然而，Notch1蛋白高表達(dá)對(duì)破骨細(xì)胞增殖、分化有何影響，目前仍不明確。本研究旨在探討在體外培養(yǎng)條件下，Notch1蛋白高表達(dá)對(duì)破骨細(xì)胞增殖、分化的影響。

1??材料和方法

1.1??實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取8周齡SPF級(jí)雄性轉(zhuǎn)基因小鼠Rosa-notch1（The?Jackson?Laboratory，美國）6只，體重（19±2）?g。

1.2??試劑

α-MEM、胎牛血清（Hyclone公司，澳大利亞），青霉素/鏈霉素（Hyclone公司，美國），腺病毒（上海漢恒生物有限公司），鼠重組細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate?resistant?acid?phosphatase，TRAP）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage?colony-stimulating?factors，MCSF）（Peprotech公司，美國），染色試劑盒（Sigma公司，美國），TRIzol提取液（Invitrogen公司，美國），QuantiTect?反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（reverse?transcription-polymerase?chain?reaction，RT-PCR）試劑盒（凱基公司，德國），ABI7300?RTPCR儀（Applied?Biosystems公司，美國）。

1.3??破骨細(xì)胞培養(yǎng)及病毒轉(zhuǎn)染

頸椎脫臼法處死8周齡雄性Rosa-notch1小鼠，75%乙醇浸泡消毒2?min，無菌條件下分離股骨及脛骨，剪斷兩側(cè)骨骺端，用注射器針頭插入斷端，將培養(yǎng)基輕輕沖洗骨髓腔于50?mL無菌離心管中。采用注射器吹打骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone?marrow?stem?cells，BMSCs）呈懸浮液，過濾，計(jì)數(shù)，用α-MEM培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整至每毫升3×105個(gè)，加入10-5mol·L-1MCSF，混勻后鋪盤（48孔板），每孔培養(yǎng)基500 μL（含10?ng·mL-1MCSF)。37?℃、5%CO2條件下用完全培養(yǎng)基（含α-MEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素）培養(yǎng)至第3天，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)基中分別加入1 μL 1010pfu·mL-1攜帶Cre重組酶和綠色熒光蛋白（green?fluorescent?protein，GFP）的重組腺病毒（Ad-Cre-GFP）和攜帶GFP的重組腺病毒（Ad-GFP），8?h換液，并加入10-5mol·L-1RANKL，致MCSF和RANKL終濃度均為10?ng·mL-1。轉(zhuǎn)染病毒36?h后觀察對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)綠色熒光（圖1），表明病毒轉(zhuǎn)染成功。培養(yǎng)第4天起每天全換液，加入新鮮配制的完全培養(yǎng)基（含10?ng·mL-1MCSF，10?ng·mL-1RANKL）。

