視黃酸信號通路調控咽弓神經嵴影響斑馬魚牙齒發育的研究

劉鑫??黃興??徐智云??楊德琴重慶醫科大學附屬口腔醫院牙體牙髓病科·口腔疾病與生物醫學重慶市重點實驗室，重慶?401147

?

·基礎研究·

視黃酸信號通路調控咽弓神經嵴影響斑馬魚牙齒發育的研究

劉鑫??黃興??徐智云??楊德琴
重慶醫科大學附屬口腔醫院牙體牙髓病科·口腔疾病與生物醫學重慶市重點實驗室，重慶?401147

[摘要]目的 研究視黃酸（RA）信號通路在斑馬魚顱神經嵴遷移至咽弓神經嵴對牙齒發育的影響。方法 將野生型斑馬魚胚胎與轉基因斑馬魚胚胎各分為3組，分別采用1×10-7~6×10-7mol·L-1梯度濃度的RA（RA處理組）、1× 10-7mol·L-1的4-二乙氨基苯甲醛（DEAB）（DEAB處理組）、與RA處理組相應濃度的二甲基亞砜（DMSO對照組）處理24?hpf胚胎9?h。制備dlx2a、barx1、dlx2b基因的反義探針，運用整胚原位雜交技術檢測野生型斑馬魚48~72?hpf胚胎的dlx2a、dlx2b、barx1基因表達，熒光顯微鏡觀察轉基因斑馬魚4?dpf胚胎。結果 獲得3個基因的反義mRNA探針。與DMSO對照組相比，1×10-7mol·L-1RA處理組barx1、dlx2a在咽弓神經嵴的表達明顯增強，并有由咽弓神經嵴向后段咽弓牙齒萌出位點遷移的趨勢，綠色熒光向周邊咽弓擴散；4×10-7mol·L-1RA處理組胚胎致畸率和死亡率極高，3×10-7mol·L-1RA處理組1/3胚胎發育遲緩。DEAB處理組神經嵴發育不良，barx1、dlx2a表達降低，dlx2b在牙齒位點的表達有所延遲。結論 RA能夠通過調控咽弓神經嵴發育過程，進而調控牙齒發育前體細胞，最終達到調控牙齒發育的過程。

[關鍵詞]視黃酸信號通路； 牙齒發育； 神經嵴； 斑馬魚

牙齒發育是顱神經嵴來源的間充質細胞在牙齒形態發生時與牙源性上皮細胞相互作用的結果。研究[1-2]表明，神經嵴細胞與牙本質涎磷蛋白的調控、牙周韌帶的形成關系密切。人類正在發育的牙齒根尖段牙髓中可分離出神經嵴干細胞[3]。在早期發育過程中，顱神經嵴分化完成后由腦部遷徙至牙齒發生部位，參與牙齒的形成[4]。這一過程中涉及大量的生長因子及信號介導，而信號通路的微小量變就可能導致繁復多樣的表型發生。在脊椎動物中，牙齒形態表現出對進化的高度敏感性，與進化程度較高的鼠類或大型哺乳類不同，由于進化程度較低，信號調控對斑馬魚牙齒的數量與形態更具多樣性。此外，斑馬魚的牙齒形態及發育過程與哺乳動物相似，使其成為牙齒發育信號途徑機制研究的理想模式動物。

視黃酸（retinoic?acid，RA）是維生素A家族的一員，為視黃醇在體內經多次氧化合成的代謝產物，是牙齒發育過程中的信號途徑之一。RA在心臟、神經、骨骼和牙齒等器官中都有參與發育和維持生理功能的作用。Ritchie等[5]證實RA信號通過對大鼠牙本質涎磷蛋白的調控對牙本質礦化具有作用。Seritrakul等[6]研究發現，增加RA的攝入量可以使斑馬魚因退化而消失的牙齒重新萌出。Gibert等[7]認為，微量改變RA的水平可以調節魚類牙齒的進化方向。目前對于RA是否參與顱神經嵴后遷至斑馬魚咽弓分化為咽弓神經嵴、調控咽弓間充質干細胞參與牙齒的發生，還不甚清楚。

