補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷大鼠GSK3β mRNA的影響

賴日明，朱原，鄭麗嫻，張繼平

（1.廣州市增城區中醫院，廣東廣州　510000；2.南方醫科大學中醫藥學院，廣東廣州　510515；3.南方醫科大學附屬佛山醫院，廣東佛山　528000）

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補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷大鼠GSK3β mRNA的影響

賴日明1，朱原2，鄭麗嫻2，張繼平3

（1.廣州市增城區中醫院，廣東廣州510000；2.南方醫科大學中醫藥學院，廣東廣州510515；3.南方醫科大學附屬佛山醫院，廣東佛山528000）

摘要：【目的】探討補陽還五湯對腦缺血再灌注大鼠糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）mRNA表達與CD63的影響。【方法】將SPF級雄性SD大鼠60只隨機分為假手術組，模型組，氫氯吡格雷組，補陽還五湯高、低劑量組，每組12只。氫氯吡格雷組灌胃給予氫氯吡格雷水溶液6.8 mg·kg-1·d-1，補陽還五湯高、低劑量組分別給予補陽還五湯水溶液26、6.5 g·kg-1·d-1，其余各組給予生理鹽水；連續給藥14 d后，采用右側大腦中動脈線栓法復制大鼠急性局灶性腦缺血再灌注模型；測定各組大鼠血漿CD63含量與海馬組織GSK3β mRNA表達情況。【結果】與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死體積顯著增加（P< 0.05），與模型組比較，補陽還五湯組與氫氯吡格雷組均能顯著減少腦梗死體積（P<0.05）；與假手術組比較，模型組海馬組織GSK3β mRNA表達與血漿中CD63表達均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，補陽還五湯高、低劑量組與氫氯吡格雷組均能顯著抑制海馬組織GSK3β mRNA表達與血漿中CD63表達（P＜0.05），而補陽還五湯高劑量組抑制作用更明顯。【結論】補陽還五湯對腦缺血再灌注大鼠的保護作用可能與下調GSK3β mRNA過表達及抑制CD63表達有關。

關鍵詞：補陽還五湯/藥理學；腦缺血/中藥療法；基因表達調控；血小板活化；GSK3β mRNA；CD63；疾病模型，動物；大鼠

糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）是一種廣泛存在于中樞神經系統的絲/蘇氨酸磷酸激酶，在細胞增殖分化、凋亡、炎癥及血小板活化過程中具有重要作用［1］。有研究［4-6］證實，GSK3β在缺血性腦血管疾病、血小板活化進程中亦具有重要作用［2-3］。本課題組前期研究發現，補陽還五湯具有抗血小板與抗腦缺血等多重作用。本研究通過復制急性局灶性腦缺血模型，在檢測大鼠海馬組織中GSK3β mRNA表達的同時，測定大鼠血漿中血小板活化特異性指標CD63含量的變化，觀察補陽還五湯預處理對腦梗死體積、GSK3β mRNA及CD63的影響，探討補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷的保護作用與磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路及血小板活化的關系，現報道如下。

1　材料與方法

1.1動物SPF級雄性SD大鼠60只，體質量250～300 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（粵）2013-0002；動物實驗設施由廣東藥學院實驗動物中心提供，動物實驗設施合格證號為：SYXK（粵）2012-0125。

1.2藥物與制劑補陽還五湯顆粒劑水溶液按照《醫林改錯》所載的藥味用量進行制備。處方為：生黃芪120 g，當歸尾6 g，赤芍4.5 g，地龍、桃仁、紅花、川芎各3 g（黃芪顆粒劑，批號：311001T；當歸顆粒劑，批號：1307117；赤芍顆粒劑，批號：309081T；地龍顆粒劑，批號：1308206；川芎顆粒劑，批號：1308137；桃仁顆粒劑，批號：309127T；紅花顆粒劑，批號：1307190），取相當于飲片等量的各味藥顆粒劑（由廣東一方制藥有限公司提供）混合后，用100℃蒸餾水配制成補陽還五湯水溶液置于4℃冰箱冷藏備用，用前混勻；硫酸氫氯吡格雷片（賽諾菲制藥有限公司，批號：2A782）。

