正交試驗法優選吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的閃式提取工藝

郭殷銳，蘇雪芬，張廣唱，王劍

（廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣東廣州　510006）

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正交試驗法優選吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的閃式提取工藝

郭殷銳，蘇雪芬，張廣唱，王劍

（廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣東廣州510006）

摘要：【目的】優選吳茱萸藥材最佳閃式提取工藝?！痉椒ā坎捎瞄W式提取技術，以吳茱萸堿和吳茱萸次堿的得率為指標，采用高效液相色譜法測定。選擇乙醇濃度、提取時間和提取電壓為考察因素，選用L9（34）正交試驗法優選吳茱萸藥材最佳閃式提取工藝?！窘Y果】吳茱萸藥材的最佳閃提工藝條件為提取電壓40 V，提取時間3 min，乙醇濃度體積分數75%和料液比1∶20?！窘Y論】閃式提取吳茱萸藥材效率高、時間短，可成為提取吳茱萸堿和吳茱萸次堿的方法。

關鍵詞：吳茱萸/化學；吳茱萸堿/分析；吳茱萸次堿/分析；閃式提??；正交試驗；色譜法，高壓液相

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa （Juss.）Benth、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.），具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉之功效，臨床常用于治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉等?，F代藥理研究發現其具有強心、保護心臟、抗心律失常、降壓、抗血栓、抗腫瘤、抗過敏和抗炎鎮痛等作用［1］。吳茱萸堿（evodiamine，EVO）和吳茱萸次堿（rutaecarpine，RUT）是其主要的有效活性成分，研究［2-3］表明EVO和RUT有良好的強心、降壓、抗炎、鎮痛功效。閃式提取法也稱為閃提法，是近年來發展起來的一種新提取方法，它依據組織破碎提取的原理，利用適當溶劑在閃式提取器里將物料快速破碎至適當粒度，同時通過高速攪拌、超強振動、負壓滲濾等功能來達到提取目的。由于一次提取一般在數秒至幾分鐘之內即可完成，其提取速度為傳統方法的百倍以上，因此被稱之為閃式提取［4］。本研究采用閃提法提取吳茱萸，并以正交試驗法優選，現報道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器AUI220分析天平（廣州湘儀機電設備有限公司）；LC-20A高效液相色譜儀（日本，島津公司）；QYYS-20A超純水機（重慶前沿水處理設備有限公司）；JHBE-50閃式提取器（鄭州眾德實業有限責任公司）；KQ-500VDE臺式三頻數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BQ-MW3H實驗微波萃取儀（杭州耀博生物科技有限公司）

1.2試藥乙醇（天津市致遠化學試劑有限公司，批號：20150212）；乙腈（色譜純，Dikma，批號：608001003）；四氫呋喃（天津市大茂化學試劑廠，批號：20150206）；冰醋酸（天津市致遠化學試劑有限公司，批號：20140908）；吳茱萸（廣州南北行中藥飲片有限公司，批號：20150306G352，經廣州中醫藥大學王劍教授鑒定為蕓香科植物吳茱萸）。

2　方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）；以乙腈—水—四氫呋喃—冰醋酸（體積比41∶59∶1∶0.2）為流動相，流速1 mL/min，柱溫30℃，進樣量：10 μL，檢測波長為225 nm。在此條件下，測得吳茱萸堿峰的保留時間約16.7 min（1號峰），吳茱萸次堿峰的保留時間約為19.5 min（2號峰）。

2.2對照品溶液的制備精密稱取吳茱萸堿0.75 mg、吳茱萸次堿0.50 mg，加體積分數75%乙醇定容至10 mL，搖均，超聲30 min，0.45 μm微孔濾膜法濾過即得質量濃度吳茱萸堿為75 μg/mL和吳茱萸次堿為50 μg/mL的對照品儲備溶液。

2.3供試品溶液的制備精密稱取吳茱萸藥材約50.0 g，加20倍量乙醇，閃提3 min，濾過，倒置1 000 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，吸取2 mL用以0.45 μm微孔濾膜過濾即得供試品溶液。

2.4標準曲線的制作精密稱定吳茱萸堿（75 μg/mL）和吳茱萸次堿（50 μg/mL）混合對照品溶液，進樣量依次為10、20、30、40、50 μL，按上述色譜條件分別測定，記錄色譜峰，以峰面積Y對含量X進行線性回歸計算，得吳茱萸堿的線性回歸方程為：Y = 7309.873X+418542.000，r = 0.999，線性范圍為：0.75～3.75 μg；吳茱萸次堿的線性回歸方程為：Y= 4572.071X-67912.700，r = 0.991，線性范圍為：0.5～2.5 μg。