本研究利用梯度濃度外源性視黃酸RA及其視黃醛脫氫酶2（raldh2）抑制劑4-二乙氨基苯甲醛（4-diethylaminobenzaldehyde，DEAB）對野生型斑馬魚進行處理，選擇顱神經嵴標記物dlx2[8]、咽弓神經嵴與咽間充質標記物barx1[9]、咽齒牙源性上皮特異性標記物dlx2b[10]制備反義探針，檢測藥物處理后的各組胚胎，輔以dlx2b：GFP轉基因魚的的熒光觀察。本研究的目的是初步探索RA信號在神經嵴遷移過程中的作用機理，為進一步揭示RA信號在牙齒形態發生與牙列數目進化中的調控作用提供基礎依據。

1??材料和方法

1.1??實驗動物與飼養

實驗動物為2種類型的斑馬魚：AB?Go野生型斑馬魚和轉基因斑馬魚Tg（dlx2b：GFP），均從西南大學分子發育實驗室獲得。斑馬魚飼養于28.5?℃水溫、14?h光照、10?h黑暗的標準條件下，按雌雄比例1︰1或者1︰2放入交配缸內并隔開，次日8:30拉開隔板，日光燈刺激產卵，9點收集斑馬魚受精卵并清洗，置于28.5?℃恒溫孵育箱中進行孵育和培養。用于整胚原位雜交的胚胎培養液（egg?water）中添加0.04%的1-苯基-2-硫脲（phenylthiourea，PTU）孵育，控制色素形成。

1.2??主要試劑及設備

聚合酶鏈式反應（polymerase?chain?reaction，PCR）引物合成及測序由上海英駿生物技術有限公司合作完成。PCR?purification?Kit試劑盒（Qiagen公司，美國），Prime?Star?DNA合成酶（Takara公司，日本），RA試劑、DEAB（Sigma公司，美國），逆轉錄試劑盒（Roche公司，瑞士），RNA提取試劑盒（Life?Technologies公司，美國），?RNA探針純化試劑盒（GE公司，美國），臺式離心機、PCR儀（Eppendorf公司，德國）。

1.3??藥物配置與分組處理

DEAB和RA分別先溶于100%二甲基亞砜（dimethyl?sulfoxid，DMSO）中，然后胚胎培養液稀釋成工作濃度待用。DEAB工作濃度為10-7mol·L-1，RA工作濃度梯度是1×10-7~6×10-7mol·L-1。

將野生型斑馬魚胚胎與轉基因斑馬魚胚胎各分為3組：RA處理組、DEAB處理組、DMSO對照組，在胚胎24?hpf（hours?post?fertilization，受精后小時）按照不同方式進行藥物處理，胚胎培養液中均加入0.04%?PTU。RA處理組在胚胎培養液中分別加入6× 10-7、5×10-7、4×10-7、3×10-7、1×10-7mol·L-1的RA，DEAB處理組加入1×10-7mol·L-1的RA合成酶抑制劑DEAB，DMSO對照組加入與RA處理組相應濃度的DMSO，恒溫孵育箱（28.5?℃）中避光培養9?h。

藥物處理后用相應濃度的DMSO?胚胎培養液分別洗3遍，保證無藥劑殘留后放回恒溫孵育箱。收集野生型斑馬魚48~72?hpf的胚胎用于整胚原位雜交，收集轉基因魚4?dpf（days?post?fertilization，受精后天數）的胚胎用于熒光顯微鏡檢測。

1.4??barx1、dlx2a、dlx2b反義探針的制備

收集野生型斑馬魚3~5?dpf的胚胎，用Trizol法提取胚胎的總RNA，利用紫外可見分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度及完整性，進行逆轉錄合成3~5?dpf胚胎的cDNA，-20?℃儲存備用。利用斑馬魚cDNA文庫中barx1、dlx2a、dlx2b基因序列設計探針引物，分別為barx1正向：5’-ATGCAACATCCTT-TGGAGATTGG-3’，反向：5’-TTATTCCTCTTGGTTTGCATCAG-3’；dlx2a正向：5’-ATGACTGGAGTTTTTGACAGCCTC-3’，反向5’-TCAAAATATGGTCCCGGCGCTAA-3’；dlx2b正向：5’-CAGTGGGCTGCTCTGAAACTGT-3’，反向5’-ACTAGTGATCCTGGCACGGTGG-3’。以上述合成的cDNA為模板進行擴增。連接產物于pGEMT載體上，利用DH5α感受態菌株進行電穿孔轉化，篩選AMP抗性陽性克隆質粒，通過限制性內切酶EcoRⅠ的酶切反應，驗證重組質粒中克隆片段的大小，確認與目的片段一致后送上海英駿生物技術有限公司完成測序。測序結果與3種基因CDS區域一致，插入片段連接方向為barx1 和dlx2b反向，限制性內切酶SalⅠ酶切線性化質粒，dlx2a正向，限制性內切酶SphⅠ酶切線性化質粒，T7及SP6?RNA聚合酶體外轉錄體系加入地高辛標記的寡核苷酸進行轉錄，轉錄后用DnaseⅠ酶消化殘留DNA，產物經GE?Y50純化試劑盒純化后得到地高辛標記的dlx2a、dlx2b、barx1反義探針，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA探針質量并保存于-20?℃冰箱。

