黃芩苷對代謝性炎癥及腸道菌群的調節作用探討

劉思穎，鄺棗園，張韌，謝偉群，陳健

（1.廣州中醫藥大學基礎醫學院研究生部，廣東廣州　510006；2.廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣東廣州　510006）

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黃芩苷對代謝性炎癥及腸道菌群的調節作用探討

劉思穎1，鄺棗園2，張韌2，謝偉群1，陳健1

（1.廣州中醫藥大學基礎醫學院研究生部，廣東廣州510006；2.廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣東廣州510006）

摘要：【目的】探討黃芩苷對高脂血癥模型代謝性炎癥及腸道菌群的調節作用。【方法】選取32只C57BL/6J雄性小鼠隨機平均分為正常組、模型組、黃芩苷高劑量組（劑量為50 mg·kg-1·d-1）、黃芩苷低劑量組（劑量為25 mg·kg-1·d-1）。高脂飼料喂養3周后，2個黃芩苷用藥組分別給予不同濃度黃芩苷灌胃5周。采用酶聯免疫吸附法檢測各組小鼠血清血脂水平以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）及內毒素水平，采用Miseq平臺對小鼠腸道糞便微生物進行基因測序?！窘Y果】與正常組比較，模型組總膽固醇及低密度脂蛋白水平顯著升高（P<0.01），高密度脂蛋白水平顯著降低（P<0.01），血清TNF-α、IL-6和內毒素水平顯著升高（P＜0.01）；黃芩苷高劑量組的TNF-α、IL-6、內毒素水平均較模型組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），黃芩苷低劑量組內毒素水平亦較模型組顯著降低（P＜0.01）。測序生物信息學分析發現，在門的水平，模型組脫鐵桿菌門和變形桿菌門數目較正常組顯著增多，疣微菌門數目較正常組顯著減少。在屬的水平，模型組Christensenella、uncultured_ Peptococcaceae、脫硫弧菌屬數目較正常組顯著增多，而糞球菌屬、Akkermansia及uncultured_Lachnospiraceae數目較正常組顯著減少；黃芩苷高、低劑量組脫硫弧菌屬豐度均較模型組降低。各組革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌數目之比，模型組較正常組顯著升高（P＜0.05），黃芩苷低劑量組較模型組顯著降低（P＜0.05）?！窘Y論】黃芩苷能治療高脂飲食引起的代謝性炎癥，這可能與黃芩苷能調節腸道菌群的結構有關。

關鍵詞：黃芩苷；代謝性炎癥；腸道菌群；革蘭氏陰性菌

目前，高脂飲食以及缺乏鍛煉的不良生活方式逐漸影響著人類的健康。研究表明：長期高脂飲食、體內營養過剩容易引起高脂血癥，患者長期處于炎癥的狀態，則腸道菌群的結構也會發生改變，這些異常與許多疾病的發生密切相關［1-4］。中藥黃芩提取出的單體黃芩苷具有一定的抗炎功效［5-6］。因此，本研究觀察了黃芩苷對高脂飲食引起的小鼠高脂血癥模型代謝性炎癥及腸道菌群結構紊亂的作用，初步探討黃芩苷抗代謝性炎癥的機制，現報道如下。

1　材料與方法

1.1動物與飼料C57BL/6J小鼠，SPF級，雄性，體質量17～20 g，合格證號：SCXK（粵）2013-0002，由廣東省醫學實驗動物中心提供。喂養于廣州中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室，實驗許可證號：SYXK（粵）2013-0085。小鼠高脂飼料由廣東省醫學實驗動物中心配制，配方質量分數分別是：常規飼料83%、豬油10%、蛋黃粉5%、膽固醇1.5%；膽鹽0.5%。

1.2藥物、試劑及儀器黃芩苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201318）；總膽固醇（TC）測試盒（批號：20150929）、高密度脂蛋白（HDL）測試盒（批號：20150930）、低密度脂蛋白（LDL）測試盒（批號：20150919）均購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）及內毒素酶聯免疫吸附檢測試劑盒均購自北京誠林生物科技有限公司；糞便DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司，批號：151024773）。多通道移液器（德國Eppendorf公司，型號：30-300uL）；分析天平（德國Sartorius公司，型號：BS124S）；高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司，型號：3H24RI）；多標記微孔板檢測儀（美國PerkinElmer公司，型號：Enspire）。