2.5方法學驗證

2.5.1精密度試驗按2.1項下色譜條件，取吳茱萸堿和吳茱萸次堿混合對照品溶液連續進樣6次，計算相對標準偏差（sR）分別為0.19%、0.32%。

2.5.2穩定性實驗按2.1項下色譜條件，取同一供試樣品溶液，分別于制備后0、3、6、9、12 h進樣，計算吳茱萸堿和吳茱萸次堿的sR分別為0.46%和0.25%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.5.3重復性試驗按2.1項下色譜條件，取吳茱萸粉末6份，每份50.0 g，精密稱定，按2.3項下方法分別制備供試品溶液，測定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的峰面積值，計算吳茱萸堿和吳茱萸次堿的質量濃度的sR分別為0.31%和0.39%。

2.6加樣回收率試驗精密吸取已測定吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量的供試液6份，各1 mL，分別準確加入1 mL吳茱萸堿和吳茱萸次堿對照品溶液（吳茱萸堿濃度75 μg/mL，吳茱萸次堿濃度50 μg/mL），重復3次，按照2.1項下色譜條件方法進行測定，計算吳茱萸堿和吳茱萸次堿的平均回收率分別為97.2%和98.6%。sR分別為0.45%和0.58%。

2.7樣品測定精密稱取吳茱萸藥材粉末50.0 g，投入閃式提取器的容器中，然后加入20倍乙醇，按L9（34）正交試驗表安排試驗，提取完后真空抽濾，倒置1000 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，高效液相色譜儀自動進樣10 μL測定，并以外標法計算吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量。吳茱萸堿和吳茱萸次堿對照品混合溶液與供試品溶液的HPLC圖譜見圖1。

圖1　對照品混合溶液（A）和供試品溶液（B）的HPLC圖譜Figure 1 HPLC result for mixed solution reference（A）and Fructus Evodiae samples（B）

2.8吳茱萸閃提提取工藝考察

2.8.1提取時間考察精密稱取吳茱萸藥材50.0 g，以體積分數75%乙醇為提取溶媒，溶媒用量為20倍，提取電壓40 V，按提取時間分別為30 s、1 min、2 min、4 min、6 min提取后抽濾，以相應溶媒定容于1 000 mL量瓶中，精密吸取藥液1 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，按2.7項下方法測定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，結果提取時間為2 min時提取率較高。

2.8.2提取電壓考察精密稱取吳茱萸藥材50.0 g，以體積分數75%乙醇為提取溶媒，溶媒用量為20倍，分別以20、40、60、80、100 V為提取電壓，提取時間為1 min，提取后抽濾，以相應溶媒定容于1 000 mL量瓶中，精密吸取藥液1 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，按2.7項下方法測定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，結果提取電壓為40 V時提取率較高。

2.8.3乙醇濃度考察精密稱取吳茱萸藥材粉50.0 g，分別以體積分數20%、40%、60%、75%、95%乙醇為提取溶媒，溶媒用量為20倍，提取電壓為40 V，提取時間為1 min，提取后抽濾，以相應溶媒定容于1 000 mL量瓶中，精密吸取藥液1 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，按2.7項下方法測定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，結果乙醇濃度為95%的提取率較高。

2.9正交試驗選取提取時間、提取電壓、乙醇濃度3個因素，吳茱萸藥材用量每組50.0 g，料液比為1∶20，以吳茱萸堿和吳茱萸次堿得率作為評價指標，選用L9（34）正交表進行試驗。根據2.8項考察結果設計因素水平見表1，正交試驗見表2，方差分析見表3。

實驗結果表明：影響吳茱萸堿和吳茱萸次堿總得率的因素依次為A＞C＞B，以D因素為誤差項進行方差分析，影響因素A（提取時間）是影響吳茱萸閃提工藝的主要因素，C因素（乙醇濃度）為次要因素，B因素（提取電壓）影響不顯著，結合直觀分析結果，確定正交試驗優選制備工藝為A3B2C1，即提取電壓40 V，提取時間3 min，乙醇濃度為體積分數75%和料液比1∶20。

2.10最佳工藝條件驗證以優選的工藝條件制備3批樣品，測定其吳茱萸堿和吳茱萸次堿得率。驗證試驗結果見表4。

表1　因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

3　討論

閃式提取器根據組織破碎原理而設計，其核心部分是破碎刀具和動力部分，通過內外刀刃間歇控制破碎粒度，外刃固定，內刃在高速電機帶動下旋轉，對中藥材產生破碎作用。因其提取速度極快，因此稱為閃式提取。傳統的溶劑提取法，如煎煮法、回流法、浸漬法等，大多以熱為推動力，或依靠濃度差將有效成分提出，存在能耗高、周期長、工序多、收率低、勞動強度大，高溫破壞熱敏性成分等不足。隨著工業化生產規模的擴大，傳統提取技術的種種缺陷，越來越制約了人們對中藥資源的開發利用。閃式提取具有提取溫度低、速度快、操作簡單的特點，對提取熱敏性物質更具有優勢，在中藥提取和天然化學成分研究等方面具有廣泛的應用前景，將為中藥研究開辟一個新的途徑。閃式提取不僅適用于不同質地的動植物材料，還可有效地應用于不同類型的化學物質。目前已經應用且已取得成功經驗的有鞣質類、多酚類、黃酮類、皂苷類、萜類、生物堿類等生物活性成分。中藥在臨床上大多是以復方的形式應用，閃式提取所具有高效、快速、節能、環保的特點，將為中藥復方的提取工藝研究帶來極大的便利，但將其應用于中藥方劑的提取僅剛剛開始，創新研究的空間和前景很大［5-8］。