1.5??整胚原位雜交

運用整胚原位雜交技術檢測3組野生型斑馬魚胚胎的dlx2a、dlx2b、barx1基因表達。收集48~72?hpf的胚胎，4%多聚甲醛4?℃過夜固定，甲醇梯度脫水，儲存于-20?℃、100%甲醇溶液中。按照脫水、復水、消化、終止消化、預雜交、雜交、封閉、顯色、顯色終止的實驗方法進行原位雜交，顯微鏡下觀察顯色成功后終止染色，拍照儲存并進行分析。

1.6??熒光顯微鏡檢測

收集轉基因魚4?dpf的胚胎，麻醉劑tricaine麻醉后用熒光顯微鏡觀察胚胎，主要觀察咽弓位置是否有綠色熒光以及熒光表達范圍。觀察后使用胚胎培養液洗脫麻醉劑，放回恒溫孵育箱。

2??結果

2.1??反義探針的制備

通過PCR擴增得到了特異性條帶，片段大小分別為499?bp（dlx2b）、813?bp（barx1）、747?bp （dlx2a），結果符合預期。將PCR片段連接pGEMT載體上，EcoRⅠ酶切對重組質粒進行驗證，重組質粒構建成功。通過上海英駿生物技術有限公司測序結果得知插入片段的方向，用SalⅠ和SphⅠ進行對應質粒線性化，通過T7和SP6?RNA聚合酶轉錄獲得了dlx2b、dlx2a、barx1基因的反義mRNA探針。

2.2??整胚原位雜交

整胚原位雜交結果見圖1。

圖 1??3組barx1與dlx2a的表達 ?整胚原位雜交 ?×?75Fig?1??Expression?of?barx1?and?dlx2a?genes?in?three?groups??whole?in?situ?hybridization??×?75

由圖1可見，1）1×10-7mol·L-1RA處理組的胚胎，較DMSO對照組在咽弓神經嵴至咽弓牙齒部位可見到增強的褐色陽性信號，其中barx1的表達量在48?hpf胚胎明顯升高，在72?hpf胚胎信號持續強烈表達，并有由咽弓神經嵴向第七咽弓的牙齒萌出位點遷移的趨勢，DMSO對照組信號仍局限于咽弓前段；RA處理組胚胎在48?hpf時dlx2a的表達明顯增強，除前腦部信號明顯外，咽弓后段牙齒位置也出現表達。dlx2b的表達與對照組差異不明顯，胚胎48?hpf均有信號位于牙齒萌出位置。2）DEAB處理組胚胎外形稍有畸形，與DMSO對照組及RA處理組相比，胚胎神經嵴發育遲緩，完整性不良；barx1在48?hpf表達明顯降低，72?hpf開始逐漸消失，無向咽弓牙齒附著位點擴展的趨勢；dlx2a在前腦表達量下降，咽弓牙齒處無明顯表達；dlx2b在牙齒位點的表達有所延遲。

不同濃度的RA處理組原位雜交結果表明，4× 10-7mol·L-1RA處理組胚胎致畸率和死亡率極高，3× 10-7mol·L-1RA處理組胚胎約1/3出現發育遲緩的表型，主要體現在48?hpf胚胎外形與24?hpf的DMSO對照組類似，尾部呈扭曲狀，頭部與卵黃接近，眼部未見輪廓（圖2）。經dlx2a、dlx2b、barx1探針染色后發現，48?hpf的RA處理組barx1無表達，dlx2a與dlx2b的表達均與24?hpf的DMSO對照組表達模式一致，與同期對照組形成鮮明對比（圖2）。