1.3動物分組、造模與給藥取C57BL/6J雄性小鼠32只適應性喂養1周后，按體質量隨機分為4組，分別為正常組、模型組、黃芩苷高劑量組和黃芩苷低劑量組，每組8只，遂開始實驗。除正常組小鼠日常喂以常規飼料外，其他組小鼠均日常給予高脂飼料喂養以造高脂血癥模型。當實驗進行到第4周時開始每日定時1次灌胃干預，正常組與模型組均灌胃0.5 mL/d/只無菌生理鹽水；黃芩苷高劑量組灌胃黃芩苷50 mg·kg-1·d-1（臨床等效量的10倍）；黃芩苷低劑量組灌胃黃芩苷25 mg·kg-1·d-1（臨床等效量的5倍）；黃芩苷均用無菌生理鹽水稀釋。連續灌胃5周后，將小鼠麻醉摘眼球取血后處死，并無菌操作取其盲腸部糞便。

1.4血脂及IL-6、TNF-α、內毒素指標檢測用無菌、無熱源的EP管取得血液，室溫靜置1 h后，于4℃、3 000 r/min離心20 min，吸取上層血清，分裝保存于-80℃，分別按試劑盒操作說明測定TC、HDL與LDL水平。采用酶聯免疫吸附試驗嚴格按照試劑盒說明書測定血清中IL-6、TNF-α、內毒素的濃度，內毒素檢測時運用的各種實驗耗材均為無熱源產品。

1.5糞便菌群的基因組DNA提取與PCR擴增將各組小鼠腸道新鮮糞便放入無菌凍存管-80℃凍存，依照試劑盒說明書步驟提取小鼠糞便菌群的基因組DNA。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量后，采用引物341F 5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’，785R 5’-GACTACHV GGGTATCTAATCC-3’，擴增細菌16S rDNA的V3-V4區。PCR反應體系為：5×FastPfu緩沖液4 μL、2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）2 μL、5 μmol/L的正向引物0.8 μL、5 μmol/L的反向引物0.8 μL、FastPfu多聚酶0.4 μL、DNA 10 ng，加ddH2O至總體積20 μL。PCR反應條件為：1×（3 min、95°C）；32×（30 s、95℃；30 s、55℃；45 s、72℃）；10 min，72℃、10℃保存。PCR產物上樣3 μL用20 g/L瓊脂糖凝膠80 V恒壓，40 min電泳以鑒定結果。對DNA進行回收，回收產物用Qubit 2.0定量，根據測得的DNA濃度，將所有樣品按照1∶1的比例進行混合；混合后充分震蕩均勻。該混合樣品接下來用于后續的樣品建庫（加測序標簽）與Miseq高通量測序平臺進行高通量測序。

將引物序列、短片段、低復雜度及低質量序列、非靶區域序列、嵌合體去除后，將高質量序列的生物信息學從以下方面分析：（1）操作分類單元（OTU）分類。將多條序列按其序列間的距離對相似性在97%以上的序列進行聚類歸并，生成接近于屬的分類操作單元OTU。（2）采用軟件RDP classifier進行物種分類。采用Nave Bayesian assignment算法對每條序列在genus水平上計算其分配到此rank中的概率值，分類閾值為0.8。（3）alpha多樣性分析，采用Coverage、richness、ACE、Chao1、Shannon評估指數分別對樣本進行多樣性分析。（4）Beta多樣性分析，用來比較多組樣本之間的差別度量。（5）比較樣本或組間豐度差異，找出樣本或組間豐度存在顯著差異的菌群。

2　結果

2.1各組小鼠血脂水平比較表1結果顯示：模型組小鼠出現了脂代謝紊亂，與正常組比較，模型組總膽固醇及低密度脂蛋白水平顯著升高（P＜0.01），而高密度脂蛋白水平顯著降低（P＜0.01），表明造模成功；黃芩苷高、低劑量組與模型組各項血脂水平比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1　各組小鼠血脂水平比較Table 1 Comparison of mouse blood fat levels in various groups?。ā纒）

表1　各組小鼠血脂水平比較Table 1 Comparison of mouse blood fat levels in various groups?。ā纒）

①P＜0.01，與正常組比較

組別正常組模型組黃芩苷高劑量組黃芩苷低劑量組N8888 ρTC/（mg·dL-1）116.4±18.14 163.18±18.96①163.73±15.89 144.14±15.96 cHDL/（mmol·L-1）8.99±1.62 6.3±1.18①8.35±1.80 7.97±1.30 cLDL/（mmol·L-1）0.22±0.036 0.68±0.119①0.62±0.059 0.65±0.186