表2　正交試驗結果與直觀分析Table 2 Results and analysis of L9（34）orthogonal test　（N=3）

本研究結果表明：閃式提取吳茱萸藥材在提取電壓40 V，提取時間3 min，乙醇濃度體積分數75%和料液比1∶20的條件下，吳茱萸堿的得率為16.1 mg/g，吳茱萸次堿的得率為7.5 mg/g。另取同批藥材等量，依據婁方明等［8］記載的最佳微波提取條件進行提取，所得吳茱萸堿得率為8.22 mg/g，吳茱萸次堿得率為4.81 mg/g；依據甄攀等［9］采用超聲提取的最佳條件進行提取，所用溶劑改為體積分數75%乙醇而不使用乙酸乙酯，所得吳茱萸堿得率為6.43 mg/g，吳茱萸次堿得率為3.33 mg/g。閃式提取可以省卻藥材干燥和粉粹的步驟，對于一些難以干燥以及質地稍軟的中藥材有特殊的優勢，且提取效率和時間都明顯優于傳統方法。綜上所述，閃式提取為吳茱萸藥材的較佳提取方法。

從本研究結果可以發現，提取時間是影響閃式提取吳茱萸堿和吳茱萸次堿得率最顯著的因素，主要是因為當時間過長，藥材被打成較細的粉，藥粉越細可能就越容易與藥效成分發生物理吸附作用，影響有效成分的釋放，所以閃式提取要掌握好最佳的提取時間。

參考文獻：

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［2］Kobayashi Y，Hoshikuma K，Nakano Y，et al.The positive inotropic and chronotropic effects of evodiamine and rutaecarpine，indolquinazoline alkaloids isolated from the fruits of Evodia rutaecarpa，on the guinea -pig isolated right atria：possible involvement of vanilloid receptors［J］.Planta Med，2001，67 （3）：244.

［3］Wang G J，Wu X C，Chen C F，et al.Vasorelaxing action of rutaecarpine：effects of rutaecarpine on calcium channel activities in vascular endothelial and smooth muscle cells［J］.J Pharmacol Exp Ther，1999，289（3）：1237.

［4］劉延澤.植物組織破碎提取法及閃式提取器的創制與實踐［J］.中國天然藥物，2007，5（6）：401.

［5］吳冬梅.閃式提取器在中藥研究中的應用［J］.中國實驗方劑學雜志，2006，12（7）：34.

［6］李精云，劉延澤.組織破碎提取法在中藥研究中的應用進展［J］.中草藥，2011，42（10）：2145.

［7］黃越燕，譚榮德.閃式提取技術在中藥成分提取中的研究進展［J］.中國醫院藥學雜志，2015，35（1）：83.

［8］婁方明，黃燮南，錢靜.微波提取吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的工藝研究［J］.遵義醫學院學報，2009，32（2）：599.

［9］甄攀，張榮山，白雪梅，等.吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取條件研究［J］.中國藥學雜志，2005，42（2）：99.

【責任編輯：黃玲】

·基礎研究·

Optimization of Flash Extraction Process for Evodiamine and Rutaecarpine from Fructus Evodiae by Orthogonal Test

GUO Yinrui，SU Xuefen，ZHANG Guangchang，WANG Jian
（Basic Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

Abstract：Objective To optimize the flash extraction process for evodiamine and rutaecarpine isolated from Fructus Evodiae.Methods We used the flash extraction process to extract evodiamine and rutaecarpine from Fructus Evodiae，and performed high performance liquid chromatography（HPLC）with their yields as the observation indexes.Selecting ethanol concentration，extraction time and extraction voltage as the examination factors，we adopted L9（34）orthogonal test to screen the optimum flash extraction process.Results The optimum flash extraction process conditions were as follows：extracting voltage at 40 V，extracting for 3 min，ethanol at the volume fraction of 75%，and solid to liquid ratio being 1∶20.Conclusion The flash extraction process for Fructus Evodiae medicinal materials has the advantage of higher yield and shorter time，and can be used for extracting evodiamine and rutaecarpine from Fructus Evodiae .

Key words：Fructus Evodiae/chemistry；evodiamine/analysis；rutaecarpine/analysis；flash extraction；orthogonal test；chromatography，high performance liquid

中圖分類號：R284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3213（2016）03 - 0380 - 04

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．023

收稿日期：2015-11-07

作者簡介：郭殷銳（1988-），男，在讀碩士研究生；E-mail：75706868@qq.com

通訊作者：王劍，男，博士，碩士研究生導師；E-mail：zswj@gzucm.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目（編號：81173150）