圖 2??3×10-7?mol·L-1?RA處理組和DMSO對照組dlx2a、dlx2b的表達 ?整胚原位雜交 ?×?75Fig?2??Expression?of?dlx2a?and?dlx2b?genes?in?3×10-7?mol·L-1?RA?group?and?DMSO?group??whole?in?situ?hybridization??×?75

2.3??熒光顯微鏡檢測

3組的熒光表達見圖3。RA處理組的dlx2b綠色熒光除在牙齒位點表達外，出現了向周邊咽弓擴散的現象（圖3中），疑似第七、第六咽弓均有dlx2b表達，DMSO對照組僅局限于牙胚上皮（圖3左）。DEAB?處理組胚胎在4?dpf仍未觀測到熒光表達（圖3右）。

圖 3??3組的熒光表達 ?熒光顯微鏡 ?×?80Fig?3??Expression?of?fluorescence?in?three?groups??fluorescence?microscope??×?80

3 ?討論

RA信號是貫穿斑馬魚發育至成熟，乃至維護成年斑馬魚生態內環境穩定的非常重要的信號通路。視黃酸的命名源于最初發現其與視網膜內視紫紅質受體相結合有關，深入研究后發現，視黃酸在整個人體的生長發育、細胞的分化成熟和功能發揮上都具有非常重要的作用，過多或缺乏均可導致不同種類的疾病。Mark等[11]在小鼠體內敲除RA受體后見小鼠胚胎發生大面積顱頜骨發育畸形、腭裂，但牙齒與牙列并未出現明顯異常，猜測有兩種可能，第一是在顱神經嵴遷移的過程中，該受體并無表達，即在這個期間RA信號可能有其他途徑或受體代償；第二，該受體經敲除后影響最明顯的是顱神經嵴在遷移的過程中正在發育的組織，而小鼠不同于斑馬魚，其牙齒為第一咽弓發育來的口齒，從顱神經嵴遷移至頜部前已開始發育，且RAR敲除突變體小鼠第一咽弓來源的組織未見明顯變化。但Lohnes等[12]的體外實驗卻得到小鼠的牙齒發育過程中RA是必不可少的結論。

不同于小鼠的發育模式，斑馬魚的牙齒是第七咽弓的咽上皮與顱神經嵴遷移至咽弓的咽弓神經嵴分化的間充質干細胞所形成的。國外學者Gibert等[13]做了調節斑馬魚RA表達水平的實驗，證實斑馬魚的牙齒發育是需要RA信號的，其主要觀點是圍繞鯉形目魚類牙齒進化方向是需要RA信號進行調控的。但牙齒的發育并不是單一信號通路所能決定的，關于RA信號與其他信號之間的相互作用也有諸多研究。Wehner等[14]研究證實RA在組織再生過程中接受來自Wnt/β-catenin的激活信號，向下傳遞給Fgf，并通過Wnt信號與Notch信號、HH信號相互作用。Gibert 等[7]通過分別和共抑制Fgf信號和RA信號發現二者在斑馬魚體內是獨立調控牙齒發育的，但在青鏘魚和墨西哥脂鯉體內的實驗結果則表明牙齒發育存在RA依賴性，Fgf處于下游，接受RA的調控，他提出不同進化程度的生物體內調節信號存在差異。

本實驗發現，適量給予外源性RA信號，會導致斑馬魚的barx1在咽弓神經嵴的信號增強，增強的信號意味著細胞的活動增強，結合胚胎處于發育早期，增殖分化活動活躍，RA也可能增強神經嵴細胞的分裂和分化為牙齒前體細胞。dlx2a在咽弓神經嵴的表達因RA信號的加入而提前，其在前腦區的表達也明顯增強。dlx2b的表達在RA處理下，熒光發生亮度增強，表達范圍向咽弓周圍擴散，本來僅為第七咽弓能夠表達dlx2b的牙齒特異性基因，卻出現在了周圍咽弓的咽上皮，這一結果與Seritrakul等[6]的結果相一致，證實了RA能夠使進化消失的咽齒再次表達牙胚上皮特異性標記物。在被DEAB阻斷后無法合成RA的斑馬魚體內，barx1的表達出現了下調，dlx2a則僅在前腦表達，無明顯跡象表明其在咽弓神經嵴有表達，提示顱神經嵴后遷的過程受到抑制，沒有完成咽弓神經嵴的形成和間充質干細胞的分化。此外，dlx2b探針在RA處理的整胚原位雜交的結果并不顯著，而在轉基因魚系中與對照組有明顯差異，除dlx2b本身表達量較低外，可能與熒光蛋白的光穩定性有關。相較而言，原位雜交實驗周期較長、步驟繁瑣，期間mRNA可能發生不同程度降解，靈敏度較熒光蛋白有所差距。