2.2各組血清IL-6、TNF-α、內毒素水平比較表2結果顯示：模型組血清IL-6、TNF-α、內毒素水平較正常組均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芩苷高劑量組血清IL-6、TNF-α、內毒素水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），黃芩苷低劑量組內毒素水平顯著降低（P＜0.01）。

表2　各組小鼠血清IL-6、TNF-α、內毒素水平比較Table 2 Effect of baicalin on serum IL-6，TNF-α and endotoxin in various groups

2.3測序結果

2.3.1菌群多樣性分析表3結果顯示：OTUs數目的變化中，模型組較正常組顯著升高，黃芩苷高劑量組較模型組顯著降低（均P＜0.05）。Shannon指數主要衡量群落的多樣性，模型組群落多樣性較正常組顯著降低，黃芩苷低劑量組較模型組顯著升高（均P＜0.05）。ACE與Chao1指數是對菌群物種的總數評估，數據表明模型組較正常組的菌群物種總數大，2個用藥組與模型組無明顯差異。Coverage指數指各樣品文庫的覆蓋率，正常組、模型組、黃芩苷高劑量組數值均在0.9以上，黃芩苷低劑量組數值稍低，說明樣本序列中未被測出的概率較低。β分析得到UniFrac距離如圖1，樣本間相距越遠則菌群差異越大?？梢钥闯?，正常組與模型組菌群組內差異均較小，2組的組間差異在4組中最大；黃芩苷高劑量組與黃芩苷低劑量組菌群組內差異均較大，與其余2組組間比較的差異沒有一定的規律性。

表3　各組小鼠腸道菌群多樣性指數Table 3 The mouse intestinal flora diversity indexes in various groups

2.3.2物種豐度差異門水平的豐度比較見圖2，模型組脫鐵桿菌門（Deferribacteres）和變形桿菌門（Proteobacteria）數目較正常組增多，疣微菌門（Verrucomicrobia）數目較正常組減少。屬水平的豐度比較見圖3，模型組Christensenella、uncultured_ Peptococcaceae、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）數目明顯較正常組升高，而糞球菌屬（Coprococcus）、Akkermansia及uncultured_Lachnospiraceae較正常組減少；黃芩苷高劑量組及黃芩苷低劑量組脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）豐度均較模型組降低。統計豐度最大的前50個菌屬（豐度排在50后的菌所占數目比例很小，暫忽略不計），各組的革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌之比（p）均數見圖4，結果顯示：模型組陰性菌/陽性菌顯著高于正常組（P＜0.05），黃芩苷低劑量組陰性菌/陽性菌顯著低于模型組（P＜0.05）。

圖1　各樣品UniFrac距離Figure 1 Weighted UniFrac distance of various samples

圖2　各組小鼠腸道菌群門水平豐度比較Figure 2　Comparison of abundance of mice intestinal flora at phylum level in various groups

圖3　各組小鼠腸道菌群屬水平豐度比較Figure 3 Comparison of abundance of mouse intestinal flora at genus level in various groups

圖4　各組小鼠腸道菌群中革蘭氏陰性菌與陽性菌的比例Figure 4　The ratio of gram-negative bacteria to grampositive bacteria of mouse intestinal flora in various groups

3　討論

眾多研究已證實，高脂血癥患者長期體內存在代謝性炎癥，這是由攝入營養物和代謝過剩觸發的一種低程度、慢性的系統性炎癥。長期的高脂飲食會導致腸道上皮細胞損傷、滲透性增加，腸道微生物的結構改變，細菌和（或）細菌內毒素大量進入循環系統，炎癥因子IL-6、TNF-α分泌增加，最終導致代謝性炎癥的發生［1-4］。黃芩苷抗炎效果顯著，王敏等［7］曾發現黃芩苷能降低ApoE基因敲除小鼠血清中TNF-α水平。在本研究中，高脂飲食后的小鼠血清IL-6、TNF-α及內毒素水平顯著升高，經黃芩苷干預后，高劑量組此3項指標顯著降低，低劑量組內毒素水平顯著降低，表明黃芩苷針對C57BL/6J小鼠單純高脂飲食導致的炎癥反應有明顯改善作用。

