綠色熒光蛋白示蹤的HSV1-tk /GCV系統重組慢病毒載體的構建及活性檢測

黃暨生，張廣獻，譚宇蕙，易華，羅惠，杜標炎

（廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣東廣州　510006）

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綠色熒光蛋白示蹤的HSV1-tk /GCV系統重組慢病毒載體的構建及活性檢測

黃暨生，張廣獻，譚宇蕙，易華，羅惠，杜標炎

（廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣東廣州510006）

摘要：【目的】構建綠色熒光蛋白（GFP）示蹤的單純皰疹病毒1型胸苷激酶基因（HSV1-tk）的重組慢病毒載體，并檢測該系統對人皮膚黑色素瘤細胞株A375的感染活性。【方法】構建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重組慢病毒表達載體pLV-tk-GFP，并使用限制性內切酶消化進行鑒定及序列測定；用該重組質粒與輔助質粒共轉染包裝細胞HEK293T，獲得重組活病毒并感染A375，以嘌呤霉素篩選穩定表達細胞株；使用熒光顯微鏡觀察GFP基因的表達，更昔洛韋（GCV）殺傷實驗驗證tk-GFP基因的活性。【結果】重組質粒pLV-tk-GFP經限制性酶切鑒定和DNA序列測定分析顯示，tk基因已連接到載體正確位置，序列無突變；包裝病毒并感染細胞后，熒光顯微鏡下觀察顯示tk-GFP基因在A375中表達；篩選得到穩定表達細胞株A375/ tk-GFP，GCV能顯著殺傷A375/tk-GFP細胞，表明tk基因活性正常?！窘Y論】成功構建了重組pLV-tk-GFP慢病毒載體，該載體能包裝產生活病毒且在感染的人黑色素瘤細胞株A375中tk-GFP具有生物活性。

關鍵詞：單純皰疹病毒1型胸苷激酶基因；自殺基因系統；慢病毒；黑色素瘤

腫瘤自殺基因療法由于存在旁觀者效應，成為腫瘤生物治療中活躍的研究領域之一。單純皰疹病毒1型胸苷激酶/更昔洛韋（HSV1-tk/GCV）自殺基因系統是最早進入臨床試驗的自殺基因系統，在多種腫瘤（如白血病、神經膠質瘤、膀胱癌、肝癌、結腸癌和口腔癌等）的治療中均顯示了一定的抗腫瘤效果［1］。本課題組前期研究了多種腫瘤自殺基因治療及中藥方藥對腫瘤自殺基因治療的增效作用及增效機制［2-5］，但研究工作多以動物腫瘤細胞株為主，且以逆轉錄病毒介導HSV1-tk，而慢病毒具有更高的轉染效率。故本研究通過構建tk-綠色熒光蛋白（GFP）融合基因的重組慢病毒表達載體并轉染到人皮膚黑色素瘤細胞A375中，建立綠色熒光示蹤的重組HSV1-tk-GFP/GCV系統，作為自殺基因旁殺傷效應直觀量化的檢測模型，為后續的中藥方藥對人源性腫瘤細胞的自殺基因治療增效作用及作用機制的體內外研究奠定基礎，現報道如下。

1　材料和方法

1.1載體、細胞株質粒CD511B作為過表達載體，長度為7 544 bp，含人EF1啟動子和GFP基因，帶有氨芐原核抗性基因、嘌呤霉素篩選標記以及BamH I和EcoR I的酶切位點，由本室保存；大腸桿菌E.coli DH5α菌株由本室保存；人胚腎細胞HEK293T、人皮膚黑色素瘤細胞株A375，為本室保存，均培養于含體積分數10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，在37℃和體積分數5%CO2的條件下。

1.2藥物及試劑嘌呤霉素（美國Amersco公司）；多聚陽離子（美國Polybrene公司）；更昔洛韋（GCV）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國Sigma公司）；DMEM高糖培養基、Opti-MEM培養基、2.5 g/L胰酶（美國Gibco公司）；胎牛血清（以色列BI公司）；限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ，T4 DNA連接酶（上海晶美生物工程有限公司）；普通小量提取質粒DNA試劑盒（美國Omega Bio-Tek公司）；B型超純小量提取質粒DNA試劑盒（北京博大泰克生物基因技術有限公司）；DNA凝膠回收試劑盒（DNA Extration Kit）（立陶宛MBI公司）；逆轉錄和PCR所需試劑（北京Trans Gen公司）；LipofectamineTM2000轉染試劑（美國Invitrogen公司）。