1.3儀器與試劑LAUDA Aqualine恒溫水浴箱（德國Lauda公司）；ABI 7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；Hema9600型基因擴增儀（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；1524R型低溫冷凍離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；JS-power300電泳儀與培清JS-780全自動凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）；K2800紫外核酸分析儀（北京凱奧科技有限公司）；Trizol（美國Invitrogen公司，批號：10296 -010）；三甲基十六烷基溴化銨（CTAB）（美國BBI公司，批號：CB0108）；焦碳酸二乙酯（DEPC）（美國Sigma公司，批號：472565）；瓊脂糖（美國Hydragene公司，批號：R9012TAB）；CD63試劑盒（華美生物公司，批號：CSB -E14117r）；SYBRPremix Ex TaqTM日本TAKARA公司，批號：DRR420A），Reverse Transcriptase莫洛尼氏鼠白血病毒（M-MLV）試劑盒（日本TAKARA公司，批號：D2639A）；其余所需試劑由廣州化學制劑總廠提供。

1.4動物分組使用隨機數字表法將大鼠隨機分成5組，每組12只。即假手術組，模型組（均生理鹽水灌胃），氫氯吡格雷組（劑量為6.8 mg·kg-1·d-1），補陽還五湯高劑量組、低劑量組（中藥高、低劑量組；劑量分別為26，6.5 g·kg-1·d-1），以上各組所用劑量均參照課題組前期實驗［4］，即參照動物與人體等效換算標準換算；適應性飼養1周后，再給予相應的藥物（即高劑量組以2.6 g/mL，低劑量以0.65 g/mL補陽還五湯水溶液灌胃，氫氯吡格雷組以0.68 mg/mL氫氯吡格雷水溶液灌胃，其他組按100 g/mL生理鹽水灌胃給藥），每天2次，連續2周。

1.5局灶性腦缺血再灌注模型制作大鼠造模參照Longa［7］報道的方法，采用大鼠右側大腦中動脈線栓法（MCAO）復制局灶性腦缺血模型。大鼠以100 mg/L水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于手術操作臺上，消毒后其余步驟參照文獻［8］進行。假性手術組用僅作皮膚切開和血管剝離，不做栓線處理，其余操作同其他組。

1.6觀察指標

1.6.1紅四氮唑（TTC）染色測腦梗死體積每組取4只大鼠，以100 mg/L水合氯醛麻醉后，斷頭取大腦，置于-20℃冷凍20 min后，將腦組織切成2 mm薄的腦片放入20 g/L TTC溶液，37℃水浴鍋溫孵30 min后放入體積分數10%甲醛溶液，15 min后取出腦組織；數碼相機對腦片進行照相后，采用Image-Pro軟件計算腦梗死體積（即梗死面積乘以腦片厚度）。

1.6.2酶聯免疫吸附法檢測血漿CD63含量眼球摘除取血約2 mL置于真空肝素鈉抗凝管中，4℃、3 000 r/min，離心30 min，吸取血漿，放置于-20℃冰箱，備測。采用酶聯免疫定量檢測技術檢測大鼠血漿CD63的含量；操作過程均嚴格按照試劑說明書進行。

1.6.3實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）測定海馬組織GSK3β mRNA表達大鼠經100 mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg），生理鹽水灌洗，以40 g/L多聚甲醛固定后迅速取腦組織，分離海馬，用RNA later溶液預處理海馬組織。Trizol法進行總RNA提取海馬組織總RNA，引物設計與合成由廣州貝奧吉因生物科技有限公司完成，GSK3β上游引物序列：5’-GGACAGTGGTGTGGAT CAGT-3’，GSK3β下游引物序列：5’-CCGAAAGA CCTTCGTCCAA-3’；GADPH內參上游引物序列：5’-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3’；GADPH內參下游引物序列：5’-TGATGGCAACAA TGTCCACT-3’。使用RNase-free的DNaseⅠ配置反應液，37℃消化30 min，65℃滅活10 min RNA去除基因組，檢測純度提示：28S、18S電泳條帶邊緣清晰，5S條帶邊緣欠清晰，28S與18S條帶比值介于1.8～2.0之間，說明RNA未降解（見圖1）。反轉錄：在PCR管中加入模板RNA、引物混合物，70℃保溫10 min后迅速在冰上冷卻2 min，按說明書在該管中加入相應試劑后42℃保溫60 min；72℃保溫15 min；-20℃保存備用。定量：cDNA稀釋3倍，使用7500 software 95℃、30 s；95℃、3 s，60℃、34 s收集熒光信號，45個循環；反應結束后，確認Real-time PCR的擴增曲線和熔解曲線（見圖2、圖3），由電腦自動分析并計算出反應體系中待測樣本cDNA達到設定閾值的循環數（cycle count，Ct）。實驗中各個樣本均做2個復孔。以假手術組做對照，使用2-△△Ct值計算mRNA相對表達情況。