1.4???采用RT-PCR法檢測(cè)Notch信號(hào)通路成分、下游靶基因Hes1及TRAP?mRNA表達(dá)量

培養(yǎng)至第8天時(shí)，去培養(yǎng)基，每6孔加入1?mL? TRIzol，靜置2~3?min后，將含有細(xì)胞的TRIzol轉(zhuǎn)至去RNA酶1.5?mL離心管，加入200 μL氯仿，振蕩，室溫放置3?min，12?000?r·min-14?℃離心15?min，轉(zhuǎn)上層水相至新去RNA酶1.5?mL離心管，加入異丙醇500 μL，混合后靜置10?min，12?000?r·min-14?℃離心10?min，去上清，加入1?mL?75%乙醇，振蕩混合2~ 3?min，10?000?r·min-14?℃離心5?min，倒掉上清，室溫放置20?min使RNA沉淀干燥，加20 μL經(jīng)焦碳酸二乙酯處理雙蒸水至EP離心管中。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA260?nm/RNA280?nm光密度值以檢測(cè)RNA樣品的純度和濃度。按QuantiTect?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒標(biāo)明的操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR?GREEN試劑盒進(jìn)行RT-PCR分析，檢測(cè)Notch信號(hào)通路成分（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Delta1、Delta3、Delta4、Jagged1）、Hes1?mRNA表達(dá)量以及TRAP在誘導(dǎo)后mRNA的表達(dá)量。設(shè)計(jì)針對(duì)基因與β-actin內(nèi)參照的引物，具體如下。Notch1正義鏈5’-CTGAGGCAAGGATTGGAGTC-3’，反義鏈5’-GAATGGAGGTAGGTGCGAAG-3’；Notch2正義鏈5’-TGTGCCGTTGTGGTAGGTAA-3’，反義鏈5’-TGCTGTGGCTCTGGCTGT-3’；Notch3正義鏈5’-GAATCTGGAAGACACCCTGG-3’，反義鏈5’-AAGCGTCTCCTGGATGCTG-3’；Notch4正義鏈5’-TTCTGTCCCTCATAGCCTGG-3’，反義鏈5’-GGATAATATGAACCCCTGCG-3’；Delta1正義鏈5’-CTCCCCTGGTTTGTCACAGT-3’，反義鏈5’-GGAGAAGATGTGCGACCCT-3’；Delta3正義鏈5’-GTTCCCATCACAAGGTCCAG-3’，反義鏈5’-TCCCTGTCTCCACCAGTAGC-3’；Delta4正義鏈5’-TATAACCCTTTGGCCCACTG-3’，反義鏈5’-ATGGGGAGGTCTGTTTTGTG-3’；Jagged1正義鏈5’-GGCGAAACTGAAAGGCAGTA-3’，反義鏈5’-GCTTCGGCTCAGGGTCTAC-3’；Hes1正義鏈5’-GGTATTTCCCCAACACGCT-3’，反義鏈5’-GGCAGACATTCTGGAAATGA-3；TRAP正義鏈5’-GCAAGGTCCCCAACGGCTATC-3’，?反義鏈5’-GCCTCGGCAGCCTGGTCT-3’。

PCR反應(yīng)體系均為20 μL，反應(yīng)液各成分分別為SYBR?Premix?Ex?Taq?Ⅱ10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，DNA模板2.0 μL，dH2O 6.0 μL，ROXReference?Dye?Ⅱ0.4 μL。每組4個(gè)復(fù)孔。其相對(duì)表達(dá)量采用ΔΔCt方法計(jì)算。

1.5??TRAP染色及TRAP陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)

將小鼠BMSCs接種于48孔板中，按上述分組培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次。4%多聚甲醛液固定10?min，PBS洗2次，37?℃條件下用TRAP染色液染色30?min，雙蒸水洗3次。顯微鏡下觀察并進(jìn)行破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞核數(shù)目3個(gè)或3個(gè)以上，且TRAP染色呈陽性的細(xì)胞視為破骨細(xì)胞。

圖 ?1??病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，小鼠BMSCs細(xì)胞表達(dá)GFP??熒光顯微鏡 ?×?40?Fig?1??BMSCs?those?transfected?successfully?expressed?GFP??fluo-??rescence?microscope??×?40

1.6??統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS?18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，破骨細(xì)胞數(shù)目以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)分析兩組破骨細(xì)胞數(shù)量是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 ?結(jié)果

2.1??Notch信號(hào)成分、下游靶基因Hes1及TRAP?mRNA?????的表達(dá)量

RANKL和MCSF誘導(dǎo)Rosa-notch1小鼠BMSCs向破骨方向分化至第8天，檢測(cè)2組Notch信號(hào)成分、Hes1、TRAP?mRNA的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Delta1、Delta3、Delta4、Jagged1、Hes1、TRAP?mRNA表達(dá)量比值分別為2.546±0.435、1.784±0.342、1.980±0.188、0.876± 0.197、1.261±0.361、2.162±0.302、1.084±0.154、3.093±0.376、2.750±0.081、0.421±0.012。2組Notch1、Notch3、Delta3、Jagged1、Hes1、TRAP?mRNA表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞中Notch1、Notch3、Jagged1、Delta3、Hes1表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05），提示Notch信號(hào)通路參與骨髓源破骨細(xì)胞增殖分化過程。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞中TRAP?mRNA相對(duì)表達(dá)量卻明顯低于對(duì)照組（P<0.05），提示Notch1高表達(dá)抑制破骨細(xì)胞增殖分化。