1.3儀器UnoⅡThermocycler PCR BiometraR儀（美國MJ Research公司）；Thermo-Forma CO2培養箱（美國Hepa Filter公司）；IX71-F22FL/PH型熒光倒置顯微鏡及圖像采集系統（日本Olympus公司）；臺式高速低溫離心機（德國Eppendorf公司）；680型酶標儀、小型垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司）；細胞培養板等耗材（美國Corning公司）。

1.4重組慢病毒載體構建

1.4.1構建方案目的基因tk序列來自NCBI的Genebank數據庫（GenBank：JX392980.1），長度約1 149 bp（R4312），基因片段兩端含BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點。將質粒CD511B經BamHⅠ/ EcoRⅠ雙酶切后經瓊脂糖凝膠電泳回收獲得載體大片段。將目的基因tk與載體大片段均經連接反應后（CD511B-R4312）轉化感受態細菌，獲得并鑒定轉化子。

1.4.2PCR反應以HEK293T細胞總RNA為模板，用高保真酶將目的基因tk片段擴增后進行膠回收，擴增引物：上游5’-ATATCTTGTGGAAAG GACG-3’，下游5’-CTGCATTCTAGTTGTGGTT-3’；DNA片段擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸80 s，共進行30個循環后，72℃再延伸10 min。取產物8 μL加入DNA上樣緩沖液，混勻后點樣至含Goldview （50 μL/L）的10 g/L瓊脂糖凝膠，在TAE電泳緩沖液中電泳，鑒定RT-PCR產物。

1.4.3DNA片段回收、連接將限制酶酶切后的載體DNA片段及RT-PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切取DNA條帶，以瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，溶于無菌水中－20℃保存。在無菌的Eppendorf管中加入下列成分并進行連接反應：目的DNA片段（1∶50稀釋）15 μL，載體DNA片段2 μL，加入2 μL 10×連接緩沖液，1 μL T4 DNA連接酶，總反應體系為20 μL。16℃連接（于冰上操作）過夜后，取10 μL連接產物轉化大腸桿菌DH5α。

1.4.4重組克隆篩選、鑒定將轉化后的大腸桿菌DH5α接種于氨芐抗性（100 μg/mL）的LB培養基中，37℃、250 r/min振搖過夜。并進行細菌質粒DNA抽提，然后以BamHⅠ/EcoRⅠ酶切進行鑒定，DNA片段電泳并回收。

1.4.5序列測定以回收酶切重組質粒的DNA片段為測序模板，采用通用測序引物，取部分保種的菌液送上海英駿生物技術公司測序。

1.5包裝細胞的轉染和重組活病毒的收集病毒包裝：人胚腎細胞HEK293T，培養于含體積分數10%胎牛血清的DMEM高糖培養液中，置37℃、體積分數5%的CO2培養箱內培養。鋪板2 d后密度達90%左右，轉染前1 h，更換4 mL的opti-MEM培養基。參照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書，將構建好的重組慢病毒質粒pLV-tk-GFP與包裝質粒共同轉染HER293T細胞，轉染6～8 h后換10 mL新鮮培養基沿皿壁緩慢加入。加入新鮮培養基48、72 h后分別收病毒液，離心過濾分裝到1.5 mL EP管中，置于-80℃低溫冰箱中保存。

1.6人黑色素瘤細胞A375的感染和重組基因的活性鑒定

1.6.1A375細胞感染及穩定表達株的篩選A375為貼壁細胞，培養于含體積分數10%胎牛血清的DMEM高糖培養液中，置37℃、體積分數5%的CO2培養箱內培養。細胞達到80%～90%的匯合率時，消化細胞并計數，將細胞懸液稀釋為5×105/ mL，吸1 mL細胞懸液到2 mL EP管，再加入2 μL polybrene混勻，加入1 mL病毒液充分混勻后接種到培養皿。24 h后更換含0.5 mg/L嘌呤霉素篩選培養液，48～72 h后置于熒光顯微鏡，藍光下觀察熒光蛋白的表達。隔天換液，維持嘌呤霉素篩選濃度1周。

1.6.2A375/tk-GFP穩定表達株的tk活性檢測將A375和A375-tk-GFP按3 000個/孔細胞接種到96孔板，待細胞貼壁生長后，加入GCV，換含終濃度分別為0、6.25、25、100 μmol/L的GCV培養液，GCV作用72 h后鏡下觀察細胞的變化。采用MTT法檢測各組細胞的吸光度（D）值，按公式p細胞存活率（%）=（D測定組/D對照組）×100%，計算各組細胞存活率，比較A375細胞和A375/tk-GFP細胞對GCV的敏感性。用Calcusyn 2.0軟件計算半數抑制量（IC50）。