圖1　RNA電泳圖Figure 1 RNA electrophoresis results

圖2　PCR擴增曲線Figure 2 Amplification plot of GSK3β and GADPH

1.7統計方法采用SPSS 19.0統計軟件進行數據的統計分析。結果以均數±標準差（±s）表示，計量資料比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-T檢驗；等級資料比較采用Kruskal-Wallis檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

圖3　PCR熔解曲線Figure 3 Melting curve of GSK3β and GADPH

2　結果

2.1各組對腦梗死體積的影響表1結果顯示：模型組大鼠腦梗死體積較假手術組顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組與氫氯吡格雷組均能顯著減少腦梗死體積（P＜0.05），其中以中藥高劑量組效果更好。

2.2各組對血漿CD63含量的影響表1結果顯示：與假手術組比較，模型組血漿中CD63表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組與氫氯吡格雷組均能顯著抑制血漿中CD63表達（P＜0.05），表明補陽還五湯能顯著抑制血小板活化，其效果與氫氯吡格雷比較無顯著性差異。

表1　各組對腦梗死體積、CD63的影響Table 1 Comparison of infarction volume and CD63 expression in various groups　（±s）

表1　各組對腦梗死體積、CD63的影響Table 1 Comparison of infarction volume and CD63 expression in various groups　（±s）

①P<0.05，與假手術組比較；②P<0.05，與模型組比較

組別假手術組模型組氫氯吡格雷組中藥低劑量組中藥高劑量組N 12 12 12 12 12 V腦梗死/mm30 258.96±14.80①184.97±10.50②214.49±9.86②173.93±15.81②ρCD63/（ng·mL-1）0.736±0.197 1.448±0.752①0.821±0.151②1.038±0.156②0.916±0.123②

2.3各組對海馬組織中GSK3β mRNA表達的影響表2結果顯示：模型組GSK3β mRNA表達較假手術組顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，中藥組與氫氯吡格雷組均能顯著下調GSK3β mRNA的病理性過表達（P＜0.05），其中以中藥高劑量組調節作用明顯。

表2　各組對海馬組織中GSK3β mRNA表達的影響Table 2 Comparison of GSK3β mRNA expression in various groups　（±s，n2-△△Ct）

表2　各組對海馬組織中GSK3β mRNA表達的影響Table 2 Comparison of GSK3β mRNA expression in various groups　（±s，n2-△△Ct）

①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術組模型組氫氯吡格雷組中藥低劑量組中藥高劑量組N 12 12 12 12 12 GSK3β mRNA 1.027±0.286 6.689±1.113①3.746±0.599②3.378±0.629②1.810±0.457②

3　討論

補陽還五湯出自《醫林改錯》，在血栓性疾病防治中應用廣泛。前期研究［4-6］發現：補陽還五湯具有改善血液流變、抗血栓、抗腦缺血及再灌注損傷等作用，并認為其機制可能與調節蛋白激酶B （Akt）信號通路有關；此外，本課題組研究還發現補陽還五湯預處理能顯著改善大鼠神經功能評分，并下調人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN基因）過表達及抑制CD62P的表達，認為補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與下調PTEN基因過表達與抑制CD62P表達有關［9］；而Chen［10］關于補陽還五湯對腦缺血小鼠的多重蛋白組學作用的分析發現，補陽還五湯能抑制GSK與Tau蛋白活性，但其對GSK3β的影響仍待進一步闡明。GSK3β是一種絲/蘇氨酸磷酸激酶，不僅可通過調節Akt信號細胞凋亡，還可通過調節核因子-κB（NF-κB）、toll樣受體（TLR）參與炎癥反應［1，11］；本研究結果顯示：補陽還五湯能下調海馬組織中GSK3β mRNA的病理性過表達，認為其可能通過下調GSK3β表達干預不同信號通路進而起到抗凋亡、抗炎、抗腦缺血的作用。