2.2??破骨細(xì)胞的TRAP染色

培養(yǎng)至8天時(shí)破骨細(xì)胞數(shù)目及大小出現(xiàn)明顯差異，此時(shí)行TRAP染色，顯微鏡下觀察可見，對(duì)照組破骨細(xì)胞較實(shí)驗(yàn)組數(shù)目多，分化成熟（圖2）。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組破骨細(xì)胞的形成數(shù)量分別為（111.5± 6.6）和（191.8±23.8）個(gè)，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖 ?2??TRAP染色后破骨細(xì)胞的形態(tài) ?體視顯微鏡 ?×?25?Fig?2??Osteoclasts?morphology?with?TRAP?staining??stereomicro-??scope??×?25

3 ?討論

在哺乳動(dòng)物中，Notch信號(hào)通路成分簡(jiǎn)單，包括4種受體（Notch1、2、3、4）和5種配體（Jagged1、2，Delta?1、3、4）和DNA結(jié)合蛋白。相鄰細(xì)胞膜上受配體相互作用，Notch受體胞內(nèi)段（Notch?intracellulardomain，NICD）從膜上釋放，NICD進(jìn)入細(xì)胞核后與DNA結(jié)合的抑制蛋白轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)錄激活因子，激活下游靶基因的表達(dá)，從而調(diào)控多種細(xì)胞的增殖、分化過程[4-5]。破骨細(xì)胞增殖分化受到Notch信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[6-7]。在牙周炎中，破骨細(xì)胞分化的激活和功能亢進(jìn)是牙周病牙槽骨吸收的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]，對(duì)破骨細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制的探討，可進(jìn)一步了解牙周病過程中牙槽骨吸收原理，為防治牙槽骨吸收提供新思路。

在本研究中，為了使Notch信號(hào)通路激活，將Rosa-notch1小鼠BMSCs由RANKL和MCSF誘導(dǎo)分化培養(yǎng)至第3天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞分別進(jìn)行Ad-Cre-GFP病毒和Ad-GFP病毒轉(zhuǎn)染。Ad-Cre-GFP病毒轉(zhuǎn)染成功后表達(dá)Cre重組酶和GFP，Cre重組酶可由2個(gè)各含有一個(gè)lox序列的核酸序列進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組，使Rosa-notch1小鼠BMSCs內(nèi)終止子敲除，從而啟動(dòng)Notch1蛋白高表達(dá)激活Notch信號(hào)通路。而Ad-GFP病毒轉(zhuǎn)染后，只表達(dá)GFP，無Cre重組酶，因此不能啟動(dòng)Notch1高表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)至第8天，大量破骨細(xì)胞形成，實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞中多種Notch信號(hào)成分及下游靶基因表達(dá)增強(qiáng)，TRAP?mRNA表達(dá)量降低。Notch1高表達(dá)后，Delta3、Jagged1配體mRNA表達(dá)量上升，提示參與破骨細(xì)胞分化的受配體對(duì)可能是Notch1-Jagged1或Notch1-Delta3。Notch1高表達(dá)后，多核破骨細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，提示在體外培養(yǎng)環(huán)境下，Notch1高表達(dá)可能抑制骨髓源破骨細(xì)胞的增殖、分化過程。該研究在體外實(shí)驗(yàn)中通過病毒轉(zhuǎn)染，成功啟動(dòng)Notch1蛋白高表達(dá)來刺激Notch信號(hào)通路，是本研究一大創(chuàng)新之處。但本研究也存在一定不足：本研究?jī)H采用體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境存在差異，所以仍需在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)進(jìn)行基因敲除來進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