1.7統計方法用SPSS 19.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本均數的t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1重組質粒的構建重組慢病毒質粒pLV-tk-GFP分子量約為10.0 kb，酶切后經瓊脂糖凝膠電泳條帶位置與預期相符，證明目的基因已經成功連接到載體質粒，結果見圖1。重組慢病毒載體pLV-tk-GFP基因序列的測序結果與原始載體序列比對，相應序列100%完全一致，結構示意圖見圖2，證明攜帶目的基因HSV1-tk的質粒pLV-tk-GFP構建成功。

重組質粒pLV-tk-GFP的測序結果表明目的基因tk序列與GenBank：JX392980.1的一致，沒有突變。

2.2包裝細胞的轉染、重組病毒感染A375和基因表達觀察將包裝細胞產生的重組慢病毒pLV-tk-GFP感染A375細胞48 h后于熒光倒置顯微鏡下觀察，到絕大部分細胞能被激發出綠色熒光，說明轉染率接近100%。用0.5 mg/L嘌呤霉素維持篩選濃度2周，最終獲得重組基因整合到染色體上的穩定表達細胞株，命名為A375/tk-GFP，結果見圖3。

圖1　pLV-tk-GFP質粒酶切結果Figure 1 Enzyme-cut result of plasmid pLV-tk-GFP

圖2　重組慢病毒質粒pLV-tk-GFP的結構示意圖（R4312為目的基因）Figure 2 Structure delineation for constructed recombinant plasmid pLV-tk-GFP（target gene R4312）

2.3GCV細胞毒性試驗驗證重組細胞株中整合染色體上的tk-GFP活性對A375細胞、A375/tk-GFP細胞進行不同濃度GCV（0、6.25、25、100 μmol/L）殺傷試驗，采用MTT法檢測GCV作用72 h的細胞存活率，圖4結果顯示：A375/tk-GFP組對6.25 μmol/L GCV的敏感性已顯著高于A375組，GCV各濃度2組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖5、圖6結果顯示：A375/tk-GFP細胞生存率隨GCV濃度增大逐步減小，GCV作用72 h均見細胞生長受到抑制，細胞膨大變圓，胞膜皺縮，大量細胞脫落懸浮，并有大量細胞碎片產生。GCV 對A375/tk-GFP細胞作用72 h的IC50為6.113 μmol/L。而GCV作用于A375細胞時各濃度組細胞生長良好，與對照組比較細胞密度和存活率無顯著差異。

圖3　穩定表達綠色熒光蛋白的人黑色素瘤細胞株A375/tk-GFPFigure 3 Human cutaneous melanoma cell line A375/tk-GFP with green fluorescence

圖4　A375和A375/tk-GFP細胞對GCV的敏感性（72 h）（±s，N=3）Figure 4 Comparison of the sensitivity of A375 & A375/ tk-GFP cells to GCV（72 h）

圖5　不同濃度GCV對A375細胞的殺傷作用（72 h）（×200）Figure 5 The antitumor effects of various concentrations of GCV on A375 after culturing for 72 h（×200）

圖6　不同濃度GCV對A375/tk-GFP細胞的殺傷作用（72 h）（×200）Figure 6 The killing effects of various concentrations of GCV on A375/tk-GFP after culturing for 72 h（×200）

3　討論

針對各種惡性腫瘤的基因治療臨床試驗方案占了全球批準進入臨床試驗階段基因治療方案總數的2/3。腫瘤基因治療的原理是通過將一段具有外源功能的基因采用基因轉移技術導入至腫瘤細胞補償其基因缺失，使其獲得特定功能，繼而達到抑制或殺傷腫瘤細胞的目的［6］。目前主要的基因導入的常見方法有病毒載體和非病毒載體系統，其中借助以病毒為基礎的載體是常見方法之一，包括逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、痘病毒、慢病毒等［7-8］，而非病毒載體包括質粒DNA、陽離子脂質體、PEI、納米膠束等［9-10］。病毒載體轉染率大大高于非病毒載體。與其他2種載體比較，逆轉錄病毒載體只能感染分裂期細胞，而且容納外源基因片段有限，腺病毒載體不能整合到染色體上，只適合瞬時感染；慢病毒（Lentivirus）載體是以人類免疫缺陷I型病毒（HIV-1）為基礎發展起來的，對分裂細胞和非分裂細胞均具有高效的感染性，容納外源基因片段大且可將外源基因有效地整合到宿主染色體，達到持久穩定表達外源基因的目的，非常適合于較大的融合基因過表達穩定細胞株的建立［11-12］。由于慢病毒載體具有以上眾多的優勢，其在基因治療的應用最早始于20世紀70年代，在RNA干擾、自殺基因及免疫基因等基因治療策略實現外源基因的高效導入，具有良好應用前景并得到廣泛應用。本研究通過構建新的重組慢病毒載體pLV-tk-GFP，通過與包裝質粒共轉染包裝細胞能產生活病毒，再感染腫瘤細胞能構建各種重組tk-GFP的腫瘤細胞株，利用其高效轉染效率及可示蹤特點用于自殺基因治療以及藥物包括中藥對其增效作用的研究開發，也可以把它作為一種示蹤工具用于研究腫瘤的發病機制及其他藥理研究等。