本實驗利用較高濃度RA進行了同步實驗，在保證胚胎有較高的生存率的同時觀察胚胎的生長發育，發現胚胎發育延遲約24?h，barx1于48?hpf的胚胎未見表達，dlx2a、dlx2b的表達則基本與24?hpf的胚胎無明顯變化，均集中于斑馬魚的前腦、間腦和端腦，顱神經嵴、咽弓神經嵴及咽弓間充質無信號表達，牙齒無形成跡象。

本研究發現，適宜濃度RA可以促進斑馬魚顱神經嵴遷移至咽弓，分化為咽弓神經嵴和間充質干細胞，為進一步與牙源性上皮相互作用形成牙齒提供細胞來源。RA在脊椎動物的牙齒發育中作為信號分子的一員，發揮著穩健的推動作用，與牙列排布、牙齒形態有密切的聯系，但更為深入的信號間錯綜復雜的調節網絡以及信號與生物牙齒進化的復雜機制亟待進一步揭示。

[參考文獻]

[1]?Karbalaie?K,?Tanhaei?S,?Rabiei?F,?et?al.?Stem?cells?from?human?exfoliated?deciduous?tooth?exhibit?stromal-derived?inducing?activity?and?lead?to?generation?of?neural?crest?cells?from?human?embryonic?stem?cells[J].?Cell?J,?2015,?17(1): 37-48.

[2]?Kaku?M,?Komatsu?Y,?Mochida?Y,?et?al.?Identification?and?characterization?of?neural?crest-derived?cells?in?adult?periodontal?ligament?of?mice[J].?Arch?Oral?Biol,?2012,?57(12): 1668-1675.

[3]?Abe?S,?Hamada?K,?Miura?M,?et?al.?Neural?crest?stem?cell?property?of?apical?pulp?cells?derived?from?human?developing?tooth[J].?Cell?Biol?Int,?2012,?36(10):927-936.

[4]?Wen?X,?Liu?L,?Deng?M,?et?al.?In vitro?cementoblast-like?differentiation?of?postmigratory?neural?crest-derived?p75 (+)?stem?cells?with?dental?follicle?cell?conditioned?medium[J].?Exp?Cell?Res,?2015,?337(1):76-86.

[5]?Ritchie?HH,?Park?H,?Liu?J,?et?al.?Effects?of?dexamethasone,?vitamin?A?and?vitamin?D3?on?DSP-PP?mRNA?expression?in?rat?tooth?organ?culture[J].?Biochim?Biophys?Acta,?2004,?1679(3):263-271.

[6]?Seritrakul?P,?Samarut?E,?Lama?TT,?et?al.?Retinoic?acid?expands?the?evolutionarily?reduced?dentition?of?zebrafish[J].?FASEB?J,?2012,?26(12):5014-5024.

[7]?Gibert?Y,?Bernard?L,?Debiais-Thibaud?M,?et?al.?Formation?of?oral?and?pharyngeal?dentition?in?teleosts?depends?on?differential?recruitment?of?retinoic?acid?signaling[J].?FASEB?J,?2010,?24(9):3298-3309.

[8]?Alexander?C,?Piloto?S,?Le?Pabic?P,?et?al.?Wnt?signaling?interacts?with?bmp?and?edn1?to?regulate?dorsal-ventral?patterning?and?growth?of?the?craniofacial?skeleton[J].?PLoS?Genet,?2014,?10(7):e1004479.

[9]?Sperber?SM,?Dawid?IB.?barx1?is?necessary?for?ectomesenchyme?proliferation?and?osteochondroprogenitor?condensation?in?the?zebrafish?pharyngeal?arches[J].?Dev?Biol,?2008,? 321(1):101-110.

[10]?Aigler?SR,?Jandzik?D,?Hatta?K,?et?al.?Selection?and?constraint?underlie?irreversibility?of?tooth?loss?in?cypriniform?fishes[J].?Proc?Natl?Acad?Sci?USA,?2014,?111(21):7707-7712.