有研究［8］發現，硫酸鹽還原菌的代謝產物會破壞腸屏障，誘導炎癥的發生。本研究對各組小鼠腸道微生物基因測序發現，與正常組比較，高脂模型小鼠腸道中屬于硫酸鹽還原菌類的uncultured_ Peptococcaceae及脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）增多；同時抗炎細菌［9］Akkermansia減少；而Christensenella、糞球菌屬（Coprococcus）及uncultured_Lachnospiraceae在高脂誘導下的變化尚未見其它文獻報道，具體原因有待進一步研究。此外，本研究發現黃芩苷對高脂飲食后的菌群結構能起到一定調節作用。2種劑量黃芩苷均能降低脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）的數目，并且低劑量黃芩苷能降低革蘭氏陰性菌的比例。Cani等［10］提出高脂飲食引起的內毒素升高，可能與腸道內革蘭陰性菌的增加有關。因此，本課題組推測，黃芩苷能通過調節腸道菌群結構，降低腸道革蘭氏陰性菌與陽性菌之比，減少內毒素入血以及炎性因子的分泌，從而減輕代謝性炎癥。又因為代謝性炎癥的水平受到腸道免疫系統、腸通透性、腸道菌群等多方面因素的影響［1-4］。因此，相對于模型組，低劑量黃芩苷能降低革蘭氏陰性菌與陽性菌的比例，但對于IL-6、TNF-α無明顯調節作用，高劑量黃芩苷不能降低革蘭氏陰性菌比例，而降低了內毒素水平，這些情況可能是由于其他因素的干預所致，具體原因還有待進一步研究。

參考文獻：

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【責任編輯：黃玲】

·中藥質量與控制·

Regulatory Effect of Baicalin on Metaflammation and Intestinal Flora

LIU Siying1，KUANG Zaoyuan2，ZHANG Ren2，XIE Weiqun1，CHEN Jian1
（1.Dept.of Postgraduate Affairs，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；2.College of Fundamental Medical Science，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

Abstract：Objective To observe the regulatory effect of baicalin on metaflammation and intestinal flora of hyperlipidemic mouse model.Methods Thirty-two male C57BL/6J mice were randomly divided into 4 groups，namely normal group，model group，low- and high-dose baicalin groups（25，50 mg·kg-1·d-1）.Mice of normal group were fed with ordinary forage and mice of model group were fed with high-fat forage for 8 weeks.Mice of low- and high-dose group were given gastric gavage of different concentrations of baicalin for 5 weeks after fed with high-fat forage for 3 weeks.Blood lipid，tumor necrosis factor（TNF-α），interleukin 6（IL-6）and endotoxin levels in the serum were determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Gene sequencing of enteric microorganism was conducted by Miseq system.Results The total cholesterol and low-density lipoprotein of model group were significantly higher（P<0.01），high-density lipoprotein was lower（P<0.01），and TNF-α，IL-6 and endotoxin were notably higher（P<0.01）than those of the normal group.Compared with the model group，TNF-α，IL-6 and endotoxin of high -dose baicalin group were decreased（P<0.05 or P<0.01），and endotoxin level of low -dose baicalin group was also decreased（P<0.01）.Bioinformatics analysis results indicated that the abundance of Deferribacteres and Proteobacteria of model group was significantly higher at phylum level，while the abundance of Verrucomicrobia was significantly lower than that of the normal group.At Genus level，the abundance of Christensenella，uncultured_Peptococcaceae and Desulfovibrio of the model group was significantly higher，while the abundance of Coprococcus，Akkermansia and uncultured_Lachnospiraceae was significantly lower than that of the normal group.The abundance of Desulfovibrio of both low- and high-dose baicalin groups was lower than that of the model group.The ratio of gram-negative bacterium to gram-positive bacterium of the model group was increased as compared with the normal group（P＜0.05），while that of low-dose baicalin group was decreased significantly compared with the model group（P＜0.05）.Conclusion Baicalin has therapeutic effect on metaflammation caused by high fat diet，and its mechanism is probably related with the regulatory effect of intestinal flora.

Key words：baicalin；metaflammation；intestinal flora；gram-negative bacterium

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3213（2016）03 - 0372 - 05

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．021

收稿日期：2016-01-30

作者簡介：劉思穎（1990-），女，碩士研究生；E-mail：xiaoying106@foxmail.com

通訊作者：鄺棗園，女，教授；E-mail：zyhuang@gzucm.edu.cn

基金項目：廣州中醫藥大學中醫基礎理論重點學科資助項目