與本研究類似，Bai等[1]研究表明，體外敲除骨基質(zhì)巨噬細(xì)胞中的Notch1可以促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的增殖與分化。王汝杰等[9]研究認(rèn)為Jagged1可以抑制RAW264.7細(xì)胞的增殖，而加入DAPT阻斷Notch通路后Jagged1抑制RAW264.7細(xì)胞增殖作用明顯減弱。以上研究結(jié)果也提示Notch信號(hào)通路對(duì)破骨細(xì)胞有抑制作用。

Sekine等[10]研究提示Dll?1通過與Notch?2受體結(jié)合促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，并且在破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中，Dll?1/Notch?2間的正向調(diào)控效應(yīng)為主導(dǎo)作用。何飛等[11]研究提示，參與RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的主要受-配體對(duì)可能是Notch2-Jagged1。

目前關(guān)于Notch1蛋白對(duì)破骨細(xì)胞增殖、分化的影響仍存在差異，其原因可能是：首先，各文獻(xiàn)中破骨細(xì)胞所處的狀態(tài)有差異，眾所周知，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞所處微環(huán)境迥異，可能導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)有差異。其次，Notch信號(hào)通路包含多種受體配體，研究[12-13]提示Notch信號(hào)通路中不同受體配體組合在同一細(xì)胞中可能發(fā)揮不同的作用，所以不同Notch受-配體組合在破骨細(xì)胞分化作用機(jī)制是否相同仍有待研究。

總之，筆者的研究提示Notch1蛋白參與并抑制體外培養(yǎng)條件下骨髓源破骨細(xì)胞的增殖分化，但其具體機(jī)制仍不甚明確，值得進(jìn)一步探討。

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（本文采編 ?石冰）

[中圖分類號(hào)]Q?257

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.003

[收稿日期]2015-07-20；?[修回日期] ?2015-11-06

[作者簡(jiǎn)介]平依林，碩士，E-mail：771319243@qq.com

[通信作者]張平，教授，博士，E-mail：pingzhang68@hotmail.com

Up-regulation of Notch1 inhibits proliferation and differentiation of osteoclast in vitro

Ping Yilin, Lou Feng, Yang Xiao,Zhang Ping. (State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Correspondence: Zhang Ping, E-mail; pingzhang68@hotmail.com.

[Abstract]Objective ?This?study?aimed?to?explore?the?effect?of?the?up-regulation?of?Notch1?on?osteoclastogenesis?induced?to osteoclasts by receptor activator for nuclear factor-κB ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factors (MCSF) in vitro. Methods ??The?bone?marrow?stem?cells?(BMSCs)?of?Rosa-notch1mice?were?cultured?and?induced?to?osteoclasts?by?RANKL?and?MCSF.?The?BMSCs?were?transfected?with?the?Ad-Cre-green?fluorescent?protein?(GFP)?virus?or?Ad-GFP?virus.?Total?RNA?from?cells?was?extracted,?and?the?gene?expression?levels?of?Notch1,?Notch2,?Notch3,?Notch4,?Delta1,?Delta3,?Delta4,?Jagged1,?Hes1,?and?tartrate?resistant?acid?phosphatase?(TRAP)?were?detected?at?the?defined?stage?by?reverse?transcriptionpolymerase?chain?reaction?(RT-PCR).?Osteoclast?formation?was?analyzed?by?TRAP?assay.?Results ?The?number?of?TRAP-positive?multinuclear?cells?of?the?experimental?group?significantly?decreased?compared?with?that?of?the?control?group.?The?mRNA?expression?levels?of?Notch1,?Notch3,?Jagged1,?Delta3,?and?Hes1?of?the?experimental?group?were?significantly?higher?than?those?of?the?control?group,?whereas?the?TRAP?mRNA?expression?of?the?experimental?group?was?significantly?lower?than?that?of?the?control?group?(P<0.05).?Conclusion ?Up-regulation?of?Notch1?inhibit?osteoclastogenesis?of?BMSCs?induced?by?RANKL?and?MCSF?in vitro.

[Key words]Notch1;??osteoclast;??bone?marrow?stem?cells