免疫基因治療、腫瘤抑制基因治療、自殺基因治療等基因治療策略中，自殺基因治療是將無毒的前體藥物轉化為有毒性的藥物從而產生基因的特異性殺傷作用［13］，同時還可以通過旁觀者效應（bystander effect）引起導入自殺基因的腫瘤細胞鄰近無自殺基因的腫瘤細胞死亡［14］。HSV-tk/GCV系統在人體試驗中獲得成功，并已經開展III期臨床相關試驗研究［15］。治療惡性黑色素瘤最常見的自殺基因系統是HSV-tk/GCV系統，本課題組前期以逆轉錄病毒介導構建了綠色熒光示蹤、自殺基因陽性的小鼠黑色素瘤細胞B16/tk-GFP以及紅色熒光示蹤、自殺基因陰性的B16-RFP。通過這一自殺基因旁殺傷效應直觀、量化的分析檢測模型［16-18］，分析了中藥丹參酮IIA等中藥對自殺基因的增效作用及旁殺傷效應機制［19］。在此基礎上，本研究建立了更高轉染效率的重組慢病毒載體pLV-tk-GFP，可用于更多腫瘤株的研究，而獲得的A375/tk-GFP細胞株可用于后續的人源性惡性黑色素瘤的自殺基因治療，以及中藥方藥增效作用和機制的體內外研究工作。

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【責任編輯：黃玲】

·南藥園地·

Construction of Recombinant HSV1-tk/GCV Green Fluorescent Protein Monitoring Lentivirus System and Detection of Its Activity

HUANG Jisheng，ZHANG Guangxian，TAN Yuhui，YI Hua，LUO Hui，DU Biaoyan
（School of Fundamental Medical Science，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

Abstract：Objective To construct recombinant herpes simplex virus type 1 thymidine kinase/ganciclovir（HSV1-tk/GCV）green fluorescent protein（GFP）monitoring lentivirus system，and to examine the activity of package cells transfected with the constructed lentiviurs vector and infected with human cutaneous melanoma cell line A375.Methods The recombinant lentiviurs vector pLV-tk-GFP expressing suicide gene HSV1-tk and GFP gene was constructed，and then was identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing.After the recombinant plasmid and packaging plasmid were cotransfected to packaging cell line HEK293T，the animated virus was obtained and was used to infecting A375 to screen cell line with stable expression by puromycin.A standard fluorescence microscope was used for florescent detection，and the tk-GFP gene activity was evaluated by GCV anti-tumor effect.Results The results of restriction endonuclease digestion and DNA sequencing showed that tk gene had been successfully inserted into the correct position of the recombined plasmid pLV-tk-GFP，showing no sequence mutation.After A375 cells were infected with the packaging virus，tk-GFP gene expression was present under fluorescence microscope，indicating that cell line A375/tk-GFP was obtained.GCV had obvious killing effect on cell line A375/tk-GFP，indicating that tk gene activity was normal.Conclusion The recombinant lentivirus vector pLV-tk-GFP has been successfully constructed，and the vector can produce animated virus and has the bioactivity of tk-GFP gene in the infected human cutaneous melanoma cell line A375.

Key words：herpes simplex virus type 1 thymidine kinase（HSV1-tk）；suicide gene system；lentivirus；melanoma

中圖分類號：R739.5

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3213（2016）03 - 0384 - 05

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．024

收稿日期：2016-01-30

作者簡介：黃暨生（1985-），男，博士研究生；E-mail：ziyuanhuang@163.com

通訊作者：杜標炎，男，教授；E-mail：dubiaoyan@gzucm.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目（編號：81072906）