此外，GSK3β在血小板活化進程中亦有重要作用，多項研究表明：GSK3β可調節血小板活化進程［11-13］。血小板活化是復雜的過程，血小板的活化除了參與溶栓與凝血的正常生理功能外，還可能與腫瘤血管新生、疼痛等進程有關，研究認為血小板可通過CD62P等血小板膜糖蛋白與白細胞反應參與炎癥反應進程［14］。此外，CD62P、CD63在腦缺血疾病進展中亦具有一定作用［15-16］。綜上所述，GSK3β在血小板活化、細胞凋亡、抗炎、抗腦缺血作用中有重要作用，其可通過干預不同信號通路發揮作用，而CD63作為血小板膜糖蛋白，在血小板活化及腦缺血中亦具有重要意義［10-15］。因此，本研究在前期研究基礎上檢測腦梗死體積、GSK3β mRNA及CD63表達情況，結果提示補陽還五湯能顯著減少腦梗死體積，其機制可能與抑制GSK3β mRNA及CD63表達有關。此外，本研究發現補陽還五湯能下調過表達的GSK3β基因和抑制CD63分子的表達，與本課題組前期研究補陽還五湯具有抗血小板作用并可能通過干預Akt信號通路發揮抗腦缺血再灌注損傷的作用相吻合［4-5］；與補陽還五湯下調PTEN基因過表達與抑制CD62P表達的結果亦相吻合；雖然本課題組發現補陽還五湯能通過調節PI3K/AKT信號通路發揮神經保護作用；但PI3K/Akt作為體內重要的通路之一，亦可能通過Akt下游信號干預NF-κB炎性信號通路發揮作用；因此，其神經保護作用是否仍與調節NF-κB信號通路干預炎癥通路，減輕腦細胞炎性損害有關，仍待進一步研究。未來將通過Western-blot進一步觀察補陽還五湯對GSK3β及其他相關蛋白的表達以進一步驗證本研究的結論。此外，補陽還五湯能抑制CD63分子表達而抑制血小板活化，與目前抑制GSK3β可促進血小板活化的結果有一定差異，其可能與補陽還五湯的多種成分有關，提示補陽還五湯可能通過多靶點調控實現其抗栓、抗腦缺血的作用；但補陽還五湯同時抑制血小板活化與下調GSK3β mRNA表達的確切原因仍待進一步探討。

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【責任編輯：黃玲】

Effect of Buyang Huanwu Decoction on Glycogen Synthase Kinase 3β mRNA Expression in Cerebral Ischemia-reperfusion Injury Rat Model

LAI Riming1，ZHU Yuan2，ZHENG Lixian2，ZHANG Jiping3
（1.Zengcheng District Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510000 Guangdong，China；
2.College of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510515 Guangdong，China；
3.Foshan Hospital Affiliated to Southern Medical University，Foshan 528000 Guangdong，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of Buyang Huanwu Decoction（BHD）on the expression of glycogen synthase kinase 3β（GSK3β）mRNA and CD63 in cerebral ischemia-reperfusion injury rat model.Methods Sixty adult male Sprague-Dawley rats at specific-pathogen free level were evenly randomized into 5 groups，shamoperation group，model group，clopidogrel group，high- and low-dose BHD groups.Clopidogrel group was intragastrically administrated with 6.8 mg·kg-1·d-1of clopidogrel，high- and low-dose BHD groups were given intragastric administration with 26，6.5 g·kg-1·d-1of BHD respectively.The other two groups were given normal saline.After pre-treatment for 14 days，transient focal cerebral ischemia-reperfusion injury model was established by right middle cerebral artery occlusion with thread.The plasma content of CD63 and the mRNA expression of GSK3β in hippocampus were determined.Results The cerebral infarction volume of model group was increased（P<0.05 compared with sham operation group），while was reduced by BHD and clopidogrel（P< 0.05）.The expression levels of CD63 and GSK3β mRNA in model group were enhanced（P<0.05 compared with sham operation group），while were decreased in high-，low-dose BHD groups and clopidogrel group，particularly in high-dose BHD group.Conclusion The protective effect of BHD on acute cerebral ischemiareperfusion model is related with the down-regulation of GSK3β mRNA overexpression and with the inhibition of CD63 expression.

Key words：Buyang Huanwu Decoction/pharmacology，cerebral ischemia/TCD therapy；gene expression regulation；platelet activation；GSK3β mRNA；CD63；disease models，animal；Rats

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3213（2016）03 - 0362 - 05

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．019

收稿日期：2015-11-10

作者簡介：賴日明（1963-），男，副主任中藥師；E-mail：3355089934@qq.com

通訊作者：張繼平（1964-），男，碩士研究生導師，研究員，主任中藥師；E-mail：fszjping@163.com

基金項目：廣東省自然科學基金項目（編號：S2013010012284）；廣東省中醫藥局建設中醫藥強省資助課題（編號：20132029）