[11]?Mark?M,?Lohnes?D,?Mendelsohn?C,?et?al.?Roles?of?retinoic?acid?receptors?and?of?Hox?genes?in?the?patterning?of?the?teeth?and?of?the?jaw?skeleton[J].?Int?J?Dev?Biol,?1995,?39(1):111-121.

[12]?Lohnes?D,?Kastner?P,?Dierich?A,?et?al.?Function?of?retinoic?acid?receptor?gamma?in?the?mouse[J].?Cell,?1993,?73(4): 643-658.

[13]?Gibert?Y,?Samarut?E,?Pasco-Viel?E,?et?al.?Altered?retinoic?acid?signalling?underpins?dentition?evolution[J].?Proc?Biol?Sci,?2015,?282(1802).?DOI:10.1098/rspb.2014.2764.

[14]?Wehner?D,?Weidinger?G.?Signaling?networks?organizing?regenerative?growth?of?the?zebrafish?fin[J].?Trends?Genet,?2015,?31(6):336-343.

（本文采編 ?李彩）

[中圖分類號]Q?78

[文獻標志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.002

[收稿日期]2015-08-12；?[修回日期] ?2015-10-16

[基金項目]國家自然科學基金（31571508，31371473）；重慶市第七批重點學科建設項目《牙體牙髓病學》（2011）

[作者簡介]劉鑫，住院醫師，碩士，E-mail：tijiuwei@outlook.com

[通信作者]楊德琴，教授，博士，E-mail：yangdeqin@gmail.com

Retinoic acid signal pathway regulation of zebra fish tooth development through manipulation of the differentiation of neural crest

Liu Xin, Huang Xing, Xu Zhiyun, Yang Deqin. (Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China)
Supported by: Natural Science Foundation of China (31571508, 31371473); The Seventh Batch of Key Discipline Construction Project of Chongqing—Endodontics and Operative Dentistry (2011). Correspondence: Yang Deqin, E-mail: yangdeqin @gmail.com.

[Abstract]Objective To?investigate?the?mechanism?of?retinoic?acid?(RA)?signal?in?dental?evolution,?RA?is?used?to?explore?the?influence?of?the?mechanism?on?neural?crest’s?migration?during?the?early?stage?of?zebra?fish?embryos.?Methods??We?divided?embryos?of?wild?type?and?transgenic?line?zebra?fish?into?three?groups.?1×10-7to?6×10-7mol·L-1RA?and?1×10-7mol·L-14-diethylaminobenzaldehyde?(DEAB)?were?added?into?egg?water?at?24?hpf?for?9?h.?Dimethyl?sulfoxid?(DMSO)?with?the?concentration?was?used?as?control?group.?Then,?antisense?probes?of?dlx2a,?dlx2b,?and?barx1?were?formulated?to?perform?whole-mount?in?situ?hybridization?to?check?the?expressions?of?the?genes?in?48?hpf?to?72?hpf?embryos.?We?observed?fluorescence?of?transgenic?line?in?4?dpf?embryos.?Results??We?obtained?three?mRNA?probes?successfully.?Compared?with?DMSO?control?group,?a?low?concentration?(1×10-7mol·L-1)?of?RA?could?up-regulate?the?expression?of?mRNA?(barx1,?dlx2a)?in?neural?crest.?Obvious?migration?trend?was?observed?toward?the?pharyngeal?arch?in?which?teeth?adhered.?Transgenic?fish?had?spreading?fluorescence?tendency?in?pharyngeal?arch.?However,?a?high?concentration?(4×10-7mol·L-1)?of?RA?malformed?the?embryos?and?killed?them? after?treatment.?One?third?of?the?embryos?of?middle?concentration?(3×10-7mol·L-1)?exhibited?delayed?development.?DEAB?resulted?in?neural?crest?dysplasia.?The?expression?of?barx1?and?dlx2a?were?suppressed,?and?the?appearance?of?dlx2b?in?tooth?was?delayed.?Conclusion??RA?signal?pathway?can?regulate?the?progenitors?of?tooth?by?controlling?the?growth?of?the?neural?crest?and?manipulating?tooth?development.

[Key words]retinoic?acid?signal?pathway;??tooth?development;??neural?crest;??zebrafish